Post on 12-Apr-2017
Dra. Adriana B. Vivas
Departamento de Anatomía Animal Facultad de Agronomía y VeterinariaUniversidad Nacional de Río Cuarto
ARGENTINA.
����54-358-4676210. ���� avivas@ayv.unrc.edu.ar
Institut für Pharmakologieund Toxikologie
IgY – Tecnología
Dra. Adriana Vivas
IgY – Tecnología
IgY-Technology
Huevos
Huevos
Huevos
avivas@ayv.unrc.edu.ar
¿Qué
es
IgY?
IgY-Technology avivas@ayv.unrc.edu.ar
Hieronymus Bosch
IgY-Tecnología
�Bases Biológicas
IgY-Technology
�Historia
�Mantenimiento de gallinas
avivas@ayv.unrc.edu.ar
�Inmunización
�Título de Anticuerpo
�Comparación de IgG e IgY
�Distancias filogenéticas
�Experimentos en UNRC
�Historia
IgY-Technology avivas@ayv.unrc.edu.ar
IgY-Technology avivas@ayv.unrc.edu.ar
Primera Primera
publicaciónpublicación
18931893
IgY-Technology
Experimento de Klemperer (1893)
Inmunizacines repetidas con Tetanus bouillon en cultivo
avivas@ayv.unrc.edu.ar
DespuésDespués de 4 de 4 semanassemanas preparaciónpreparación de un de un extractoextracto de de yemayema de de huevohuevo
1 ml1 ml 0,5 ml0,5 ml 0,25 ml0,25 ml 0,0 ml0,0 ml
Administración al día siguiente de dosis letal de Tetanus bouillon en cultivo
vivosvivos muertosmuertos
IgY-Technology
Experimento de LeClaire et al. (2002)
Staphylococcal Enterotoxin B
IgY 10 mg/kg,
toxin 5 LD50 as
aerosol
InmunizacinesInmunizacines
repetidasrepetidas concon
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Después de 8 semanas preparación de extracto de yema de huevo
IgY 20 min antes desafío con toxina
(5 LD50)
IgY 4 h después desafío de toxina
(5 LD50)
buffer 4 hs
después toxina
buffer 20 min antes
desafio toxina
vivos vivos muertos muertos
aerosol
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��Mantenimiento de los animalesMantenimiento de los animales
IgY-Technology
Batería comercial
Comparación de áreas disponibles para las gallinas
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Equipo de mantenimiento
IgY-Technology
Colores de los huevos
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W. Russell and R. Burch
“The Principles of Humane Experimental Techniqueˮ (1959)
ReemplazarReemplazarReemplazarReemplazar Reducir Reducir Reducir Reducir RefinarRefinarRefinarRefinar
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�Base Biológica
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Mamíferos
Circulación sanguínea
Leche materna
Inmunización
pasiva
IgY-Technology
Transferencia de anticuerpos
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Aves
Circulación sanguíneaInmunización
pasiva
Solo IgYSolo IgY
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Transferencia de IgY desde
sangre a yema
VC1
C2
C3
Conclusión – un Fc intacto y la región HEAL son
requeridas para el transporte de la Ig hacia la yema
Morrison et al. (2001) Mol. Immunol. 38:619-625
429-436
HEAL – His-Glu-Ala-Leu
HEAL es importante para
transporte hacia la yema
Amarillla zona expuesta Amarillla zona expuesta
sobre la superficie de Csobre la superficie de CHH2 2 ––
importante como importante como
reconocimiento del receptor reconocimiento del receptor
Fc-part
C3
C4
IgY-Technology
Transferencia de anticuerpos desde
sangre a yema
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¿Por qué esperar 10 días
después de la 2da inmunización?
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Tecnología Aviar
Viragen has signed a collaborative agreement with the Roslin Institute,
the renowned Scottish birthplace of the world’s most famous sheep,
Dolly. Viragen has obtained a worldwide exclusive license by the
Roslin Institute to their
Avian (bird) technology
to enable Viragen,...., to produce drugs, including monoclonal
antibodies to fight cancer and other life-threatening diseases, inside
the eggs of specially created transgenic chickens.
The development of avian technology promises a much faster, cost-
effective and virtually unlimited production process marked by the
chicken’s prolific egg laying capabilities.
�Immunización
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IgY-Technology
Recomendaciones para
la immunización de Gallinas
Antigen 0,10 – 1,00 mg sometimes 10 µg sufficient
Adjuvant FIA 0,10 – 0,25 ml usually i.m. or s.c.
Specol 0,5 ml s.c.
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PCLS 250 µg preferably s.c.
FCA 0,10 – 0,25 ml only with weak immunogens
Injections
-volume 0,5 ml (-1 ml)
-intervals 4 – 8 weeks
-number 2 (or more if necessary)
-route i.m. or s.c.
IgY-Technology
Cantidad de antígeno y la producción de
anticuerpo
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Development of Ab-titre of chickens after immunisation with
human albumin
200
250
3005 mg
2.5 mg
1 mg
0.5 mgi.v.
An
tib
od
y t
itre
0 10 20 30 40 50 60 70 80 900
50
100
150
i.m.
i.m.
Time after immunisation (days)
An
tib
od
y t
itre
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Preparación del antígenoPreparación del antígeno
IgY-Technology
Inmunización
Clásica
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Clásica
IgY-Technology
Vista Microscópica
Vista
Macroscópica
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Daño tisular por el uso de adyuvante de
Freund‘s completo
Vista Microscópica
Después del tratamiento con y sin FCA
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IgY-Technology
The use of gene-specific IgY antibodies for
drug target discovery
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Gene gun
immunisation
W.-W. Zhang (2003) Drug Discovery Today 8,
364-371
IgY-Technology
Inmunización de
Genes
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Genes
�Desarrollo
de título de
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de título de
Anticuerpos
IgY-Technology
Resultados de inmunizaciones sucesivas
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Conventional keeping (Mouse
IgG1)
0.1
1
10
100
1000
An
tib
od
y-T
itre
(x
1,0
00
)
SPF-keeping (Mouse IgG1)
0.1
1
10
100
1000
An
tib
od
y-T
itre
(x
1,0
00
)
Desarrollo de título de anticuerpo y de concentración proteica de Desarrollo de título de anticuerpo y de concentración proteica de
yema de huevo bajo condiciones convencionales y SPFyema de huevo bajo condiciones convencionales y SPF
Chicken 1, Chicken 2
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0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100.1
Time (d)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100.1
Time (d)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100
2
4
6
8
10
12
14
Time (d)
mg
Pro
tein
/ml
Yolk
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100
2
4
6
8
10
12
14
Time (d)
mg
Pro
tein
/ml
Yolk
IgY-Titre Development
2.0
2.5
3.0Ch80
Ch81
Ex
tin
ctio
n
Ritmo septadiano
IgY-Technology avivas@ayv.unrc.edu.ar
0 10 20 30 40 50 60 70 800.0
0.5
1.0
1.5
Days after first immunisation
Ex
tin
ctio
n
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Titulo de anticuerpo,
Avidez en aves y conejos
IgY-Technology
Tres modos diferentes
de reacción de Ac
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IgY-Technology
Inmunización finalInmunización final
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�Comparación
de IgG e IgY
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de IgG e IgY
Ac
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IgY-Technology
Muestreo invasivo no-invasivo
Cantidad de Ac 200 mg/40 ml
sangre
50-100 mg/huevo
5-7 huevos/semana
Características del IgG versus IgY
IgG Mamífera IgY Aviar
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Cantidad de Ac
/mes
200 mg appr. 1.000 – 2.800
mg
Interferencia con
IgG (Factores
reumatoideos
sí no
Interferencia con
Complemento
sí no
Protein A/G sí no
Hetero-Aglutininas sí no
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IgY-Technology
Ensayo para proteína C reactiva (CRP)
Ensayo
Oveja
Ensayo Ave Factor reumatoideo
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Ensayo
Oveja
Falso
positivo
Ensayo Ave
No falso positivo
Ensayo Oveja: Combinación de
dos Ac mamíferos
Ensayo ave: Combinación de un
nAc mamífero con uno de ave
Sh
eep
Ass
ay
con
cen
tra
tio
nFalse positive response
IgY-Technology
Ensayo de detección para Proteina C reactiva (CRP)
avivas@ayv.unrc.edu.ar
Chicken Assay
CRP-concentration
Sh
eep
Ass
ay
CR
P-c
on
cen
tra
tio
n
�Distancia filogenética
IgY-Technology avivas@ayv.unrc.edu.ar
IgY-Technology
Phylogenetic Tree of Vertebrates
Placodermi
Chondrichthyes Osteichthyes
Amphibia Reptilia
avivas@ayv.unrc.edu.ar
Phylogenetic
difference
Amphibia Reptilia
Aves Mammalia
Chicken Human Rabbit
IgY-Technology
Diferencia FilogenéticaSecuencia de la proteína Prion (AA 151-190)
RENMHRYPNQ VYYRPVDQYS NQNNFVHDCV NITVKEHTVT
Bovina
Ovina
avivas@ayv.unrc.edu.ar
RENMYRYPNQ VYYRPVDQYS NQNNFVHDCV NITVKQHTVT
RENMHRYPNQ VYYRPVDQYS NQNNFVHDCV NITIKEHTVT
Mus
SENSARYPNR VYYRDYSSPV PQDVFVADCF NITVTEYSIG
Aves
�Experimentos
IgY-Technologyavivas@ayv.unrc.edu.ar
�Experimentos
UNRC
Doctorado en Ciencias Biológicas
“TECNOLOGÍA DE IGY ANTI-ESCHERICHIA COLIAPLICADA MEDIANTE COMPUESTOS HIDROGEL-
NANOTUBOS SOBRE CULTIVOS DE ENTEROCITOS PORCINOS”
Doctoranda: Lic. Romina Bellingeri
Directora: Dra. Adriana Vivas
Co-Directora: Dra. Nora Gorla
Las inmunoglobulinas de yema de huevo (IgY) anti-Escherichia coli administradas
mediante nanocompuestos hidrogel-nanotubos afectan la actividad patógena de la
Escherichia coli en cultivos primarios de enterocitos porcinos.
Evaluar la capacidad protectora de la IgY anti-Escherichia coli administrada
mediante nanocompuestos en cultivo primario de enterocitos porcinos desafiados
con E. coli.
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestra de IgY Proteínas (mg/g) IgY total (mg/g) IgY específica (título)
IgY anti-ETEC 686,2 ± 58,6 195,3 ± 1,7 * 1:100000 *
IgY control 556,1 ± 42,4 114,2 ± 3,4 1:1000Media ± desvío estándar (n=3). * indica diferencias significativas (p < 0,05).
Concentración y título de la IgY por ELISA
RESULTADOS
Bellingeri et al. (2012)
MATERIALES Y MÉTODOSrelación de los monómeros (AAm:AAc)
molaridadacrilamida(AAm)
molaridadac. acrílico
(AAc)
molaridadbisacrilamida
(BAAm)
porcentajebisacrilamida
(%)
A (0,5:1 ) 0,7 1,4 0,008 0,38
B (1:1) 1,4 1,4 0,016 0,57
C (2:1) 2,8 1,4 0,032 0,76
Síntesis
Caracterización de los hidrogeles pH-sensibles
CaracterizaciónEspectroscopia infrarroja
transformada de Fourier
Porcentaje de hinchamiento a pH 2Porcentaje de hinchamiento a pH 2Liberación de la IgY desde los hidrogeles
Liberación de la IgY desde los hidrogeles
FGS: 1,13 % (0,03 mg IgY/ml.h)
FIS: 7,27 % (0,19 mg IgY/ml.h)
Incorporación de la IgY en los hidrogeles
Composición (AAm:AAc)
mg IgY/pastilla de gel
A (0,5:1) 9,0 ± 0,1
B (1:1) 8,4 ± 1,1
C (2:1) 8,2 ± 0,3
Los datos son presentados como media ±desvío estándar (n=3).Test de Kruskal-Wallis,Infostat, 2009.
Interacción IgY-hidrogeles
MATERIALES Y MÉTODOS
Funcionalización de nanotubos con quitosano
Producto MWNT
Pureza >90%
Residuos <5%
Diámetro 10-30nm
SíntesisDeposición química en fase
vapor
Caracterización de nanocompuestos
Síntesisvapor
Sun Nanotech Co Ltd
Espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (FT-IR)
MATERIALES Y MÉTODOS
Porcentaje de hinchamiento (%)
Contenido de agua(%)
Hidrogel 96,69 ± 0,32a 2944,09 ± 299,81a
Hidrogel-NTC1% 96,76 ± 0,51ab 3035,70 ± 456,08ab
Hidrogel-NTC5% 97,21 ± 0,10b 3484,12 ± 135,24b
Los datos son presentados como media ± desvío estándar (n=3). Letras diferentes indican diferenciassignificativas (p < 0,05). Hidrogeles incubados por 8 h. Test de Kruskal-Wallis, Infostat, 2009.
RESULTADOS
Estabilidad de la IgY encapsulada en nanocompuestos en fluidos gástricos simulados
Estabilidad en FGS y FIS
Estabilidad en FGS y FIS
MATERIALES Y MÉTODOS
Efecto de la IgY administrada mediante nanocompuestosen la adhesión de ETEC
MATERIALES Y MÉTODOS
0 h 2 h 4 h 6 h
E. coli 7,56 ± 0,02 a 8,17 ± 0,05 a 8,89 ± 0,05 c 9,41 ± 0,04 c
E. coli + IgY 7,56 ± 0,04 a 8,13 ± 0,08 a 8,56 ± 0,04 a 8,65 ± 0,03 a
E. coli + IgY-hidrogel FGS 7,53 ± 0,02 a 8,12 ± 0,03 a 8,71 ± 0,04 ab 8,90 ± 0,03 ab
E. coli + IgYFGS 7,57 ± 0,06 a 8,18 ± 0,03 a 8,86 ± 0,03 c 9,28 ± 0,09 cLos datos son presentados como media Log UFC/ml ± desvío estándar (n = 3). Letras diferentes indican diferencias significativas(p < 0,05). Test de Kruskal-Wallis, Infostat, 2009.
Doctorado en Ciencia Animal
“Tecnología de anticuerpos aviarios administrados en nanoestructuras aplicados a la sanidad porcina”
Mic. Fabrisio E. AlustizaLaboratorio de Radioisótopos y de Biotecnología Animal
Facultad de Agronomía y Veterinaria U.N.R.C.
Datos ensayo in vivo en lechones en confinamiento.
GRUPOS DIARREA GANANCIA PESO (g)
T° RECTAL (°C)
SI/NO Score Desh. Inicial Final
CONTROL – NO 0A 0A 222,5 a±115,6 37,8 a 38 b
CONTROL VEHICULO NO 0 A 0 A 244,8 a±87,5 37,7 a 38 b
UFC/m
l)
CONTROL +
Solo desafío
SI 3 B 2 B -262,5 b±75,3 37,9 a 39a
RESULTADOSIN
OC
ULA
DA
S
5 ml (1010UFC/m
l) Solo desafío
TRATAMIENTO 1
IgY sin encapsular
6c
NO 0 A 0 A 250 a±167 37,8 a 38,3 b
SI 3B 2B -70c±60,5 37,9a 38,5b
TRATAMIENTO 2
IgY encapsulada
NO 0 A 0 A 387,5 a±111,5 37,7 a 38,4 b
Letras distintas en la misma columna indican diferencias significativas (p<0.05) A, B Kruscal Wallis.
a, b , c ANOVA
Li,et al. 2009. Vet. Immunol. Immunopathol. 129:132-136.
Doctorado en Ciencias Biológicas
Tesis Doctoral
“TECNOLOGÍA DE ANTICUERPOS AVIARIOS Y NANOTECNOLOGÍA APLICADA A LA SANIDAD BOVINA”
avivas@ayv.unrc.edu.ar
Doctoranda: Mic. Natalia Picco
Grupos (n=4)Diarrea Grado de
deshidrataciónGanancia/pérdida de peso
(gramos)(SI/NO) Duración Consistencia Deposic/día
Inocula
dos
IgY a
nti-
EC
ET
Encapsul 1
No - - 1 Ninguno+600
675,00 ± 35,36 b,c2 +700
3Si 2 días Líq/Semi-líq 2 Ninguno
-300-525,00 ± 318,20 a,b
4 -1100
IgY c
ontr
ol
Encapsula
d 1
No - - 1 Ninguno
+700
162,50 ± 573,55 a,b,c2 +650
3 -200
4 -750
IgY a
nti-
EC
ET
Lib
re 1
No - - 1 Ninguno
+300
50,00 ± 479,58 a,b,c2 +600
3 -300
4 -400EC
ET
4 -400
sin
IgY
1
Si 3 días Líq/Semi-líq 3-5 Leve
-300
-612,50 ± 317,21 a2 -500
3 -600
4 -1700
Contr
ol
1
No - - 1 Ninguno
+2000 1016,67 ± 275,38 c2 - 200
3 +1000
4 Si 2 días Líq/Semi-líq 2 Ninguno -1600 -1600,00 ± 0,00 a
• Vega et al., 2011.
• Ozpinar et al., 1996.
•Li et al., 2009.
Los datos se expresan como la media ± el desvío estándar. Letras diferentes indican diferencias significativas (p= 0,0185).
� En conjunto, los resultados de esta tesis indican que laadministración de IgY anti-ECET, mediante hidrogeles pH-sensibles,administración de IgY anti-ECET, mediante hidrogeles pH-sensibles,resulta eficaz para controlar la diarrea por ECET y por K88.
� La tecnología de IgY representa una solución alternativaespecialmente en aquellos establecimientos donde la diarreaneonatal de los terneros causa importantes problemas económicosy para lechones destetados.
Tecnología de IgY: sistema inmune asociado a mucosas
(MALT) y a intestino (GALT) en gallinas inmunizadas contra
Escherichia coli K8”.
Doctorando: Magister Lic. María Fernanda PERALTA
Directora: Dra. Adriana Beatriz VIVAS.
Codirectora: Dra María Das Gracia MIRANDA DANELLI.
CoDirector: Dr. Raúl D. MIAZZO.
POBLACIONES DE LI B
Sangre periférica BazoControl
Muchas Gracias Muchas Gracias Muchas Gracias Muchas Gracias
por su atenciónpor su atenciónpor su atenciónpor su atención