Post on 15-Jan-2016
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ANTIOXIDANTES NATURALES
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Carnosic acid
HOOC
CH3H3C
OH
HOCH3
CH3
CH
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
•Area Industrial 150.000 m2
•Facturación 10 M Eur•Empleados 60
•Dos Plantas de Fabricación•2000 Tm/Año M. Vegetal
•200 Tm de Extractos/Año
Planta de Extracción1999
Nueva Planta de Extracción2009
AreaAlmacenamiento
Disolventes
•4 Doctores•6 Licenciados/Ingenieros
•4 Diplomados
GC HPLC
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
•Acabado en Salas Blancas•8 Salas Clase D
•Garantía Sanitaria
• NUTRAFUR Extractos Botánicos
• NUTRAFUR Bioflavonoides y flavonoides puros
• NUTROX Antioxidantes para Alimentación
• NutraT Ingredientes Funcionales
Gama de Productos
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
1) Objetivo
2) Búsqueda Bibliográfica
3) Selección de las posibles fuentes vegetales
4) Métodos de extracción y purificación
5) Técnicas de identificación y cuantificación
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
1) Objetivo
Obtener una sustancia contenida en una matriz animal ovegetal manteniendo dicha sustancia inalterada
Emplearemos Procesos Físicos que no alteren la estructuramolecular de la sustancia.
Estos procesos estarán basados en dos propiedadesfundamentales: estabilidad y solubilidad de la sustancia endiferentes medios.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Agua Caliente Agua Fría
Procesos Físicos
Solubilidad
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Estabilidad de la sustancia
• A la oxidación
- Ac. Carnósico a Carnosol. Inertización con N2
•A la temperatura
-Deshidratación o hidrólisis
-Cinarina a Ac. clorogénico
• Al pH (solo en medios que contengan agua)
-Oleuropeina a Hidroxitirosol
•A enzimas de la matriz (oxidasas, hidrolasas,etc)
-fenoles a quinonas
•Al disolvente
-Metilaciones, etilaciones o acilaciones
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
1) Objetivo
En algunos casos concretos podemos emplear ProcesosQuímicos, siempre que sean reversibles.
H+
OH-
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
H+
OH-
Flavanona Chalcona
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
• Máxima eficacia energética
• Vapor
• Electricidad
Mínimo Coste
• Máximo aprovechamiento
• Máxima pureza
1) Objetivo
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
2) Búsqueda Bibliográfica
Obtener la máxima información posible en relación a lossiguientes aspectos:
• Posibles fuentes de la sustancia : Plantas, origen, condiciones
• Contenidos: Partes de la planta, variedades
• Métodos de medición
• Estabilidad
• Actividad biológica
• Toxicidad
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
2) Búsqueda Bibliográfica
Fuentes bibliográficas:
•Libros y Monografías
•Farmacopeas
•Artículos científicos
•Internet
•Medline
•Scirus
•Ingenta Connect
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
En base a los siguientes criterios:
• Abundancia
• Accesibilidad
• Localización
• Estacionalidad
• Contenido en activos
• Gasto Disolvente
• Horas de trabajo
• Coste
• Facilidad de manejo
• Densidad aparente
• Humedad
• Estabilidad al almacenamiento
3) Selección de la fuente vegetal
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
UÑA DE GATO
Amazonía Peruana
ROMERO
Pradera Murciana
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Preparación del material vegetal:
1) Extracción en fresco
• Cortado
• Inactivación de enzimas
2) Extracción en Seco
• Secado
• Molienda
4) Métodos de Extracción
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Preparación del material vegetal:
1) Secado
• Natural
• Forzado
• Aire caliente
• Vacío
2) Tamaño de partícula
• Molienda
• Tamizado
4) Métodos de Extracción
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Secado del Material Vegetal
Secado a sol Secado poraire
Secado a vacío
Largo tiempode secado
Corto tiempode secado
Corto tiempode secado
Bajatemperatura
Altatemperatura
Bajatemperatura
Bajo costeEnergético
Alto costeEnergético
Alto costeEnergético
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Preparación del material vegetal:
1) Secado
• Natural
• Forzado
• Aire caliente
• Vacío
2) Tamaño de partícula
• Molienda
• M. Martillos
• M. Cuchillas
• Tamizado
4) Métodos de Extracción
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Molino de Martillos
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Molino de Cuchillas
1) Extracción con disolventes
1) Líquido-líquido
2) Sólido-líquido
3) En fase sólida
4) Extracción con fluidos
supercríticos
2) Métodos de Purificación
1) Precipitación y Filtración
2) Destilación
3) Columna de adsorción
4) Fermentación
Métodos de Extracción
Principales técnicas de separación
3) Cromatografía
En capa fina y en papel
En columna
Cromatografía de líquidos
Cromatografía de gases
Cromatografía con fluidos
supercríticos
Métodos de Extracción
Principales técnicas de separación y análisis
Fundamento: Diferencia de afinidad de una sustancia entre la muestra y el
disolvente extractante.
Objetivos:
1) Separación de una sustancia de la matriz
2) Separación de varias sustancias entre sí (empleando varios disolventes)
Mejor con cromatografía
3) Preconcentración (utilizando un pequeño volumen de disolvente afín a la
sustancia)
Extracción con disolventes
Definición: proceso por el cual se transfiere uno o más solutos de una fase a
otra, generalmente entre dos líquidos o entre un líquido y un sólido.
Elección del disolvente
Propiedades deseadas:
–No tóxico
–Bajo punto de ebullición (50-70 ºC)
–Miscible con agua (sol-liq) oinmiscible (liq-liq)
–Baja tendencia a formar emulsiones
Disolventes comunes:
–Agua
–Metanol CH3OH
–Etanol CH3CH2OH
–Isopropanol CH3CHOHCH3
–Acetona CH3COCH3
–Éter dietílico CH3CH2OCH2CH3
–Cloroformo CHCl3–Benceno C6H6
• Elección del disolvente
• Rendimiento
• Pureza
• Relación entre matriz y disolvente
• Vehiculación
• Relación solubilidad activo vs impurezas
• Coste (gasto en disol. vs aumento rend.)
• Tiempo
• Temperatura
• pH
• Numero de operaciones
Parámetros a optimizar
• Rendimiento. Cantidad de extracto obtenido
por cada 100 g de matriz.
• Pureza. Cantidad de principio(s) activo(s) por
cada 100g de extracto.
• Están relacionados entre sí y limitados por el
contenido en activos de la matriz original.
• Rendimientos por encima del contenido en
activos de la matriz reducen la pureza del
extracto.
Parámetros a optimizar
Rendimiento y Pureza
Elección del disolvente
Experiencia 1. Para la primera experiencia se fijaron las siguientescondiciones: relación sólido líquido 1/10, temperatura 50º C, tiempo deextracción 3 horas. La tabla 1 muestra la cantidad y pureza del extractoobtenido con los distintos disolventes estudiados:
Disolvente gr. de extracto % Pureza
Metanol 98% 15.3 79.6
Etanol 98% 14.2 79.9
Isopropanol 98% 17.5 61.2
Acetona 99% 6.7 58.6
Elección del disolvente
Experiencia 1. Para la primera experiencia se fijaron las siguientescondiciones: relación sólido líquido 1/10, temperatura 50º C, tiempo deextracción 3 horas. La tabla 1 muestra la cantidad y pureza del extractoobtenido con los distintos disolventes estudiados:
Disolvente gr. de extracto % Pureza
Metanol 98% 15.3 79.6
Etanol 98% 14.2 79.9
Isopropanol 98% 17.5 61.2
Acetona 99% 6.7 58.6
Isopropanol da mayor rendimiento pero con una pureza muy baja.10.71 gr de sustancia pura frente a 12.18 gr del metanol 98%.
Elección del disolvente
Experiencia 1. Para la primera experiencia se fijaron las siguientescondiciones: relación sólido líquido 1/10, temperatura 50º C, tiempo deextracción 3 horas. La tabla 1 muestra la cantidad y pureza del extractoobtenido con los distintos disolventes estudiados:
Disolvente gr. de extracto % Pureza
Metanol 98% 15.3 79.6
Etanol 98% 14.2 79.9
Isopropanol 98% 17.5 61.2
Acetona 99% 6.7 58.6
De los resultados anteriores se deduce que los alcoholes más polaresmetanol y etanol obtienen purezas suficientes con buenos rendimientos.
Elección del disolvente
Experiencia 2. Para la siguiente experiencia se mantuvieron lascondiciones y se utilizaron diferentes purezas de metanol y etanol.Los resultados se muestran en la tabla 2:
Disolvente gr. de extracto % Pureza
Metanol 98% 15.3 79.6
Metanol 95% 15.2 80.3
Metanol 90% 14.4 79.3
Etanol 98% 14.2 79.9
Etanol 96% 15.8 80.6
Etanol 90% 13.7 79.8
Elección del disolvente
Experiencia 2. Para la siguiente experiencia se mantuvieron lascondiciones y se utilizaron diferentes purezas de metanol y etanol.Los resultados se muestran en la tabla 2:
De estos resultados se deduce que el mejor solvente de extracción es el etanol96%, tanto por rendimiento como por la pureza del extracto obtenido. A partir deese momento todas las experiencias se realizaron con etanol 96%
Disolvente gr. de extracto % Pureza
Metanol 98% 15.3 79.6
Metanol 95% 15.2 80.3
Metanol 90% 14.4 79.3
Etanol 98% 14.2 79.9
Etanol 96% 15.8 80.6
Etanol 90% 13.7 79.8
• Relación entre matriz y disolvente
• Vehiculación
• Relación solubilidad activo vs impurezas
• Coste (gasto en disol. vs aumento rend.)
• Tiempo
• Temperatura
• pH
• Numero de operaciones
Parámetros a optimizar
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Parámetros a optimizar
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 2 4 6 8 10
Ratio disovente/matriz
Rendimiento
Pureza
Relación disolvente matriz
La pureza puede disminuir a partir de una relación determinada debidoa una mayor solubilidad relativa de alguna de las impurezas.
Experiencia 3. Para la optimización de la relación sólido/solvente serealizaron extracciones con etanol 96% y diferentes relacionessólido/líquido, manteniendo el resto de las condiciones como en laexperiencia 1, 3 hr y 50 ºC.
Hasta una relación sólido/líquido 1/4, el sólido no se puede vehicular con elagitador, por lo que ésta es la menor relación sólido/líquido a ensayar.
Relaciónsólido/solvente
gr. de extracto % Pureza
1:4 12.6 79.1
1:6 14.2 79.9
1:8 15.9 80.2
1:10 15.8 80.6
Experiencia 3. Para la optimización de la relación sólido/solvente serealizaron extracciones con etanol 96% y diferentes relacionessólido/líquido, manteniendo el resto de las condiciones como en laexperiencia 1. Hasta una relación sólido/líquido 1/4, el sólido no sepuede vehicular con el agitador, por lo que ésta es la menor relaciónsólido/líquido a ensayar.
De los resultados se observa que a partir de relaciones 1/8 los resultados sonidénticos. Esto se confirmó analizando el residuo vegetal y comprobando que noquedan prácticamente activos en él. Para las siguientes experiencias se usó larelación 1/8, en función del ahorro de disolvente.
Relaciónsólido/solvente
gr. de extracto % Pureza
1:4 12.6 79.1
1:6 14.2 79.9
1:8 15.9 80.2
1:10 15.8 80.6
• Relación entre matriz y disolvente
• Vehiculación
• Relación solubilidad activo vs impurezas
• Coste (gasto en disol. vs aumento rend.)
• Tiempo
• Temperatura
• pH
• Numero de operaciones
Parámetros a optimizar
Parámetros a optimizar
B
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 2 4 6 8 10
Tiempo
Co
nc
en
tra
cio
n
B
El disolvente se satura de solutos. Incluso en ocasionespuede disminuir la concentración debido a degradacióndel activo. Influyen temperatura, pH y tamaño departícula.
Parámetros a optimizar
El disolvente se satura de solutos. Incluso en ocasionespuede disminuir la concentración debido a degradacióndel activo. Influyen temperatura, pH y tamaño departícula.
Tiempo de Extracción
Experiencia 4. En esta experiencia se estudió el tiempo mínimo deextracción necesario para obtener todos los activos presentes en lamateria prima. Las condiciones experimentales fueron: etanol 96%,relación sólido/líquido 1/8 y temperatura 50º C. Los resultados obtenidospara diversos tiempos de extracción se muestran en la tabla 4:
Los resultados obtenidos no presentan variaciones significativas con el tiempode extracción por lo que se utilizó en lo sucesivo tiempos de extracción de unahora.Mayor aprovechamiento de los equipos industriales.
Tiempo Extracción(hr)
gr. de extracto % Pureza
1 15.3 80.4
2 15.9 80.8
3 15.9 80.2
5 15.6 80.7
• Relación entre matriz y disolvente
• Vehiculación
• Relación solubilidad activo vs impurezas
• Coste (gasto en disol. vs aumento rend.)
• Tiempo
• Temperatura
• pH
• Numero de operaciones
Parámetros a optimizar
Extracción con disolventes
Tª 50 ºC
Tª 25 ºC
El calentamiento suele favorecer la extracción (sól/líq)
Experiencia 5. Por último se optimizó la temperatura de extracciónsobre las condiciones del experimento 4. Los resultados se muestran enla tabla 5:
Los resultados demuestran muy poca diferencia entre 50 y 70 ºC.
TemperaturaExtracción (ºC)
gr. de extracto % Pureza
20 11.9 81.1
30 14.1 80.8
40 15.1 80.2
50 15.3 80.4
60 15.6 80.6
70 15.5 80.2
Experiencia 5. Por último se optimizó la temperatura de extracciónsobre las condiciones del experimento 4. Los resultados se muestran enla tabla 5:
Se eligió 50º C, para minimizar las perdidas de disolvente por evaporación.Punto ebullición del disolvente en torno a 60 ºC..
TemperaturaExtracción (ºC)
gr. de extracto % Pureza
20 11.9 81.1
30 14.1 80.8
40 15.1 80.2
50 15.3 80.4
60 15.6 80.6
70 15.5 80.2
• Relación entre matriz y disolvente
• Vehiculación
• Relación solubilidad activo vs impurezas
• Coste (gasto en disol. vs aumento rend.)
• Tiempo
• Temperatura
• pH
• Numero de operaciones
Parámetros a optimizar
• Altera la ionización de grupos funcionales
tanto de los principios activos, como de las
impurezas, modificando sus propiedades de
solubilidad.
• Puede hidrolizar azucares y otros grupos
lábiles en la molécula del principio activo,
degradándolo. También pH altos pueden
favorecer la oxidación de grupos fenol.
Parámetros a optimizar
pH
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
H+
OH-
Flavanona Chalcona
• Relación entre matriz y disolvente
• Vehiculación
• Relación solubilidad activo vs impurezas
• Coste (gasto en disol. vs aumento rend.)
• Tiempo
• Temperatura
• pH
• Numero de operaciones
Parámetros a optimizar
Lo ideal es una sola operación. Esto es lo normal cuandose usa un tanque agitado. En sistemas de percolación serequiere un número mayor de operaciones para agotar lamatriz.
extracto = solvente + soluto
Residuo = Material vegetal“empobrecida” en soluto.
Centrífuga o Filtro
MaterialVegetal
Extractor
Disolvente
Solubilización de lasustancia en el
disolvente
Extracción convencional
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Extractor y Centrífuga
DisolventeLimpio
extracto
Mat. Prima
Ext. 1 Ext. 2 Ext. 3
Extracción por percolación
extractoextracto
A Ext 1
A Ext 2
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Percolación
• Material Vegetal estático
• Disolvente circula a través del material
vegetal
• Filtración en el mismo reactor
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Percolación
• Material Vegetal estático
• Disolvente circula a través del material
vegetal
• Filtración en el mismo reactor
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Percolación-Extracción de Café
Ventajas comparativas de la extracciónen tanque y por percolación
Menor Gasto disolventeMenor tiempo de procesoMas selectivoSin caminos
preferenciales
Menor coste de separaciónResiduo con menos
disolventes
Tanque Percolación
SC-CO2
(P, )
producto 1 producto 2 producto 3
extracto
Mat. prima P1, 1 P2, 2 P3, 3
fractionamiento
CO2 gas
Presión: P > P1 > P2 > P3
Densidad: > 1 > 2 > 3
Procesado de sólidos con fluidossupercríticos:percolación
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Extractor Supercrítico en Altex
Granos de café tostados ysecados hasta el 30 – 50% dehumedad.
CO2 Supercrítico es generado atemperatura y presiónde 40 – 80 C y120 – 180 atm respectivamente.
CO2 Supercrítico pasa a través delos granos de café en contracorriente.
CO2 Supercrítico es capaz deextraer las pequeñas moleculas decafeína pero deja otras más grandesresponsabes del aroma y sabor decafé.
CO2 Supercritico como extractante
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Extractor Supercrítico Descafeinado
Ventajas y desventajas de laextracción con SC-CO2
GRASEcológicoNo deja residuosNo es inflamableBarato
Poco util para grandes moleculasNecesidad de Co-solventesInstalación caraMayor gasto energético
Ventajas Desventajas
SECTORES SUSCEPTIBLE DE APLICACIÓN DE ESTA
TECNOLOGÍA:
Los resultados de la investigación tendrían aplicación industrial
en los siguientes sectores:
PRODUCTOS NATURALES:•Aceites esenciales y aromas.•Extracción de pigmentosnaturales.•Extracción de cafeína, nicotina,etc.
NUTRACEÚTICOS:• Extracción del licopeno.• Extracción debetacarotenos.• Extracción debioflavonoides.
FARMACEÚTICO:• Purificación de fármacos.• Separación de isómeros.• Microcristalización.• Presíntesis
ALIMENTACIÓN:• Extracción del lúpulo.• Extracción de colesterol.• Extracción de semillas.• Extracción de ácidosgrasos.
TEXTILES:• Extracción del lanolina.• Impregnación con SFC.• Acabado de fibras textiles.
OTROS:• Limpieza de productoselectrónicos.• Recuperación de Plastificadores.• Medio de reacción.• Nuevos materiales.
Cromatografía y extracción con fluidossupercríticos
Métodos de Purificación
1) Precipitación y Filtración
• pH
• Salting Out
2) Destilación
• Simple
• Fraccionada
3) Adsorción en columna
4) Fermentación
Separaciones por precipitación
R puede ser un ácido o una base (obtención hesperidina) obien una sal neutra soluble en el medio (obtenciónchalconas)
Separaciones por precipitación
R puede ser un ácido o una base (obtención hesperidina) obien una sal neutra soluble en el medio (obtenciónchalconas)
Separaciones por filtración
Medios filtrantes: tela, placa porosa o malla metálica
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Separaciones por filtración
Separaciones por filtración
Filtro de placas
Filtros a Vacío
Filtro de Tambor
Filtros a Vacío
Filtro Nutcha
Separaciones por destilación
DESTILACION
SIMPLE
FRACCIONADA
ARRASTRE
UN COMPONENTEVOLATIL
2 COMPONENTESVOLATILES
LIQUIDOSNO VOLATILES
Separaciones por destilación
CONCENTRACIÓN Y PRECIPITACIÓN
Cromatografía en Capa Fina
Cromatografía en Capa Fina
fracción
Molec. NO INTERACCIÓN RÁPIDAS
* No se unen al ligando de la faseestacionaria.
Molec. INTERACCIÓN LENTAS
* Se unen al ligando de la f. estacionaria.Elución específica.
APLICACIÓNMUESTRA
LAVADO
ELUCIÓNESPECÍFICA
1 2 4 5 6 7 8 93
resp
uest
adeldete
cto
r
PERFIL DE ELUCIÓN
LAVADOELUCIÓN
ESPECÍFICA
molécula
CROMATOGRAFÍADE AFINIDADProducto A
Eluyente
Extracto
Eluyente
Cromatografía en Columna
Cromatografía en Columna
Eliminación Concentración
Cristalización
FiltraciónSecadoCondiciones:
1. Aireación continua
2. Control de pH y temperatura
3. Eliminación CO2 producido
4. Tiempo
Fermentación
Métodos de Purificación
Fermentación
Hesperetina +
Rhamnosa Glucosa
Hesperidina
Métodos de Purificación
Fermentación
Escalado 20 ml 2 lts 300 lts 3000 lts
30000 lts
Fermentación
Fermentación
• Para procesosindustriales, se usanfermentadores de hasta de400.000 litros decapacidad
• Los fermentadores sonconstruidos de aceroinoxidable y tienen unacamisa externa la cualpuede ser esterilizadainicialmente y enfriadadadurante la fermentación.
Fermentación
Métodos de medida
Espectrofotometría UV
• Método inespecífico basado en la medida de la
absorbancia de una solución de concentración
conocida del extracto a una longitud de onda
determinada.
• No es un método adecuado cuando la sustancia a
medir no es prácticamente pura. Ejemplo Extracto
de Cacao.
• Normalmente usa factores de corrección para el
cálculo de la pureza muy afectados por las
condiciones experimentales.
Métodos de medida
Espectrofotometría UV
Métodos de medida
Espectrofotometría UV
• Método inespecífico basado en la medida de la
absorbancia de una solución de concentración
conocida del extracto a una longitud de onda
determinada.
• No es un método adecuado cuando la sustancia a
medir no es prácticamente pura. Ejemplo Extracto
de Cacao.
• Normalmente usa factores de corrección para el
cálculo de la pureza muy afectados por las
condiciones experimentales.
Espectrofotometría UV
Teobromina
Procianidina
Métodos de medida
Espectrofotometría UV
• Método inespecífico basado en la medida de la
absorbancia de una solución de concentración
conocida del extracto a una longitud de onda
determinada.
• No es un método adecuado cuando la sustancia a
medir no es prácticamente pura. Ejemplo Extracto
de Cacao (incluir espectros).
• Normalmente usa factores de corrección para el
cálculo de la pureza muy afectados por las
condiciones experimentales.
Espectrofotometría UV
Técnicas de medición adecuadas:cromatografía HPLC y GC (HPLC-MS y GC-
MS)
Necesitan de:
• Standares adecuados
• Adecuados métodos depreparación de lasmuestras analíticas
• Buena elucidación
• Métodos Repetitivos
• Métodos ValidablesT i m e ( m i n )
0 1 0 2 0 3 0 4 0
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
Ab
sorb
an
ce28
0n
m
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
1
2
34
4
5
6
6
Análisis Cromatográfico
*La cromatografía, permite no sólo separar los componentesde una muestra, sinó tambien su identificación y cuantificación.
Análisis cualitativo
Esta basado en la medida de parámetros cromatográficos( tiempos y volúmenes de retención)
Análisis cuantitativo
Está basado en la medida de alturas u áreas de picoscromatográficos que se relacionan con la concentración.
La columna cromatográfica y la forma con la quese diseña, constituye el corazón de la separación.
El detector situado al final de la columna es elque garantiza la respuesta de los componentesque se separan ( los hay de muy diversos tipos)
Análisis cualitativo cromatográfico
Los parámetros cromatográficos que se utilizan en el análisiscualitativoson dos: tiempo de retención (tR) y volumen de retención (vR)
Procedimiento: ambos parámetros han de ser comparados con los de unasustancia patrón
Inconvenientes: No se tiene siempre certeza de que ambos parámetrossean reproducibles, ni aún manteniendo condiciones de trabajo constantes.Es preferible utilizar valores relativos, en vez de absolutos.
Bajo condiciones de flujode fase móvil Fc constante:
Tiempo de retención
tiempo de retención ajustado = t’r = tr - tm
retención relativa = = t’r2 / t’r1
HPLC
(Detector de índice de refracción)
Detección: Cuando la sustancia a medir no tiene un grupo
cromóforo hay que usar otro tipo de detector como son:
•Índice de refracción
•Electroquímico
•Fluorescencia
•MS
•ELSD
Detectores HPLC
Detección: Cuando la sustancia a medir tiene un grupo
cromóforo:
•Ultravioleta
•Array de Diodos (DAD)
•Fluorescencia
•MS
•ELSD
Detector Ultravioleta
Celda de flujo:0.5 cm de camino ópticoy 10 L de capacidad
Detector Ultravioleta
Es el detector más utilizado, porque muchos solutos absorbendicha radiación y es bastante sensible a ella.
El sistema más simple emplea la emisión a 254 nm de unalámpara de mercurio y detección a una sola longitud de onda.
También se utilizan una lámpara de deuterio y un monocromadorpara mediciones a longitud de onda variable.
El intervalo lineal comprende cinco órdenes de magnitud deconcentración de soluto (ejem 0.001 hasta 10).
Detectores HPLC
Detector Array de DiodosEn el detector de fotodiodostoda las longitudes de onda dela luz pasan a través de lacelda de muestra. Acontinuación cada longitud deonda particular incide en unsensor concreto. Sus ventajasson múltiples: velocidad,sensibilidad, medición enmúltiples longitudes de onda ala vez.
Su desventaja es que laresolución es 1 nm, vs 0.1 nmpara el UV normal.
Detectores HPLC
Detectores: Índice de refracción. Está basado en los cambios de
refracción que el soluto provoca en la fase móvil. Es casi universal,
responde a cualquier soluto.
La sensibilidad es unas mil veces menor que la de un
detector ultravioleta, y no es útil en gradiente.
Detectores HPLC
Detectores: Electroquímico. Está basado en la electrolisis de
los distintos solutos que se eluyen de la columna. El eluido
pasa por un una delgada célula donde hay un electrodo
mantenido a un potencial fijo. Si el potencial es mayor (más
positivo para oxidación, más negativo para reducción) que el
requerido para la electrolisis de la sustancia, una carga
medidle pasa del electrodo a la sustancia (o viceversa). La
corriente resultante es directamente proporcional a la
concentración del soluto que pasa a través de la ceda.
Es bastante selectivo, porque sólo ciertos analitos se oxidan ose reducen con facilidad.
Pueden detectarse por oxidación: fenoles, aminas aromáticas,
peróxidos y mercaptanos. Y por reducción: cetonas, aldehídos
y nitrilos.
Detectores HPLC
Detectores HPLC
Detector Electroquímico
Detectores: Fluorescencia. Este detector solamente puede
detectar compuestos que tengan fluorescencia nativa o
inducida por derivatización. Consiste en un haz de luz de
una determinada longitud de onda que al pasar a través de
la celda de muestra excita los grupos fluorescentes de la
molécula que a su vez emite luz de una longitud de onda
característica del compuesto. El detector debe estar
colocado perpendicular al haz de excitación.
Es muy sensible y se usa mucho en análisis farmacéutico,
análisis clínicos, productos naturales, etc.
Detectores HPLC
Detectores: Masas. El espectrómetro de masas usa la relación masa-
carga (m/z) de moléculas ionizadas. La fase móvil se introduce en una
cámara de vacío, donde se evapora el solvente y los solutos se ionizan
mediante un termo vaporizador-ionizador.
Es aplicable a compuestos termoestables y no volátiles. Se obtienen
espectros de impacto electrónico. Es una técnica muy poderosa que
permite cuantificar, identificar y da información acerca de la estructura
de compuestos desconocidos.
Detectores HPLC
HPLC-MS Schematic
LiquidChromatograph
IonizationSource
IonDetector
IonAccelerating
Region
A B C
A+ B + C +
A+
B+
C+
El detector registra todos los iones según su relaciónm/z (relación masa/carga) y los cuantifica según suabundancia relativa. (como generalmente se forman
iones con una sola carga m/z se trata simplemente de lamasa del Ion).
El ion molecular M+. generalmente no es el más abundante(porque se fragmenta) permite obtener el peso molecular de
la sustancia
Pico base: ion mas abundante del espectro(100 % abundancia relativa)
Los espectros de masa se registran como abundancia relativa vs.relación m/z
Espectro de masa del n-dodecano
Las moléculas se fragmentan por determinadoslugares→ los fragmentos permiten obtener información estructural de un compuesto.
Ejemplo:
Espectro de masa interpretado de 4-metil-3-penten-2-ona
Detectores: Detector de Luz dispersa evaporadora (ELSD). Es undetector universal porque su respuesta no depende de lascaracterísticas ópticas de a muestra. Así, cualquier compuesto novolátil, cromóforo o no cromóforo puede ser detectado. A respuesta estábasada en la masa y en la cantidad de luz dispersada, no habiendodiferencias entre la fase móvil y la muestra. Esto da una más precisamedida de la concentración de la muestra lo que hace que sea idealpara análisis de pureza. El detector ELSD da una línea de base establey es compatible con gradientes. Sin embargo posee algunaslimitaciones ya que la fase móvil debe ser volátil puesto que esta esevaporada. Si no lo es, el excesivo ruido de la línea de base dificulta lamedida. Esto limita el uso de modificadores no volátiles tales comotampones fosfato, ácido fosfórico y reactivos de par iónico.
Detectores HPLC
Otros detectores:
ultravioleta 0.1 - 1 siíndice de refracción 100 - 1000 noelectroquímico 0.01 - 1 nofluorescencia 0.001 - 0.01 siconductividad 0.5 - 1 noespectrofotometría de masa 0.1 - 1 siinfrarrojo de trasformada de Fourier 1000 si
Detector
Límite dedetección
¿Útil congradiente?
Procedimiento para análisis LC/UV/MSy LC/NMR
BombaHPLC
columna HPLC
INJECCION- Extracto- Fracción- Mezcla
LC/MSINTERFACE
Bomba
HPLC
Adición post-
columnade losaditivosLC/MS
Splitting dependientede la interfase LC/MSusada
desecho
ElectrodoLC
UV
MS
NMR
UV
desecho
MS
NMR
espectro
1
2Computercontrol of pump,UV and NMR forstop-flow experiments
Descripción del proceso industrial:
Cromatografía con fluidos supercríticos
Definición: Un cromatograma es el grupo de señales
obtenidas por un detector tras la separación cromatográfica
Características de los cromatogramas
Características de los cromatogramas
Efecto de la composición del disolvente en laResolución
Características de los cromatogramas
Posición del pico Información cualitativa
Área del pico Información cuantitativa
Forma del pico:
- Interesa alto (> sensibilidad) y estrecho (> selectividad)
- Depende de tres efectos:
a) Múltiples caminos: Diferencia de caminos seguidos por cada
molécula en la f.e.
b) Difusión en ambas fases
c) Transferencia de masa entre fase móvil y fase estacionaria.
Fig 5.4
Características de los cromatogramas
Efecto de los múltiples caminos
Eficacia de la separación cromatográfica
Ecuación de van Deemter: H=altura de plato
Múltiplescaminos
uCu
BAH
Difusión
Transferenciade masa
EficaciaH
Resolución de picoscromatográficos
Separaciónideal
Separación buena Separación deficiente