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Estudio de la Regulación Epigenética de la Vía Wnt por Metilación Aberrante

de sus Genes Represores en la Leucemia Mieloblástica Aguda

Ana Belén Valencia MartínezServicio de Hematología

Hospital Universitario La Fe

Valencia, 28 Septiembre 2010

IntroducciónLeucemia Mieloide Aguda

La leucemia mieloide aguda (LMA) es una enfermedad

neoplásica en la que se produce una proliferación anómala

de células inmaduras (blastos) de estirpe mieloide.

Las células blásticas proceden de un único progenitor

hematopoyético defectuoso que presenta un bloqueo en el

proceso normal de maduración así como un aumento de su

capacidad de proliferación.

Definición

Progenitores mieloidesCMH

Eritrocitos

Plaquetas

Granulocitos

Macrófagos

Mutación Mutación Expansión clonal

Hematopoyesis normal

Leucemia Mieloide Aguda

Clasificación OMS 2008 LMA con anomalías genéticas recurrentes t(8;21)(q22;q22)

inv(16)(p13q22) o t(16;16)(p13;q22)

t(15;17)(q22;q12)

t(9;11)(p22;q23)

t(6;9)(p23;q34)

inv(3)(q21q26) o t(3;3)(q21;26)

t(1;22)(p13;q13)

LMA con mutaciones génicas específicas

LMA con displasia multilineal Con síndrome mielodisplásico previo

Sin síndrome mielodisplásico previo

Neoplasias mieloides relacionados con la terapia Agentes alquilantes / Radiaciones ionizantes

Inhibidores de la topoisomerasa II

Otras LMA LMA mínimamente diferenciada

LMA sin maduración

LMA con maduración

Leucemia aguda mielomonocítica

Leucemia aguda monoblástica o monocítica

Leucemia aguda eritroide

Leucemia aguda megacarioblástica

Leucemia aguda basofílica

Panmielosis aguda con mielofibrosis

Sarcoma mieloide

Favorable t(8;21); inv(16), t(15;17)

Intermedio Normal, +8, +21, +22, abn(11q23), del(9q), otras

Desfavorable -5/del(5q), -7/del(7q), abn(3q), 20q, 21q, 17p, t(6;9), t(9;22),

cariotipos complejos con 3(5) anomalías

RC (%) RR (%) SG (%)

84 - 91 21 - 35 55 - 65

76 - 86 51 - 67 24 - 41

63 - 22 63 - 22

Extraído de Grimwade et al. Blood 1998

40 - 50%

Citogenética

Alteraciones moleculares

Gen Alteración Pronóstico

FLT3 Duplicaciones en tándem Adverso

NPM1 Mutación Favorable

CEBPA Mutación Favorable

MLL Duplicaciones en tándem Adverso

EVI1 Sobreexpresión Adverso

BAALC Sobreexpresión Adverso

WT1 Sobreexpresión Adverso

ERG Sobreexpresión Adverso

MN1 Sobreexpresión Adverso

ABCG2 Sobreexpresión Adverso

citosina 5-metilcitosina

DNMTCH3

• En el inicio y la progresión del cáncer intervienen tanto

alteraciones genéticas como epigenéticas.

• Asociadas a silenciamiento génico.

• Las alteraciones epigenéticas son reversibles.

S-adenosil-methionine

IntroducciónMetilación del ADN

• Los dinucleótidos CpG se agrupan en las regiones

promotoras de algunos genes (islas CpG).

• Islas CpG no metiladas en regiones promotoras de

algunos genes.

Exón 1 Exón 2 Exón 3

Región promotora

Célula tumoral

Célula normal

AngiogénesisTransd. señalAdhesiónApoptosisReparaciónCiclo celular

p15, p16, p14, p73, p21, p57,

hMLH1hMLH2MGMTBRCA1

DAPKTMS1APAFCasp8

E-CADTIMP3

MASPINFAT

APC, PTENER, SOCS1

RASSF1HIC1

Diferenciación

Apoptosis

Proliferación

Inestabilidad genómica

Genes hipermetilados en cáncer

Azacitidina

Decitabina

Agentes hipometilantes

ACGTCACGA

AAzGTCAAzGA

CH3 CH3

Vías de señalización

IntroducciónLa vía de señalización Wnt

JAK/STAT

PI3K/AKT

Descripción de la vía Wnt

• Embriones: Desarrollo y diferenciación de tejidos y órganos.

• Adultos: Mecanismos de renovación, diferenciación y

proliferación de las células madre.

• Implicada en distintos tumores.

β-Catenina

β-cateninaLEF

ciclina D1 / c-myc

Groucho

GSK-3β

β-Catenina

ciclina D1 / c-myc

Groucho

Proteosoma

Vía Wnt inactiva

LrpWnt

Vía Wnt activa

Citoplasma Citoplasma

Vía Wnt activaVía Wnt inactiva

GSK-3β

β-Catenina

ciclina D1 / c-myc

Groucho

Proteosoma

Vía Wnt inactiva

LrpWnt

FzFzGSK-3β

β-Catenina

ciclina D1 / c-myc

Groucho

Proteosoma

GSK-3β

Citoplasma Citoplasma

β-Catenina

β-cateninaLEF

Groucho

GSK-3β

LrpWnt

FzCáncer de colon

Carcinomas hepatocelulares

Cáncer de colonMelanomas

Leucemias

Cáncer de colonNeoplasias hematológicas

Desregulación de la vía Wnt

Hypothesis

Alterations of different components of the Wnt pathway have

been found in some hematological malignances providing

evidence for the involvement of the Wnt pathway in

leukemogenesis.

We hypothesize that the functional loss of Wnt antagonists

by promoter hypermethylation is a possible mechanism

contributing to activation of the Wnt pathway in AML and that

this loss may be involved in the pathogenesis and prognosis

of this disease.

Objectives

1. To study the methylation status of the Wnt antagonists: sFRP1,

sFRP2, sFRP4, sFRP5, DKK1 and DKK3 in cell lines of

myeloid lineage as well as in a large series of 184 patients

diagnosed with de novo non-M3 AML.

3. To demonstrate the association between aberrant methylation

of Wnt antagonists and activation of the Wnt pathway in AML,

analyzing the expression of Wnt downstream genes (cyclin D1,

TCF and LEF) and the location of β-catenin using cell cultures

treated with DAC.

2. To evaluate the impact of aberrant methylation of Wnt

antagonists in gene expression using the hypomethylating

agent decitabine (DAC).

4. To analyse the association of any individual gene and the

methylation profile (group A: patients with 0-1 methylated

genes; group B: patients with 2-6 methylated genes) with the

clinical and biological characteristics of the AML patients.

Objectives

5. To evaluate the prognostic impact of the aberrant methylation

of Wnt antagonists on the outcome of the AML patients.

Líneas celulares

Metodología Líneas celulares y pacientes

• Kasumi-1

• KG-1a

• HL-60

• THP-1

Pacientes

• 184 pacientes con LMA

• 110 hombres, 74 mujeres

• Mediana edad: 60 años

• Citogenética:

• FLT3-ITD (n = 159): 31

• NPM1 mutado (n = 105): 27

Favorable = 15

Intermedio = 111

Adverso = 38

Objectives

treated with DAC.

Métodos Estudio del estado de metilación

PCR específica de metilación

CpGBisulfito sódico

MSPCebadores M Cebadores U

P15 - case P15 + case P15 - controlP15 - case P15 + case P15 - control P15 - case P15 + case P15 - controlP15 - case P15 + case P15 - control

M U M U

Resultados Estudio del estado de metilación

Líneas celulares

Metilación genes antagonistas Wnt

Pacientes, n = 184

Genes n Frecuencia (%)

sFRP1 75 41

DKK1 58 32

sFRP2 56 31

sFRP5 40 22

DKK3 27 16

sFRP4 7 4

Grupo A (0-1 genes metilados): 57%

Grupo B (2-6 genes metilados): 43%

Objectives

treated with DAC.

Métodos Reactivación de la expresión con DAC

Tratamientos con DAC

Día 0

Día 4

Kasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

Extracción ARN

Control

RNA RNA

DAC 2µM

RNAKasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

Kasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

Kasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

Métodos Reactivación de la expresión con DAC

Tratamientos con DAC

Día 0

Día 4

Kasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

Extracción ARN

Control

RNA RNA

DAC 2µM

RNAKasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

Kasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

Kasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

RNA cDNA

Genes antagonistas

Resultados Reactivación de la expresión con DAC

DAC 2µMDía 4

Ratio Normalizado de Expresión %

Control

Los in

tervalo

uestran un lC

al 95,0%

Las barras m

uestran M

Control

Los in

tervalo

uestran un lC

al 95,0%

Las barras m

uestran M

DAC 2µM

Expresión genes antagonistas Wnt

Control

1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,000,00

sFRP1 sFRP2 sFRP4 sFRP5 DKK1 DKK3

1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,000,00

100,00

%Control

Los intervalos muestran un lC de la media al 95,0%

Las barras muestran Medias

1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,000,00

sFRP1 sFRP2 sFRP4 sFRP5 DKK1 DKK3

%Kasumi-1 KG-1a

HL-60 TPH-1

sFRP1 sFRP2 sFRP4 sFRP5 DKK1 DKK3 sFRP1 sFRP2 sFRP4 sFRP5 DKK1 DKK3

Objectives

treated with DAC.

Resultados Activación aberrante de la vía Wnt

DAC 2µMDía 4

Control

Los in

tervalo

uestran un lC

al 95,0%

Las barras m

uestran M

Control

Los in

tervalo

uestran un lC

al 95,0%

Las barras m

uestran M

DAC 2µM

1,00 2,00 3,000,00

12,00R

ciclina D1 TCF LEF

% Kasumi-1 KG-1a

HL-60 TPH-1

ciclina D1 TCF LEF

ciclina D1 TCF LEF ciclina D1 TCF LEF

Expresión genes activadores Wnt

Métodos Activación aberrante de la vía Wnt

Día 0Kasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

Control

Kasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

Control

Proteínas

Kasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

DAC 2µM

Kasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

DAC 2µM

ProteínasDía 4

Localización β-catenina

Métodos Activación aberrante de la vía Wnt

Western blot

Extracción de proteínas

Fracción CITOPLASMÁTICA Fracción NUCLEAR

β-cateninaTOTALβ-tubulina

β-cateninaTOTAL

Lamin A

Localización β-catenina

CITOPLASMA NUCLEO

ß-catenina ß-catenina

ß-tubulina Lamin-A

-DAC +DAC -DAC +DAC

X LMA+ DAC

GSK-3β

β-catenina

β-cateninaLEF

ciclina D1

GSK-3β

β-catenina

ciclina D1

Groucho

X LMA+ DAC

GSK-3β

β-catenina

β-cateninaLEF

ciclina D1

GSK-3β

β-catenina

ciclina D1

Groucho

XProteosoma

Expresión genes activadores Wnt

Pacientes

MetiladoNo Metilado

ciclina-D1

MetiladoNo Metilado

TCF LEF

Grupo A Grupo B Grupo A Grupo B Grupo A Grupo B

P = 0,045 P = 0,023 P = 0,021

Objectives

Resultados Asociación con características clínicas

Variable sFRP1 sFRP2 sFRP4 sFRP5 DKK1 DKK3 Pérfil

Edad n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

Sexo n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

Leucocitos n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

Hemoglobina n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

Plaquetas n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

Citogenética n.s n.s n.s 0,015 n.s n.s n.s

FLT3-ITD n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

NPM1 n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

No metilado Metilado

n(%) n(%) P

Citogenética

Favorable 11 (9) 4 (11)

Intermedio 91 (73) 18 (49) 0,015

Adverso 23 (18) 15 (40)

Características clínico-biológicas

Respuesta a la inducción

Remisión completa

Resistencia

Muerte

Resultados Asociación con características clínicas

No metilado Metilado

n(%) n(%) P

Remisión completa

Resistencia

Muerte

76 (62)

21 (17)

25 (21)

17 (49)

14 (40)

4 (11)

Objectives

n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

Sexo n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

Leucocitos n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

Hemoglobina n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

Plaquetas n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

Citogenética n.s n.s n.s 0,015 n.s n.s n.s

FLT3-ITD n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

NPM1 n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

ResultadosAnálisis de supervivencia

Serie global

Características SG HR* SLE HR* SLR HR*

Edad < 0,001 2,9 < 0,001 3 0,034 2,6

Leucocitos - - -

Citogenética < 0,001 2,1 0,020 2,5 -

FLT3-ITD 0,002 2,4 0,006 2,6 0,002 3,8

sFRP1 - - -

sFRP5 0,009 2,5

DKK3 - - -

Perfil metilación - - -

* HR: Hazard Ratio

Pacientes ≤ 60 años Grupo citogenético INTERMEDIO

100806040200

120100806040200

P = 0,035 P = 0,046

SLE SLR

P = 0,026

Meses Meses

cum-----

FLT3-ITD Negativo

FLT3-ITD Positivo

Months

120100806040200

Months

120100806040200

Months

120100806040200

P = 0,011 P = 0,020

SLE SLRP = 0,032

Meses Meses

-----Grupo A (0-1 genes metilados)

Grupo B (2-6 genes metilados)

* HR: Hazard Ratio

Características SG HR* SLE HR* SLR HR*

FLT3-ITD 0,006 2,8 - - 0,014 4,1

Perfil metilación - - - - 0,035 3,4

Conclusions

1. Aberrant methylation of the Wnt antagonists is a frequent event

in cell lines of myeloid lineage and in patients diagnosed with

AML. Indeed, we have found concurrent methylation of two or

more genes in 43% of the AML patients.

2. Aberrant promoter methylation results in gene silencing of Wnt

antagonists.

Conclusions

3. Treatment with DAC of the AML cell lines permit the re-

expression of the Wnt antagonists and therefore, induce a

reduction of β-catenin in the nuclear localization and

downregulate the expression of the Wnt downstream genes. In

concordance, the transcription levels of cyclin D1, TCF and LEF

are significantly higher in patients showing more that two Wnt

antagonist methylated genes. This is a strong evidence that

epigenetic regulation contributes at least in part to the activation

of the Wnt pathway in AML.

Conclusions

4. Aberrant methylation of any individual gene and the methylation

profile are not associated with clinical and biological

characteristics of the AML patients in our series. The exception

is for aberrant methylation of sFRP5, which is detected more

frequently in patients with an adverse prognosis. Therefore,

methylation of sFRP5 might provide valuable information about

poor outcome in AML.

5. Methylation of two or more Wnt antagonistic genes is a new

adverse prognostic factor in the subgroup of patients ≤ 60 years

with intermediate-risk cytogenetics.

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