Types of molecular markers

ประเภทของเครองหมายโมเลกล

จรพงศ ใจรนทรศนยวจยขาวอบลราชธาน

สมมนาเชงปฎบตการ การใชเครองหมายโมเลกลเพองานปรบปรงพนธขาว 9-12 เมษายน 2556

จโนม โครโมโซม ยน ดเอนเอGenome, Chromosome, Gene, DNA

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

จโนม คอ ขอมลทางพนธกรรมทงหมดทจาเปนตอ

การดารงชวตอยางปกตของสงมชวต หรออาจ

กลาวไดวา คอ ชดของดเอนเอทงหมดทบรรจอย

ในเซลล

จโนมคออะไร?

Genome = Total genetic materials of an organism

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

Rice GenomeRice Genome

12 12 โครโมโซมโครโมโซม ( (2n=24)2n=24)

389 Mb389 Mb

32,000 32,000 ยนยน

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

MitochondriaGenome

ChloroplastGenome

NuclearGenome

Chromosomes

Genes + Non-Genes

Rice genome

(490.5 Kb)35 genes

(134.5 Kb)34 genes

(389 Mb)32,000 genes

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

Wheat~16000 Mb

Barley~6000 Mb

Human~3000 Mb

Maize~2500 Mb

Sorghum~1000 Mb

Rice~389 Mb

Arabidopsis~125 Mb

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

โครโมโซมขาว (2n = 24)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

โครโมโซมคออะไร?โครโมโซมเปนทอยของหนวยพนธกรรมโครโมโซมเปนทอยของหนวยพนธกรรม ซงทาหนาทซงทาหนาท

ควบคมและถายทอดขอมลเกยวกบลกษณะทางควบคมและถายทอดขอมลเกยวกบลกษณะทาง

พนธกรรมตางๆพนธกรรมตางๆ ของสงมชวตของสงมชวต

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

Chromosomes of wheat and riceการใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

Wheat2n=4216Gb

Rice2n=240.4Gb

ดเอนเอคออะไร?ดเอนเอ (Deoxyribonucleic acid, DNA) คอ สาร

พนธกรรมททาหนาทเปนยนหรอหนวยพนธกรรมท

สามารถควบคมลกษณะทางพนธกรรมในสงมชวต

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

A T G C

นวคลโอไทดเปนโมเลกลทประกอบดวยนาตาลดออกซไรโบสและมไน

โตรจนสเบสมอยสชนด ไดแก อะดนน (Adenine), ไทมน (Thymine),

ไซโตซน (Cytosine) และกวนน (Guanine)การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

เครองหมาย (Marker)

สงบงชความเปนเอกลกษณของสงมชวต สามารถ

แยกความแตกตางของลกษณะทแสดงออกและ

สามารถถายทอดไปยงรนลกได

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

Biological (races or biotypes) Morphological (awn, leaf sheath or grain color)Biochemical (isozymes)Molecular or DNA-based (DNA sequence)

ชนดของเครองหมาย (marker)

ทใชในการศกษาทางพนธศาสตร

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

ชนสวนดเอนเอสายสนๆ ทมลาดบเบสสามารถ

เขาคกบชวงใดชวงหนงบนสายดเอนเอ ทาใหระบ

ตาแหนงบนโครโมโซมและสามารถแยกความ

แตกตางของสงมชวตเปาหมายได

เครองหมายดเอนเอคออะไร?

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

เครองหมายดเอนเอใชทาอะไร?

Gene mapping, map based cloningMarker assisted breedingPlant variety protectionGenetic diversity

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

Mutations in genomic DNA

GATCCGAGTGATCCGAGTAATCGCAATTAGCATCGCAATTAGCAGATCCGAGTGATCCGAGTGGTCGCAATTAGCATCGCAATTAGCA

Base substitutionBase substitution

GATCCGAGTAGATCCGAGTATCGCATCGCAATTAGCAATTAGCAGATCCGAGTAATTAGCAGATCCGAGTAATTAGCA

DeletionDeletion

GATCCGAGTATCGCAATTAGCAGATCCGAGTATCGCAATTAGCAGATCCGAGTATCGCAGATCCGAGTATCGCAGCGCATTAGCAATTAGCA

InsertionInsertion

GATCCGAGTATCGCAATTAGCAGATCCGAGTATCGCAATTAGCAGATCCGAGTATCGATCCGAGTATCTCTCGCGCAATTAGCAAATTAGCA

DuplicationDuplication

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

Genetic Variation

AC

AC

AC

AC

AC

InsertionDeletion

SSR

TransposonGene interruptionChromosome DNA

Base substitution

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

AC

AC

AC

AC

AC

InsertionDeletion

SSR

TransposonGene interruption

Base substitution

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

Known function and unique positionEST Expressed Sequence TagSNP Single Nucleotide PolymorphismSSCP Single Strand Conformation PolymorphismInDel Insertions and DeletionILP Intron Length Polymorphism

No function and unique positionRFLP Restriction Fragment Length PolymorphismSCAR Sequence Characterized Amplified RegionSSR Simple Sequence RepeatSTS Sequence Tagged Site

No function and variable positionRAPD Random Amplified Polymorphic DNAAFLP Amplified Fragment Length PolymorphismISSR Inter-simple Sequence Repeat

ชนดของเครองหมายดเอนเอ

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

Non-PCR based marker (RFLP)

PCR based marker (SSR, RAPD, AFLP, CAPS , ISSR, SSCP, SCAR, SNP, etc.)

ชนดของเครองหมายดเอนเอ

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

DNA fragments

Electrophoresis

Hybridization

Autoradiographyการใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

Non-PCR based marker

PCR

Electrophoresis

Visualization

PCR based marker

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

PolymorphicCo-dominant inheritanceOccurs throughout the genomeEasy, fast and cheap to detectReproducible/transferableHigh-throughput genotyping

เครองหมายโมเลกลทด

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

Co-dominance and dominance markers

Dominant marker

AAaa

AA Aa

Co-dominant marker

AAaa

AAaa

Aa

P1 P2 F2

aa

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

RFLP procedureDNA isolationRestriction enzyme digestionAgarose electrophoresisHybridizationDetection

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

5’---------------GAATTC-----------------------TTAA----------------3’3’---------------CTTAAG-----------------------AATT----------------5’

+EcoRIMseI

Primer+3 5’--------------AAC

GAC ------------ 5’ Primer+3

4.5 % denaturing PAGE

AATTC-------------------------TG------------------------AAT

EcoR I adapter

TTAA

Mse I adaptor

TA

AATTCT---------------------CTTATTAAGA---------------------GAAT

Primer+1 5’ --------------A

C------------- 5’ Primer+1

AATTCTTG-------------------GACTTATTAAGAAC-------------------CTGAAT

PCR I

PCR II

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

AFLP Fingerprint of Domestic Thai Rice Varieties

พวงม

าลย

เหลอ

งประทา

น(1)

เหลอ

งประทา

น(2)

ประด

แดง

กาปน

หอมน

างมน

เหลอ

งรา

นางงาม

เหลอ

งรอยเอด(

1)เหลอ

งรอยเอด(

2)ปร

ะทาน

บานบ

งไขจงหร

ดแด

งลา

เหนย

วกรงเทพ

พวงเง

น

หอมล

ะออ

เหลอ

งแตง

โมนา

งกอง

ขาวห

มากเขก

ขาวล

อเหลอ

งไทเหนย

งอป

รกหอ

มอนเดย

เหลอ

งมา

ขาวล

องหอ

มลม

ขาวเห

ลอง

ลนยง

ขาวม

ะแขก

ดอกน

างนว

ลหล

องใบลด

สองรวง

(1)

สองรวง

(2)

หอมข

าวเปลอ

กพม

พญา

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

RAPD Primer - Operon Kit

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

Characters of RAPD

PCR-Based MethodSingle Abitrary Primer (8-10 base pairs)Amplify Anonymous Stretches of DNADominant MarkerNumber of fragment amplified/primer (6-12)

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

SSR(Simple Sequence Repeat)

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

Simple Sequence Repeat (SSR)

AB

A (GA)10 B (GA)5

SSRs

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

D i (AT)nT r i (GGT)nT e t r a (GAAT)nH e x a (GACCAT)nP e n t a (CCATCAT)nD e c a (CCATCATCAT)n

Type of repeats

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

GT AC GT ACACACACACACAC

RsaI RsaI

ACACACACACAC

TGTGTGTG

Adapter

ACACACACACAC

TGTGTGTGTGTG

DNA isolation(BPH1966)

ACACACACACAC

454 Sequencing

Adapter

Microsatellite

BiotinylatedOligo

Streptavidin Dynabead

Magnetic

TGTGTGTGTGTG

TGTGTGTGTGTG

CA TG CA TG

GT AC GT ACACACACACACAC

RsaI RsaI

ACACACACACAC

TGTGTGTG

Adapter

ACACACACACAC

TGTGTGTGTGTG

DNA isolation(BPH1966)

ACACACACACAC

454 Sequencing

Adapter

Microsatellite

BiotinylatedOligo

Streptavidin Dynabead

Magnetic

TGTGTGTGTGTG

TGTGTGTGTGTG

CA TG CA TG

Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing Repeats (FIASCO)

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

h1h2h3h4i1

i1

i2

RM225

Alle

le st

anda

rd

i2i3 i4i5i6 i7 i8i3 i8

i1

RM261

Alle

le st

anda

rd

g1

g2g3

g4

RM17A

llele

stan

dard

h1

h2h3i1 i2 i3

RM258A

llele

stan

dard

g1g2

h1

h2

RM201

Alle

le st

anda

rd

h1h2

i1 i2i3 i4 i5 i6 i7

i1

RM3

Alle

le st

anda

rd

i4j1

i5

j1j2

RM00

j1 j2

j3

k1

k2

l1

RM248

Alle

le st

anda

rd

g1g2

g3

g4g5g6h1h2h3h4

i1

RM257

Alle

le st

anda

rd

Allele standard of rice identified by SSR markers

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

SNPs หรอสนปส (Single Nucleotide Polymorphisms)ความแตกตางทางพนธกรรมทเกด

จากการเปลยนแปลงลาดบเบสบน

สายนวคลโอไทดเพยงตาแหนงเดยว

SNPs are the most abundant type ofpolymorphism in rice genomeOver 3.6 million SNPs, of which 167,000 were found in coding regions9 SNPs/kb across 517 resequenced rice varieties

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

Indica/Japonica PolymorphismsNipponbare/93-11Chromosome Length SNP

123456789101112

Total

42,904,17335,514,78235,023,38834,446,16528,498,21129,923,25029,275,63627,648,54121,127,18022,432,52224,871,67026,881,443

358,546,961

53,65246,20241,17229,65928,50829,79230,32628,17824,01123,96225,06923,810

384,431

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

Illumina BeadXpress ReaderHigh throughput SNP detection

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

Distribution of SNP markers across the rice genome: Affymetrix 44 K SNP markers followed by the 384-plex SNP sets RiceOPA2.1, RiceOPA3.1, RiceOPA5.0 and RiceOPA6.0 การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

SummaryPCR-based, Codominant marker

Polymorphisms

SSR เปนเคองหมายโมเลกลทนยมใชในปจจบน

แตกมขอจากด

อนาคต SNP (high throughput), Identification

of trait-specific SNP markers

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว

การใชเครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธขาว