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ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 1
Determinación de la Actividad Antimicrobiana y Hemolítica de Fragmentos Peptídicos
Nativos de la Toxina Cry46Aa1 Frente a Pseudomonas sp
Olarte Díaz Andrés Felipe
Universidad de Santander
Facultad Ciencias Exactas, Naturales y Agropecuarias,
Microbiología Industrial
Bucaramanga
2021
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 2
Determinación de la Actividad Antimicrobiana y Hemolítica de Fragmentos Peptídicos
Nativos de la Toxina Cry46Aa1 Frente a Pseudomonas sp
Olarte Díaz Andrés Felipe
Trabajo de grado para la optar por el título de Microbiólogo Industrial
Director
Cruz Laitón Jennifer PhD
Codirector
Rueda Forero Nohora Juliana
MSc
Asesor
Orlando Suarez Miguel
MSc
Universidad de Santander
Facultad Ciencias Exactas, Naturales y Agropecuarias,
Microbiología Industrial
Bucaramanga
2021
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Agradecimientos
A mis padres por apoyarme y estar presentes durante este proceso, ayudarme a cumplir
las metas propuestas y por brindarme una educación de calidad. Además, gracias por formarme
con principios y valores, que el día de hoy me ayudaron a convertirme en la persona que soy.
Jenniffer Cruz Laitón MSc, PhD, Nohora Juliana Rueda Forero MSc., Ph.D (c) y Miguel
Orlando Suarez MSc., Ph.D (c) por brindarme sus conocimientos además de apoyarme en este
proceso, darme la oportunidad de trabajar y compartir momentos que me ayudaron a crecer tanto
a nivel profesional como personal.
Agradezco al equipo de trabajo del Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología
UDES, donde más que compañeros de trabajo encontré una familia.
A mis compañeros de carrera, quienes son personas increíbles y excelentes
Microbiólogos, les esperan grandes metas por cumplir y en su vida muchas bendiciones.
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Dedicatoria
En primer lugar, a Dios, por llenarme de bendiciones, ya que sin él nada sería posible. A
mis padres por ayudarme y confiar en mí, por ser ejemplo a seguir, por demostrarme que el
esfuerzo y la dedicación siempre tiene sus frutos, por su amor incondicional y compresión en los
momentos difíciles.
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Tabla de Contenido
Resumen ........................................................................................................................................ 13
Abstract ......................................................................................................................................... 15
1 Introducción ...................................................................................................................... 17
2 Planteamiento del Problema ............................................................................................. 20
3 Justificación ...................................................................................................................... 23
4 Pregunta de Investigación ................................................................................................. 25
5 Marco Teórico ................................................................................................................... 26
5.1 Especies de Pseudomonas Patógenas en Plantas .................................................. 26
5.1.1 Descripción ............................................................................................... 26
5.1.2 Caracterización ......................................................................................... 28
5.1.3 Patogénesis ................................................................................................ 29
5.2 Impacto Ambiental por Utilización de Agroquímicos .......................................... 32
5.3 Proteínas Cry y Péptidos Antimicrobianos Derivados Como Alternativa de
Agroquímicos Comerciales ............................................................................................... 33
5.4 Actividad hemolítica ............................................................................................. 35
6 Marco Legal ...................................................................................................................... 36
7 Objetivos ........................................................................................................................... 38
7.1 Objetivo General ................................................................................................... 38
7.2 Objetivos Específicos............................................................................................ 38
8 Hipótesis ........................................................................................................................... 39
8.1 Hipótesis de Investigación .................................................................................... 39
8.2 Hipótesis Nula ....................................................................................................... 39
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8.3 Hipótesis Alternativa ............................................................................................ 39
9 Metodología ...................................................................................................................... 40
9.1 Diseño de Estudio ................................................................................................. 40
9.2 Esquema Metodología .......................................................................................... 40
9.3 Materiales y Métodos ............................................................................................ 40
9.3.1 Propiedades fisicoquímicas de los péptidos .............................................. 41
9.3.2 Activación de la cepa HSL30 ................................................................... 42
9.3.3 Cinética de crecimiento............................................................................. 42
9.3.4 Estandarización del inoculo mediante absorbancia .................................. 43
9.3.5 Ensayo de actividad antimicrobiana ......................................................... 44
9.3.5.1 Concentración Mínima Inhibitoria media (CMI50). ................... 44
9.3.5.2 Concentración Mínima Bactericida (CMB). .............................. 45
9.3.6 Determinación del porcentaje de hemólisis de los péptidos nativos en
eritrocitos de humano ............................................................................................ 45
9.3.7 Análisis de los resultados .......................................................................... 46
10 Resultados y Discusión ..................................................................................................... 47
10.1 Estructura Secundaria In Silico de los Péptidos .................................................... 47
10.2 Cinética de Crecimiento de Pseudomonas sp Fitopatógena ................................. 49
10.3 Actividad Antimicrobiana de Péptidos Frente a Pseudomonas sp Fitopatógena . 55
10.4 Actividad Hemolítica de los Péptidos en Eritrocitos Humanos ............................ 62
11 Conclusiones ..................................................................................................................... 65
12 Recomendaciones ............................................................................................................. 66
13 Referencias Bibliográfícas ................................................................................................ 67
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14 Apéndices .......................................................................................................................... 76
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Lista de Figuras
Figura 1 Representación esquemática de Pseudomonas sp .......................................................... 26
Figura 2 Esquema General de la Metodología. ............................................................................. 40
Figura 3Estructura secundaria de péptidos ................................................................................... 47
Figura 4 Cinética del crecimiento exponencial de Pseudomonas sp (fitopatógena) .................... 50
Figura 5 Cinética de Pseudomonas sp frente a péptidos derivados de Cry46Aa1........................ 53
Figura 6 Crecimiento de Pseudomonas sp frente al péptido Loop2-PS2Aa ................................. 54
Figura 7 Pseudomonas sp en presencia del oxicloruro de cobre. ................................................. 55
Figura 8 Actividad inhibitoria de los tratamientos frente a Pseudomonas sp............................... 56
Figura 9 Comparación del porcentaje de inhibición entre oxicloruro de cobre y el péptido más
bioactivo. ....................................................................................................................................... 58
Figura 10 Determinación de la actividad Hemolítica ................................................................... 63
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Lista de Tablas
Tabla 1 Resumen de Pseudomonas Fitopatógenas, Cultivos que Afecta y enfermedades/síntomas
que Produce. .................................................................................................................................. 29
Tabla 2 Secuencia de péptidos nativos derivados del dominio 1 de Cry46Aa1 y sus propiedades
fisicoquímicas. .............................................................................................................................. 48
Tabla 3 Cinética de crecimiento control-. ..................................................................................... 52
Tabla 4 Compuestos evaluados frente Pseudomonas sp fitopatógena.......................................... 61
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Lista de Abreviaturas
BC: Biología Computacional
Bt: Bacillus thuringiensis
°C: Grados Celsius
cel/mL: Células por mililitro
CMB: Concentración Mínima Bactericida
CMI50: Concentración Mínima Inhibitoria media
CMI: Concentración Mínima Inhibitoria
CN: Caldo nutritivo
Cu: Cobre
DC: Dicroísmo Circular
DE: Desviación Estándar
DO: Densidad Óptica
g/mL: Gramos por mililitro
L: Litro
µg: Microgramos
μg/mL: Microgramo sobre mililitro
MH: Agar Müller Hinton
MHC: Müller Hinton Caldo
min: Minutos
mL: Mililitro
μL: Microlitros
mm: Milímetros
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ns: No hay diferencia significativa
PAM: Péptidos Antimicrobianos
s: Segundos
T: Temperatura
U/mL: Unidades por mililitro
UFC: Unidades formadoras de colonia
UFC/mL: Unidades formadoras de colonia por mililitro
UV: Ultravioleta
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Resumen
Título
Determinación de la Actividad Antimicrobiana y Hemolítica de Fragmentos Peptídicos
Nativos de la Toxina Cry46Aa1 Frente a Pseudomonas sp.
Autor
Olarte Díaz Andrés Felipe
Palabras Clave
Péptidos Antimicrobianos, Proteínas Cry, Actividad Antimicrobiana, Pseudomonas sp
Descripción
Bacillus thuringiensis (Bt) es una bacteria Gram-positiva, aerobia, que se caracteriza por
producir cristales parasporales -proteínas Cry- con efectos insecticidas frente a plagas. Sin
embargo, en los últimos años se ha documentado que un grupo de proteínas Cry no presentan
actividad insecticida o hemolítica, presentan actividad frente a bacterias o células cancerígenas.
Aunque el mecanismo de acción de este grupo de proteínas no se ha elucidado completamente, la
fragmentación de ésta en péptidos, acompañada con un soporte computacional pueden dar luces
de los sitios de unión o la forma de internalización celular.
La característica anfipática de este grupo de compuestos, péptidos, es crucial para la
interacción con la membrana, donde las cargas positivas en este grupo de moléculas son
importantes para generar selectividad, al interactuar de formas distintas con las membranas
bacterianas, que están densamente poblados por fosfolípidos con carga negativa. Por
consiguiente, pueden tener una alta probabilidad de ser antimicrobianos.
Basados en estas consideraciones, en este estudio se evaluó la actividad de tres
fragmentos peptídicos derivados de la proteína Cry46Aa1 denominados: P264-G274, Loop1-
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PS2Aa y Loop2-PS2Aa frente a especies fitopatógenas de Pseudomonas sp, bacteria que se
caracteriza por afectar los cultivos de interés en la región nororiental de nuestro país.
Inicialmente, se realizó una cinética de crecimiento para conocer el tiempo de
duplicación de la cepa fitopatógena y se evaluó la actividad hemolítica de cada uno de los
compuestos. Así mismo, se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y
Concentración Mínima Bactericida (CMB) de los péptidos frente a la bacteria anteriormente
mencionada. Adicionalmente, las concentraciones analizadas de los compuestos fueron en un
rango de concentración de 4 a 150μM, siendo el péptido Loop2-PS2Aa el más bioactivo
obteniendo porcentajes de inhibición de 44.41% y 51.98% a las concentraciones de 100 µM y
150 µM, respectivamente. Asimismo, se evaluaron concentraciones más altas para este
compuesto.
Se empleó el agroquímico Oxicloruro de cobre (Cu2(OH)3Cl) como control positivo a las
mismas concentraciones que los péptidos mostrando una menor inhibición a concentraciones
bajas en comparación con el péptido Loop2-PS2Aa. Sin embargo, a la concentración
recomendada (2g/L o 9364.6 µM) para tratar especies fitopatógenas de Pseudomonas sp inhibió
el 99.9% de crecimiento, siendo esta la CMB. Con los resultados obtenidos se pretende recopilar
información acerca de posibles fragmentos bioactivos de la toxina Cry46Aa1 del dominio I, que
aún no se han evaluado frente a bacterias fitopatógenas.
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Abstract
Title
Determination of the Antimicrobial and Hemolytic Activity of Native Peptide Fragments
of the Cry46Aa1 Toxin Against Pseudomonas sp.
Author
Olarte Díaz Andrés Felipe
Keywords
Antimicrobial Peptides, Cry Proteins, Antimicrobial Activity, Pseudomonas sp.
Description:
Bacillus thuringiensis (Bt) is a Gram-positive, aerobic bacterium characterized by producing
parasporal crystals -Cry proteins- with insecticidal effects against pests. However, in recent years
it has been documented that a group of Cry proteins do not show insecticidal or hemolytic
activity. They show activity against bacteria or cancer cells. Although the mechanism of action
of this group of proteins has not been fully elucidated, its fragmentation into peptides,
accompanied by computational support, can shed light on the binding sites or the form of cellular
internalization.
The amphipathic characteristic of this group of compounds, peptides, is crucial for the
interaction with the membrane, where the positive charges in this group of molecule are
important to generate selectivity, by interacting discriminatively with bacterial membranes,
which are densely populated by phospholipids with negative charge. Consequently, they may
have a high probability of being antimicrobial.
Based on these considerations, this study evaluated the activity of three peptide fragments
derived from the Cry46Aa1 protein called: P264-G274, Loop1-PS2Aa and Loop2-PS2Aa against
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phytopathogenic species of Pseudomonas sp, a bacterium that is characterized by affecting
cultures of interest in the northeastern region of our country. Initially, growth kinetics were
performed to determine the doubling time of the phytopathogenic strain and the hemolytic
activity of each of the compounds was evaluated. Likewise, the Minimum Inhibitory
Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) of the peptides against
the aforementioned bacteria were determined. Additionally, the analyzed concentrations of the
compounds were in a concentration range of 75 to 150μM, with the Loop2-PS2Aa peptide being
the most bioactive, obtaining inhibition percentages of 44.41% and 51.98% at concentrations of
100 µM and 150. µM, respectively. Also, higher concentrations were evaluated for this
compound.
The agrochemical Copper Oxychloride (Cu2(OH)3Cl) was used as a positive control at
the same concentrations as the peptides, showing less inhibition at low concentrations. However,
at the recommended concentration (2g/ L or 9364.6 µM) to treat phytopathogenic species of
Pseudomonas sp, it inhibited 99.9%, being this the CMB. The results obtained are intended to
gather information about possible bioactive fragments of the Cry46Aa1 toxin from domain I,
which have not yet been evaluated against phytopathogenic bacteria.
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1 Introducción
Bacillus thuringiensis (Bt) es una bacteria Gram-positiva, aerobia, que se caracteriza por
producir cristales parasporales con efectos insecticidas frente a plagas como lepidópteros,
coleópteros y dípteros, entre otros órdenes de insectos. En la década de los años 70 se definieron
dos grupos: toxinas Cry (Crystal) y toxinas Cyt (Cytolitic), de acuerdo con la producción de δ-
endotoxinas (Jouzani et al., 2017). Debido a los resultados obtenidos derivados del control de
plagas se aislaron nuevas cepas de Bt a partir de diversos nichos ecológicos donde se reveló la
producción de proteínas Cry que no presentan actividad insecticida o hemolítica, pero que han
demostrado actividad frente a microorganismos y líneas cancerígenas (Velásquez C et al., 2018).
Cry46Aa1 es un es un polipéptido de 338 residuos de aminoácidos, conformada principalmente
por hojas β, que se enrollan y alargan sobre el eje de la molécula; estructura similar a la toxina
aerolisina β-formadora de poros (TFP). Sin embargo, a pesar de sus estudios estructurales, aún
no se ha determinado un modelo completo del mecanismo de acción de la Cry46Aa1 (Yang et
al., 2019).
La fragmentación de la proteína Cry46Aa1 en secuencias más cortas- péptidos-
seleccionando regiones del dominio I puede dar luces acerca de los sitios de unión de la proteína
a membranas biológicas; o a su vez por ser este tipo de molécula con menor peso molecular,
anfipática, con amplio espectro de acción pueden también presentar una actividad antibacteriana
prometedora. Los péptidos antimicrobianos (PAMs) son oligopéptidos con un número variable
de aminoácidos (longitud de cadena entre 7 y 50 residuos), que presentan propiedades
fisicoquímicas tales como estructura secundaria α-hélice, carga total positiva e hidrofobicidad.
Estas características afectan la interacción entre los PAMs y la membrana de la célula. Los
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PAMs exhiben un amplio espectro de actividad frente a bacterias Gram-positivas y Gram-
negativas, hongos, parásitos, virus y células tumorales debido a que presentan toxicidad selectiva
permitiendo atacar de manera específica la célula diana mediante mecanismos que al parecer
dificultan la aparición de fenómenos de resistencia.
Por lo anterior, el presente trabajo de investigación se enfocó en evaluar la actividad
fragmentos peptídicos nativos de la protoxina Cry46Aa1, producida por Bt tomando como
modelo la bacteria de Pseudomonas sp fitopatógena; cepa oportunista asociada como la causante
de la producción de enfermedades en cultivos como tomate, arveja papa y cebolla considerados
de interés económico en Colombia y la Región Santandereana. Este tipo de patógeno
actualmente es atacado por los agricultores utilizan compuestos bactericidas para controlar la
enfermedad (por ejemplo, oxicloruro de cobre); sin embargo, esta práctica podría causar graves
daños al medio ambiente y la salud humana y también promueve la selección de cepas patógenas
con mayor tolerancia al cobre (Cu).
Inicialmente, se estudió la cinética de crecimiento de la cepa fitopatógena Pseudomonas
sp. Luego, se evaluó la capacidad antimicrobiana de los péptidos nativos derivados del dominio I
de Cry46Aa1 denominados: P264-G274, Loop1-PS2Aa y loop2-PS2A mediante la
determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida
(CMB) frente a Pseudomonas sp fitopatógenas, como posibles compuestos líderes bioactivos.
Finalmente, se evaluó la actividad hemolítica de estos compuestos, ya que se consideran
moléculas de amplio espectro de acción antibiótica. En consecuencia, se proponen como
moléculas prometedoras dentro del desarrollo de nuevas estrategias para el control biológico y
con los resultados obtenidos se busca recopilar información acerca de posibles fragmentos
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bioactivos de la protoxina Cry46Aa1, que aún no se han evaluado frente a bacterias
fitopatógenas.
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2 Planteamiento del Problema
La colonización bacteriana de los tejidos vegetales es un fenómeno natural facilitado por
la presencia de nutrientes, humedad y pH. Como consecuencia, las enfermedades bacterianas son
responsables de pérdidas considerables en muchos cultivos, lo que afecta su rendimiento y
calidad en todo el mundo. Ralstonia solanacearum, Pseudomonas syringae, Xanthomonas
campestris, Xylella fastidiosa, Dickeya dadantii y algunas especies de Pectobacterium son entre
los patógenos vegetales más importantes en términos de virulencia y por tanto, con impacto
económico. Sin embargo, estas especies son solo una pequeña parte de la gran cantidad de
patógenos vegetales (Gutiérrez-Pacheco et al., 2019).
La penetración de las bacterias en la planta se efectúa a través de aberturas naturales o
heridas, después se introducen en los espacios intercelulares. Se dispersan por el viento y el agua
de lluvia, así como por insectos vectores. También, se pueden mover por el agua utilizada en los
riegos, contacto de plantas infectadas, semillas, injerto y por equipos mecánicos utilizados
causando contaminación cruzada (Bernal, 2010). En Colombia, específicamente en la región
Nororiental del país los cultivos de tomate, arveja y cebolla, cultivos de interés económico por su
oferta y demanda, (DANE, 2020), son afectados por bacterias fitopatógenas como Pseudomonas
sp, la cual aumentan su población de manera rápida y de ahí su importancia como patógeno, ya
que pueden producir enormes cantidades de células en un corto período de tiempo debido a su
crecimiento exponencial.
El género Pseudomonas, es uno de los principales patógenos oportunista tanto en plantas
como en animales, puede encontrarse presente en gran cantidad de nichos ecológicos. Además,
gracias a su poca exigencia nutricional y su alta resistencia a la gran mayoría de antimicrobianos
por el uso indiscriminado, influencia negativamente sobre ambientes y la salud humana. Este
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fitopatógeno se presenta como uno de los principales problemas para los cultivos de tomate,
arveja y cebolla; entre las especies más comunes se encuentra Pseudomonas syringae (P.
syringae) y Pseudomonas sp (P. sp) causantes de manchas necróticas del tomate o manchas
bacterianas, esta enfermedad se presenta sobre frutos como pequeñas manchas negras
superficiales a veces de menos de 1 mm de diámetro, su tejido alrededor de la fruta madura
lentamente o simplemente no madura (Alvarado-Martínez, 2013). En el caso del cultivo de
alverja causa bacteriosis. Asimismo, Pseudomonas viridiflora (P. viridiflora) afecta los cultivos
de cebolla causando manchas alargadas en las hojas y putrefacción del bulbo. En el caso de
Pseudomonas cepacia (P. cepacia) causa pudrición blanda al cultivo y Pseudomonas aeruginosa
(P. aeruginosa) causa la podredumbre parda interna en estos cultivos de interés.
Los agroquímicos más utilizados para la protección de los cultivos frente Pseudomonas
sp son: el Ácido yodhídrico (HI), el antibiótico Kasugamicina y el Oxicloruro de cobre
(Cu2(OH)3Cl); estos agroquímicos, producto de la actividad agrícola intensiva, (Zayas, 2014)
pueden generar alto niveles de contaminación ambiental, intoxicaciones en mamíferos y plantas,
causar genotoxicidad, toxicidad crónica, fallo renal o necrosis tubular en plantas por el uso
indiscriminado, afectar la flora, fauna y recursos naturales producto de la acidificación,
contaminación de acuíferos y acumulación de sales que afectan las interacciones microbianas
(Vargas-González et al., 2019).
A partir del siglo 20, en la década de los 70, empezó una gran demanda de alimentos,
convirtiéndose la agricultura de gran importancia para la economía global , generando una
expansión de las áreas de cultivo y riego, así como una mayor utilización de fertilizantes y
agroquímicos buscando tener buenos rendimientos, siendo de importancia las Buenas prácticas
agrícolas (BPA) que están orientadas por un grupo de normativas que pretenden proporcionar
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 22
recomendaciones técnicas para la calidad de la producción, mostrando interés por la protección
de la salud de los consumidores, las condiciones laborales en la agricultura y principalmente
enfocados en la conservación del medio ambiente (Moreira García & Vera Pincay, 2016).
Por lo anterior, se proponen lo péptidos antimicrobianos(PAMs) como moléculas
prometedoras frente a bacterias fitopatógenas. La actividad de los PAMs es muy amplia y puede
ser dividida en 5 diferentes : (1) antibacteriana como el caso del efecto sinérgico de dos péptidos
Nisin y P10 con antibióticos convencionales contra los aislados de Acinetobacter baumannii
microorganismo altamente resistentes a los medicamentos y Pseudomonas aeruginosa resistentes
a la colistina (Jahangiri et al., 2021), del mismo modo (2) antifúngica, como la fracción Fa5 de
proteínas extraídas en frutos de Capsicum annuum L, que contiene bandas de proteínas
principales de 17 y 6,5 kDa, mostrando actividad contra las especies del género Fusarium (dos
Santos et al., 2017), (3) antiparasitaria, asi como es el caso de jelleina, un péptido derivado de la
jalea real con efecto antileishmanial y su forma conjugada de ácido láurico contra dos parásito
Leishmania major (L. major) (Zahedifard et al., 2020); por otra parte,(4) antiviral, es el péptido
P1 que inhibe la infección por el virus de la encefalitis japonesa (JEV) en células BHK-21 con
una capacidad inhibidora del 50% a una concentración de 35,9 μM (Wei et al., 2020). de otro
modo péptidos con acción (5) anticancerígena por ejempló F4d y F4e ensayados frente a
modelos de cáncer de mama en ratones, mostrando una disminución de sus tumores y
aumentando su esperanza de vida (Dehghan-Manshadi et al., 2021). Por consiguiente, cientos de
PAMs han sido probados contra casi todas las bacterias, virus y parásitos. La mayoría de los
PAMs tienen una indiscutible función frente a bacterias Gram (-) y Gram (+) y su actividad
frente a bacterias patógenas ha sido su principal campo de aplicación (Jahangiri et al., 2021).
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3 Justificación
La agricultura desempeña un papel crucial en Colombia al formar parte de las bases del
sistema económico; no sólo proporcionando alimentos y materias primas, sino también
oportunidades de empleo, lo cual representa ganancias económicas para las regiones productoras;
en el país se produce cerca de 632 mil toneladas de tomate, siendo una hortaliza fácilmente
cultivada dentro del territorio colombiano donde su producción impulsa principalmente las
regiones de Santander, Boyacá y Antioquia. Durante el año 2015 se cultivaron en Colombia
cerca de 34.441 hectáreas, las cuales tuvieron una producción cercana a las 110 mil toneladas.
Además, el DANE afirmó para la misma fecha que los cultivos de cebolla tuvieron una
producción de 196.920 toneladas, con rendimientos promedios de 21,4 toneladas por hectárea al
año; siendo el departamento de Boyacá el principal productor seguido por los departamentos de
Cundinamarca, Norte de Santander y Santander. Por su parte, otro cultivo de importancia es la
arveja, siendo la segunda leguminosa de mayor importancia Según la Encuesta Nacional
Agropecuaria (DANE, 2020).
Esto cultivos sin lugar a dudas, representan la base de la economía de muchos
departamentos en Colombia y que como se mencionó anteriormente son susceptibles a ser
infectados por bacterias fitopatógenas como Pseudomonas sp (Argerich et al., 2013; Blanco,
2006). Los agricultores utilizan compuestos bactericidas para controlar la enfermedad (por
ejemplo, Oxicloruro de cobre); sin embargo, esta práctica podría causar graves daños al medio
ambiente y la salud humana y también promueve la selección de cepas patógenas con mayor
tolerancia al cobre (Velásquez Alcalá et al., 2014).
En este sentido, en la búsqueda de nuevos agentes antimicrobianos, péptidos nativos
derivados de las proteínas Cry producidas por Bt se proponen como una posible alternativa. Los
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 24
PAMs que suelen tener varias dianas de acción (membrana bacteriana e inhibición de proceso a
nivel intracelular), permitiendo combatir la resistencia antimicrobiana gracias a sus cargas
catiónicas que suelen interferir en la síntesis y plegamiento de proteínas a nivel intracelular
(Prada-Prada et al., 2020; Téllez & Castaño, 2010). A nivel de membrana sus mecanismos de
interacción con los componentes de las membranas bacterianas como los ácidos teicoicos,
lipoteicoicos en Gram-positivos y su interacción con las cargas negativas de los lipopolisacáridos
como es el caso del género de Pseudomonas (Yudina et al., 2007).
Basados en estas consideraciones, en la presente investigación se evaluaron estos
fragmentos peptídicos, como nuevos posibles agentes antimicrobianos, buscando identificar,
mediante ensayos in-vitro, los residuos involucrados en dicha actividad frente a Pseudomonas sp,
así como proponer y evaluar estos fragmentos peptídicos derivados de Cry46Aa1 para
reconocimiento de regiones que desencadenará en mejorar la actividad antimicrobiana. Donde se
obtuvo información sobre la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima
Bactericida (CMB) de estos Péptidos Antimicrobianos (PAM), A su vez, se obtuvo información
acerca la capacidad hemolítica de dichas regiones de interés.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 25
4 Pregunta de Investigación
¿Cuál es la actividad antimicrobiana y hemolítica de fragmentos peptídicos derivados del
dominio I de la toxina Cry46Aa1 frente a la bacteria fitopatógena Pseudomonas sp?
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5 Marco Teórico
5.1 Especies de Pseudomonas Patógenas en Plantas
5.1.1 Descripción
Uno de los grupos más variados y complejos de Gram-negativos es la bacteria del género
Pseudomonas (P.) (Figura 1), ya que contiene un gran número de especies (más de 203) y se
puede aislar de muchos abióticos diferentes (suelo, agua, aire) y ambientes bióticos (humanos,
animales, tejidos vegetales) (Barreteau et al., 2009).
Figura 1
Representación Esquemática de Pseudomonas sp
Nota. Representación esquemática: 1 = Citoplasma, 2 = Nucleoide, 3 = Membrana citoplasmática, 4 = flagelo, 5 =
Ribosoma, 6 = pared celular, 7 = cápsula, 8 = Pillis o fimbrias, 9 = Biofilm. Imagen realizada en (Bio Render, 2021).
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 27
Sus interacciones con las plantas son extensas: algunas tienen funciones como
rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPR) al estimular la síntesis de
fitohormonas como la auxina y giberelina y mejorando la biodisponibilidad de ciertos nutrientes
como el nitrógeno y el fosfato por solubilización (Marcelletti & Scortichini, 2014). Algunas
especies tienen actividad antagonista hacia los fitopatógenos (hongos, nematodos, levaduras,
bacterias) produciendo antibióticos, activando resistencia de las plantas, o mediante la exclusión
competitiva, como la competencia por el carbono y el hierro (Beiki et al., 2016).
El género Pseudomonas también contiene especies fitopatógenas distribuidas dentro del
linaje Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens) en varios grupos y subgrupos filogenéticos. La
mayoría de las plantas las especies patógenas se concentran en Pseudomonas syringae, especie
que se considera la primera en el Top 10 de bacterias patógenas de plantas, además grupo
filogenético con al menos 14 especies (Oueslati et al., 2019).Otras se ubican en el grupo de
Pseudomonas putida (Pseudomonas monteilii) o en el grupo de P. fluorescens. En este último
grupo, los patógenos vegetales son encontrados dentro del subgrupo de Pseudomonas corrugata
(P. corrugata y Pseudomonas mediterranea), el subgrupo de P. fluorescens (Pseudomonas
constantinii, Pseudomonas lurida, Pseudomonas marginalis, Pseudomonas orientalis,
Pseudomonas tolaasii, Pseudomonas panacis y Pseudomonas simiae) y en el subgrupo de
Pseudomonas koreensis (Pseudomonas moraviensis).
En algunos estudios, Beiki y col., (Beiki et al., 2016) caracterizaron 5 nuevas especies
putativas de Pseudomonas que han demostrado ser patógenas para los cítricos:
P. orientalis, P. simiae, P. lurida, P. moraviensis y P. monteilii de una selección de 126 cepas de
Pseudomonas aisladas de hojas y tallos de cítricos enfermos en el norte de Irán. Las 126 cepas se
estudiaron utilizando un enfoque polifásico que incluyó caracterizaciones fenotípicas y análisis
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 28
de secuencias filogenéticas multilocus. La patogenicidad de estas cepas frente a 3 cultivos de
cítricos se demuestra en estudios de campo y de invernadero. Las cepas se agruparon
inicialmente fenotípicamente y por sus secuencias parciales del gen rpoD en 11 grupos
coherentes en la P. fluorescens linaje filogenético. Se seleccionaron y analizaron 53 cepas que
son representantes de los 11 grupos mediante la secuenciación parcial de sus genes 16S rRNA y
gyrB. Las secuencias parciales individuales y concatenadas de los tres genes se utilizaron para
construir los árboles filogenéticos correspondientes. La mayoría de las cepas se identificaron a
nivel de especie: P. lurida (5 cepas), P. monteilii (2 cepas), P. moraviensis (1 cepa), P. orientalis
(16 cepas), P. simiae (7 cepas), P. Syringae (46 cepas, distribuidos filogenéticamente en al
menos 5 patovares), y P. viridiflava (2 cepas).
Recientemente, Ouestlati y col (Oueslati et al., 2019) aislaron una colección de cepas de
Pseudomonas en diferentes regiones de Túnez en el período 2016-2017 a partir de frutos y hojas
de Citrus sinensis cv. y Citrus limon cv. Plantas con síntomas de explosión y enfermedad de
hoyo negro. En este estudio se realizó un análisis filogenético del gen de mantenimiento rpoD
para la identificación de cepas a nivel de especie. Los resultados demostraron la afiliación de
estas cepas con el género Pseudomonas y revelaron la presencia de 11 cepas que representan dos
nuevas especies putativas en dos ramas monofiléticas alas que denominaron: Pseudomonas
kairouanensis sp. nov. y Pseudomonas nabeulensis sp. nov.
5.1.2 Caracterización
Las cepas de Pseudomonas se pueden analizar morfológica y genotípicamente mediante
análisis de secuencia multilocus de la secuencia de genes rpoD, gyrB y 16S rRNA (rrs) (Oueslati
et al., 2019), y sus características fenotípicas por API 20NE y Biolog GEN III (Salazar de Vegas
et al., 2008). También, se pueden determinar los perfiles de proteínas principales y de ácidos
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 29
grasos por espectrometría de masas MALDI-TOF de células completas (Maldonado et al., 2018).
Las cepas también se han caracterizado por técnicas como REP-PCR y PCR Melting Profile
(PCR MP) para determinar el potencial de diversidad genética entre las cepas (Wei et al., 2020).
5.1.3 Patogénesis
Las Pseudomonas fitopatógenas causan enfermedades importantes en una variedad de
cultivos y los síntomas incluyen cancros, manchas de hojas y tallos, tizón, podredumbre blanda y
agallas. Los factores importantes de patogenicidad y virulencia son el sistema de secreción de
tipo III, la actividad de nucleación del hielo, la producción de metabolitos secundarios como las
fitotoxinas, las enzimas pectolíticas, los exopolisacáridos y la producción de hormonas
(Marcelletti & Scortichini, 2014).
Debido a la gran cantidad de especies de Pseudomonas fitopatógenas que existen, a
continuación, se resumen en la Tabla 1 se resumen las principales especies, cultivos que afectan
y enfermedades que producen (Beiki et al., 2016).
Tabla 1
Resumen de Pseudomonas Fitopatógenas, Cultivos que Afecta y Enfermedades/Síntomas que
Produce.
Pseudomonas patógenas Cultivo que afecta Enfermedad o síntomas
Pseudomonas agaric Agaricus bisporus
(Champiñón)
Branquias que gotean
Pseudomonas asplenii Asplenum nidus (Helecho
nido)
Mancha foliar y tizón
Pseudomonas cichorii Amplia gama de huéspedes Manchas de hojas y tallos
Pseudomonas constantinii Agaricus bisporus
(Champiñón)
Mancha marrón
Pseudomonas corrugata Solanum lycopersicum
(Tomate)
Necrosis de la médula
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 30
Tabla 1 (Continuación)
Pseudomonas patógenas Cultivo que afecta Enfermedad o síntomas
Pseudomonas fuscovaginae Oryzae sativa (Arroz)
Pudrición parda de la vaina
foliar
Pseudomonas marginalis
pv. Alfalfae
Medicago sativa (Alfalfa) Raíz parda, atrofia
Pseudomonas marginalis
pv. Marginalis
Amplia gama de huéspedes Necrosis marginal de la hoja,
pudrición blanda
Pseudomonas marginalis
pv. Pastinacea
Pastinaca sativa (Apio de
campo)
Pudrición parda de las raíces,
pudrición blanda
Pseudomonas mediterranea Solanum lycopersicum
(Tomate)
Necrosis de la médula
Pseudomonas palleroniana Oryzae sativa (Arroz) Débilmente patógeno para el
arroz
Pseudomonas salomonii Allium sativum (Ajo)
Enfermedad del café con
leche
Pseudomonas tolaasii Agaricus spp (Hongos) Mancha marrón
Pseudomonas kairouanensis
Pseudomonas nabeulensis
Citrus sinensis
Citrus limon
Explosión y enfermedad de
hoyo negro
Pseudomonas orientalis
Pseudomonas syringae
Pseudomonas. Viridiflava
Pseudomonas lurida
Pseudomonas simiaelas
Citrus macrophylla
Citrus sinensis
Citrus aurantium
Explosión de los cítricos y la
enfermedad del hoyo negro
Nota. Las enfermedades más comunes dentro de los cultivos de interés causadas por las especies fitopatógenas mas
importantes del genero de Pseudomonas
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 31
La mayoría de las especies patógenas de este género infectan a las plantas y sólo algunas
de ellas a los animales y al hombre, donde cabe destacar que la Pseudomonas aeruginosa es el
ejemplo de patógeno oportunista de los humanos y Pseudomonas syringae es el patógeno de las
plantas más común, estas últimas se denominan Pseudomonas fluorescentes puesto que, al crecer
en un medio nutritivo con bajo contenido de hierro producen pigmentos fluorescentes, de color
verde amarillo y con capacidad de difundirse.(Slabbinck et al., 2010)
Las infecciones bacterianas provocadas por Pseudomonas sp destruye numerosos cultivos
de interés económico en zonas tropicales y subtropicales, siendo difícil de combatir puesto que
es un patógeno multirresistente y fácilmente adaptable en el ambiente (González et al., 2009),
Donde este género produce gran cantidad de biopelículas, causantes de infecciones crónicas y a
su vez responsable de la resistencia contra algunos agroquímicos. Estas sustancia son
poliméricas altamente ordenadas, en hoja β cruzada, una estructura cuaternaria y capacidad de
auto ensamblé (Rouse et al., 2018) razón por la cual Pseudomonas sp se adhiere a las superficies
de la planta y utensilios utilizados en la agricultura, impidiendo un correcto control o
eliminación. El género Pseudomonas está compuesto por más de 100 especies, entre las especies
más fitopatógenas se encuentran: Pseudomonas cichorii causante de pérdidas postcosecha en
endivias (Cichorum endivia L.)(Alippi et al., 2002); Pseudomonas syringae causante de pecas
bacterianas en tomate y con más de 267 serotipos (Cai et al., 2011); Pseudomonas fluorescens
Migula causante de enfermedades en tomate (Solanum lycopersicum L.) y brócoli (Brassica
oleracea L.) (Pérez Álvarez et al., 2015); Pseudomonas solanacearum causante de la marchitez
bacteriana en papa (Alvarado-Martínez, 2013); Pseudomonas caryophyllí causante de la
marchitez vascular en el clavel y Pseudomonas marginalis la cual produce el ojo rosado en papa
y pudrición blanda (Peña sanchez & Paez mendieta, 2005).
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 32
5.2 Impacto Ambiental por Utilización de Agroquímicos
Actualmente la explotación de los recursos naturales, más específicamente el recurso
agua, se está viendo cada vez más afectado por la actividad del hombre; lo que generan gran
escasez del recurso y compromete la calidad del mismo. Esto se debe, en mayor proporción a
actividades agroindustriales que a través de vertimiento o filtración de los desechos producidos
directamente al agua; de arroyos, manantiales, ríos y mares, empeoran la condiciones físico-
químicas del líquido y por ende generan impactos negativos al ambiente en general. Por otra
parte, la contaminación con químicos peligrosos y sólidos es uno de los mayores problemas
provocado por la agricultura intensiva; entre estos contaminantes se destacan los compuestos
xenobióticos por su alta toxicidad y dificultad para ser degradados afectando la salud de las
poblaciones aledañas (Zayas, 2014).
Gran cantidad de sustancias xenobióticas son utilizadas en la agricultura, algunas de estas
sustancias son: compuestos químicos orgánicos e inorgánicos, representando un serio problema
para el ambiente por su genotoxicidad. Para ello, se tiene en cuenta el desarrollo y utilización de
nuevos métodos que generen un menor impacto ambiental. Por lo tanto, la utilización de
microorganismos (Bacterias, Hongos, algas, protozoos etc.) o metabolitos (proteínas, enzimas,
toxinas) que puedan ser utilizados para metabolizar, transformar, retener, mineralizar o para el
control biológico surgen como una alternativa que nos permite reducir el impacto ambiental
generado por los agroquímicos.
Así mismo, el sector agrícola representa aproximadamente el 70% de todas las
extracciones de agua dulce a nivel mundial (WWAP (Programa Mundial de Evaluación de los
Recursos Hídricos de las Naciones Unidas), 2017) o Según (OECD, 2017) se prevé que entre el
2000 y el 2050 la demanda mundial de agua para la producción industrial aumentará un 400%.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 33
Cabe resaltar que se estima que para los próximos 30 años habrá un incremento del 10% al 15%
en la carga de nitrógeno que aportan los ríos a los ecosistemas costeros (Gleeson & Wada, 2012),
hundimiento del suelo y la intrusión de agua salada, todo esto debido a la demanda por la
producción de alimentos asociados al crecimiento de la población.
5.3 Proteínas Cry y Péptidos Antimicrobianos Derivados como Alternativa de
Agroquímicos Comerciales
Por otra parte, respecto a estudios donde se evaluaron péptidos antimicrobiano
encontramos que se evaluó el péptido BTM-P1 (Arias et al., 2009), que se deriva de la secuencia
de aminoácidos de la protoxina Cry11Bb1, muestra que los péptidos policatiónicos, causan la
permeabilización de la bicapa lipídica en biomembranas, de modo potencial-dependiente.
Además, este grupo de moléculas ampliamente versátiles hace parte del sistema de defensa del
huésped de muchos organismos, incluidos insectos, plantas y animales, La mayoría de estos tipos
de péptidos demuestran actividad frente a bacterias, hongos y protozoos, igualmente el creciente
número de organismos patógenos con resistencia a antibióticos convencionales, ha despertado
interés en aplicaciones de péptidos antimicrobianos para tratar infecciones, por ejemplo los
péptidos diseñados (BTM-P1, α2a hélix) extraídos del serotipo Bt, demostraron que BTM-P1
puede inducir la inflamación mitocondrial y causan desacoplamiento del sistema de fosforilación
oxidativa. Asimismo, se ha demostrado una inhibición del crecimiento frente bacterias Gram-
positivas y Gram-negativas a una concentración de 7.1 µM. (Mary et al., 2007).
En otros trabajos similares se han cuestionado la inocuidad de las proteínas Cry
producidas por Bt para las células de mamíferos, así como para el microbiota de los mamíferos.
Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo evaluar los efectos citotóxicos y antimicrobianos de
dos proteínas Cry (Cry8Ka5 y Cry1Ac), una de esta la Cry1Ac es ampliamente distribuida en
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 34
cultivos transgénicos. Se determinó la citotoxicidad en eritrocitos de mamíferos de estas dos
proteínas, así como ensayos de actividad antimicrobiana, donde no se mostró inhibición del
crecimiento de los microorganismos analizados (Farias et al., 2014). Acerca de la capacidad de
las proteínas Cry, y algunos fragmentos de estas proteínas, con dicha capacidad de limitar o
inhibir el crecimiento bacteriano, encontramos un estudio donde se midió la actividad de
diferentes proteínas Cry frente a bacterias anaeróbicas y arqueas: Clostridium butyricum,
Clostridium acetobutylicum y Methanosarcina barkeri (M. barkeri). La microscopía mostró que
la lisis de las células de M. barkeri en presencia de un fragmento de 49 kDa de la toxina Cry3Aa
es generalmente similar a la lisis de células bacterianas, que se ha detectado previamente en
presencia de Cry11A, Cry1Ab y otras proteínas Cry. Además, la Cry1D tomada de una
subespecie Bt, mostró que algunos de sus componentes como el ácido teicoico y la N-
acetilgalactosamina tienen una posible influencia sobre las toxinas Cry, mejorando su actividad
antimicrobiana (Yudina et al., 2007).
En otros estudios realizados por Kim y cho., en el 2020 (Kim et al., 2020), se evaluaron
dos péptidos PA2 y GNU7 los culés no presentaron alta actividad antimicrobiana, mientras que
sus hibrido PA2-GNU7 mostro mejor actividad específica frente a P. aeruginosa, cepa resistente
a múltiples fármacos, donde La concentración mínima inhibitoria (MIC) de PA2-GNU7 contra P.
aeruginosa fue 2 µM. Sin embargo, no presenta dicha actividad contra otras especies de
Pseudomonas.
Otros estudios similares fueron realizados por Wong y col., (Won et al., 2009) donde
probaron péptidos Gaegurinas (GGN) antimicrobianos aislados de una rana rugosa con
aproximadamente 10-50 aminoácidos, estos péptidos demostraron un amplio espectro de
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 35
actividad antimicrobiana contra Bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, hongos y
protozoos, con baja actividad hemolítica.
5.4 Actividad Hemolítica
Según (Barros Meza, J., Cabrera Álvarez, J., Fuentes Forero, J., & Garcés Wilches, 2016)
para cuantificar la citotoxicidad en eritrocitos, normalmente se emplea la medida de la
concentración letal 50, la cual consiste en que la sustancia produzca la muerte de la mitad de la
población celular, al estar expuesta por dicho compuesto por un período determinado, donde se
evalúan diferentes concentraciones del compuesto con el fin de evidenciar los efectos tóxicos y
la mortalidad de los eritrocitos.
Se han cuestionado la inocuidad de las proteínas Cry de Bt para las células de mamíferos,
así como para su microbiota. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo evaluar los efectos
citotóxicos y antimicrobianos de dos proteínas Cry, Cry8Ka5 y Cry1Ac, una de ellas la Cry1Ac
es ampliamente distribuida en cultivos transgénicos. Se determinó la citotoxicidad en eritrocitos
de mamíferos de estas dos proteínas, así como ensayos de actividad antimicrobiana, donde no se
mostró inhibición del crecimiento de los microorganismos analizados (Farias et al., 2014).
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 36
6 Marco Legal
El aislamiento HSL30 se recolectó en el marco del proyecto 1299-12-17827 titulado:
caracterización de la enzima acíl homoserina lactonasa de una cepa de Bacillus thuringiensis y la
búsqueda de nuevos microorganismos productores de lactonasas y acilasas de potencial uso
biotecnológico, desarrollado en la Universidad de Santander, de diciembre de 2005 a diciembre
de 2008 con el apoyo de la Corporación para investigaciones Biológicas CIB y la Universidad
Nacional sede Medellín. La validación de la colección biológica se encuentra en curso, pues la
colecta se realizó previo a la entrada en vigor de los decretos 1375 y 1376 del Ministerio de
Medioambiente y Desarrollo Sostenible.
Este proyecto se anida dentro del programa de Colombia científica NanoBiocáncer, a
través del proyecto de la convocatoria 811 de 2018, estancias posdoctorales. En ese sentido, las
consideraciones éticas que avalan ambos proyectos abarcan el desarrollo de este. Brevemente,
dentro de este proyecto se utilizó eritrocitos humanos, obtenidos por un donante voluntario, al
que se le aplicó el consentimiento informado estándar para la recolección de material biológico
humano, en este consentimiento se señaló que el uso exclusivo del material era para las pruebas
de hemólisis de los péptidos, en ese sentido el título 4 de las Pautas CIOMS corresponde a un
estándar de riesgo mínimo en donde se realizó una única toma de 10 ml de sangre. Posterior a los
ensayos de hemólisis el material remanente fue descartado según lo señalan las políticas
institucionales para el manejo de residuos peligrosos. Dado que estas muestras colectadas no se
almacenaron y no constituyen el foco central de la investigación, no se aplican las pautas CIOMS
en su título 11 (Recolección, Almacenamiento Y Uso De Materiales Biológicos Y Datos
Relacionados).(CIOMS & OMS, 2016).
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 37
Según el material utilizado, la naturaleza del proyecto y su contexto, que no involucra
aplicación de los péptidos evaluados en humanos, no se trabajó con derivados de células
humanas, tejidos o material similar, no se le aplican la Declaración de Helsinki, el código de
Nuremberg, la resolución 2378 de 2008 o el tratado Belmont en ninguno de sus apartados.
De acuerdo a la resolución 8430 DE 1993, Por la cual se establecen las normas
científicas, técnicas y administrativas para la investigación en salud. Este proyecto no está
enmarcado en ninguno de los numerales contemplados en los títulos I, II y III, puesto que no
involucra ningún tipo de trabajo en humanos o dirigido a Humanos. Para el título IV, “De la
Bioseguridad de las Instalaciones”. Los requerimientos enunciados en el Capítulo I, Artículo 63
respecto a las instalaciones en las que se realice investigación con microorganismos patógenos o
material biológico que pueda contenerlos se cumplen a cabalidad. En el Numeral d, no se
requiere vigilancia médica del personal involucrado en esta investigación. Según lo estipulado en
el Artículo 64 el Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología de la Universidad de
Santander, UDES donde se desarrolló la propuesta de Investigación, se clasifica como
Laboratorio Básico de Microbiología; y los microorganismos que se manipularan durante el
desarrollo de la propuesta corresponden al Grupo de Riesgo I, según la clasificación del Artículo
67, su manejo se realizó de acuerdo a los parámetros establecidos por la Universidad de
Santander, UDES.(Colombia, 2012).
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 38
7 Objetivos
7.1 Objetivo General
Evaluar la actividad antimicrobiana y hemolítica de fragmentos peptídicos nativos
derivados del dominio I de la Cry46Aa1 frente a una especie fitopatógena de Pseudomonas sp y
eritrocitos de mamíferos, respectivamente.
7.2 Objetivos Específicos
Determinar la cinética de crecimiento del fitopatógeno Pseudomonas sp en
presencia de los fragmentos derivados de Cry46Aa1 al estar expuesta a diferentes
concentraciones.
Determinar la actividad antimicrobiana de fragmentos peptídicos nativos de
Cry46Aa1 frente a la bacteria Pseudomonas sp fitopatógena.
Evaluar la citotoxicidad de los fragmentos peptídicos nativos de la proteína
Cry46Aa1 en eritrocitos de mamíferos.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 39
8 Hipótesis
8.1 Hipótesis de Investigación
Los péptidos nativos derivados del dominio I de la Cry46Aa1 presentan actividad
antimicrobiana frente a especies fitopatógenas de Pseudomonas sp y no presentan actividad
hemolítica frente a eritrocitos de mamíferos.
8.2 Hipótesis Nula
Los péptidos nativos derivados del dominio I de la Cry46Aa1 no presentan actividad
antimicrobiana frente a especies fitopatógenas de Pseudomonas sp, sin embargo, estos presentan
actividad citotóxica frente eritrocitos de mamíferos.
8.3 Hipótesis Alternativa
Los péptidos nativos derivados del dominio I de la Cry46Aa1 no presentan actividad
antimicrobiana, ni citotóxica frente al fitopatógeno Pseudomonas sp y eritrocitos,
respectivamente.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 40
9 Metodología
9.1 Diseño de Estudio
Estudio de investigación experimental.
9.2 Esquema Metodología
La metodología desarrollada comprendió las etapas de la Figura 2.
Figura 2
Esquema General de la Metodología.
Nota. Este fue el esquema utilizado para analizar los compuestos P264- G274, Loop1-PS2Aa y Loop2-PS2Aa también
denominados 3891, 3897 y 3899 respectivamente
9.3 Materiales y Métodos
La presente investigación se realizó en el Laboratorio de Biología Molecular y
Biotecnología (Biomol) de la Universidad de Santander (UDES).
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 41
La cepa utilizada en la investigación fue HSL30 la cual presenta un 98% de homología
para Pseudomonas sp según los análisis de secuencia, mostrados en el proyecto 1299-12-17827,
donde además se evaluó su capacidad para causar afectaciones en rodajas de papa, con
aproximadamente 108 UFC mostrando una capacidad de infección en esta solanácea importante
dentro de la agricultura, La cepa HSL30 se obtuvo de un aislado de suelos contaminados con
órgano clorados en Agustín Codazzi (Departamento del Cesar), los cuales se encontraban cerca de
cultivos de papa y tomate con sintomatología referente al género Pseudomonas (Sánchez et al.,
2013)
9.3.1 Propiedades Fsicoquímicas de los Péptidos
Los péptidos sintéticos: P264-G274, Loop1-PS2Aa y Loop2-PS2Aa fueron utilizados
para la realización de los ensayos propuestos. Estos compuestos fueron sintetizados mediante la
estrategia F-moc en bolsitas de té, purificados en una columna C-18, caracterizados por
Cromatografía líquida de alta resolución acoplada a la espectrometría de masas (LC-MS) y
Dicroísmo Circular (DC) en el Laboratorio de Síntesis de Péptidos de la Pontificia Universidad
Católica de Valparaíso (PUCV), Valparaíso-Chile y se encontraban disponibles en el Grupo de
Investigación de Biología Molecular y Biotecnología (Biomol) de la Universidad de Santander
(UDES).
Inicialmente, se preparó una solución stock de cada uno de los péptidos en tampón
fosfato de sodio (10 mM pH 7,2) y los compuestos fueron almacenados hasta su uso a -80 ° C.
En la (Tabla 2) se pueden apreciar las secuencias de los péptidos nativos y sus propiedades
fisicoquímicas, las cuales fueron calculadas en el servidor de péptidos (Bachem AG, 2020).
La selección de los compuestos se realizó teniendo en cuenta los datos obtenidos a partir
de los análisis de Biología Computacional (BC) de las regiones de Cry46Aa1 que posiblemente
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 42
presente interacción con membranas biológicas. Los péptidos evaluados fueron: 2 péptidos
derivados del Loop1 y Loop2 denominados: Loop1-PS2Aa y Loop2-PS2Aa, y un péptido
derivado del dominio I denominado P264-G274.
9.3.2 Activación de la Cepa HSL30
Para la activación de la cepa HSL30, se realizó en un criovial del aislado de Pseudomonas
sp. Posteriormente, se inocularon 100μL en caldo nutritivo (CN) por 24h a 37°C, el cual contiene
peptona y la glucosa (C6H12O6) que brindan nutrientes, donde las peptonas son fuentes de
nitrógeno orgánico, carbono, azufre y vitaminas. La glucosa es la fuente de carbohidratos
(Condalab, 2019), estos componentes permiten la recuperación efectiva en el cultivo de
Pseudomonas sp.
Posteriormente, la cepa activada en CN se pasó a un medio Agar Müller Hinton (MH) y
Müller Hinton Caldo (MHC), buscando adaptar la cepa antes de los ensayos antimicrobianos, este
medio es utilizado para las pruebas de sensibilidad y susceptibilidad de las baterías frente
antimicrobianos (HiMedia, 2016). Por lo anterior, se utilizó en este estudio para evaluar la cinética
de crecimiento, la Concentración Mínima Inhibitoria media (CMI50) y Concentración Mínima
Bactericida (CMB), además de ser el medio utilizado para preparar las concentraciones peptídicas
de los fragmentos de Cry46Aa1 y el oxicloruro de cobre como control positivo.
9.3.3 Cinética de Crecimiento
Con el fin de conocer las fases de crecimiento y adaptación del microorganismo
Pseudomonas sp se determinó su cinética de crecimiento. En breve, se adicionaron 5 mL de
inóculo del microorganismo de interés (Pseudomonas sp) y 45 mL del medio Müller Hinton
Caldo (MHC) (pH 6.5). Luego, el caldo de cultivo se incubó (incubadora Shaker®) con agitación
constante a 100 rpm y 37°C. Posteriormente, se evaluó el crecimiento de la cepa durante 13
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 43
horas, realizando mediciones cada hora por medio de una densidad óptica de 600 nm
conociendo la absorbancia y un valor aproximado de células/mL dada por el equipo (BIO-RAD
SmartspecTM Plus) (Engel, 2011), . En cada medición se determinó el conteo de
microorganismos viables en Unidades Formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) utilizando
el método de siembra en placa con agar Müller Hinton (MH). Las siembras se realizaron
utilizando diluciones desde 10-1 hasta 10-9 en solución salina al 0,7%. Las cajas fueron incubadas
por 24 h a 37°C y las colonias fueron contadas. Se tuvo en cuenta únicamente las cajas de Petri
con conteos entre 30 y 300 colonias. Las siembras se realizaron por triplicado con el fin de tener
mayor confianza mediante un promedio de UFC/mL (Jurado-Gámez et al., 2015). Partiendo de
estos resultados la cinética de crecimiento se inició a una concentración de 17x106 UFC/mL
expresando los resultados mediante una curva de crecimiento donde se compara la OD600 y las
UFC/mL (Hernández-García & Acebo-González, 2013).
9.3.4 Estandarización del Inoculo Mediante Absorbancia
Con el fin de facilitar la preparación del inoculo y tener mayor claridad de las UFC/mL
presentes al inicio de cada ensayo, se implementó el método de turbidimetría fundamentado
como un fenómenos ópticos, permitiendo mediciones con buena linealidad y seguridad, siendo
altamente utilizado en los procesos de cinética microbiana y procesos biotecnológicos, otorgando
una mayor estabilidad del proceso y alta tasa de reproducibilidad (Hernández-García & Acebo-
González, 2013). las mediciones de absorbancia se realizaron a una longitud de 600 nm para
conocer la concentración bacteriana, teniendo en cuenta la concentración inicial en la cinética de
Pseudomonas sp, se utilizó el OD600, buscando obtener una absorbancia igual a 0.1, para esto se
dejó el inoculo 12h y se realizaron diluciones hasta obtener la lectura requerida.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 44
9.3.5 Ensayo de Actividad Antimicrobiana
La evaluación de la actividad antimicrobiana de los péptidos frente a Pseudomonas sp, se
determino como se ha documentado previamente (Chen et al., 2017).
9.3.5.1 Concentración Mínima Inhibitoria Media (CMI 50). La concentración mínima
inhibitoria media (CMI 50) se determinó mediante el método de microdilución descrito en el
protocolo m07-a9 del clinical and laboratory standards institute (Clinical Laboratory Standards
Institute, 2018). brevemente, se colocaron diluciones de los péptidos P264-G274, Loop1-PS2Aa y
Loop2-PS2Aa en caldo Müller Hinton (MHC) en una microplaca de 96 pocillos a concentraciones
en el intervalo de (75, 100 y 150, 200, 300, 400, 500 μM). Se utilizó Oxicloruro de cobre como
control positivo en la concentración de 2g/L como se recomienda (Argerich et al., 2013), mientras
que el caldo correspondiente sin péptido se utilizó como control negativo. El preinóculo bacteriano
se preparó a partir de un subcultivo de Pseusomonas sp en MHC incubado durante 18-24 horas a
37 ± 2˚C. La suspensión de bacterias se diluyo a 1x108 unidades formadoras de colonias UFC/mL,
obteniendo una turbidez equivalente a 0,5 en la escala de McFarland, confirmada por
espectrofotometría al alcanzar una absorbancia entre 0.08-0.1 a una longitud de onda de 600 nm;
obteniendo una concentración final de 17 x106 UFC/mL para posteriormente añadir la suspensión
bacteriana a la placa de 96 pocillos que contenía los péptidos diluidos previamente. Después, la
absorbancia de cada pocillo a 600 nm (OD600) se midió usando un lector de microplaca (Varioskan
Lux, Thermo Fisher Scientific Inc. MA, EE. UU.) El volumen final de 200 μL por pocillo consistió
en 100 μL del compuesto y 100 μL de la suspensión bacteriana, estas a una concentración de 2x
para compensar la dilución. La Concentración Mínima Inhibitoria media (CMI50) se definió como
la concentración más baja de péptido que previene el crecimiento del 50% de la población
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 45
bacteriana al observar absorbancias bajas en comparación a la cinética de Pseudomonas sp, Todos
los resultados fueron el promedio de tres medidas independientes.
9.3.5.2 Concentración Mínima Bactericida (CMB). La CMB se determinó como se
describe en el Protocolo M26-A del CLSI, 1999 (Prada-Prada et al., 2020). Para este caso, se
inocularon subcultivos en placas de agar nutritivo, agregando 100 μL de los pocillos tratados con
péptidos que en el ensayo de CMI50 no muestren un crecimiento visible del microorganismo. Los
cultivos de agar nutritivo se incubaron a 37 ± 2˚C durante 18-24 horas, y se estimó el número de
UFC. La CMB se interpretó como la concentración de compuesto en el que el recuento de
colonias fue igual o inferior a 10.
9.3.6 Determinación del Porcentaje de Hemólisis de los Péptidos Nativos en Eritrocitos de
Humano
Se determinó la hemólisis en eritrocitos humano midiendo el porcentaje de células no
viables inducida a diferentes concentraciones de los compuestos en un rango de concentración de
75 a 150 µM. Como control positivo se utilizó una suspensión que contenía los eritrocitos y
Tritón X-100 al 1%. Esta combinación desordena la membrana en todos los niveles y mediante
mecanismos independientes la solubiliza produciendo un 100% de hemólisis. El porcentaje de
hemólisis se calculó mediante la siguiente ecuación: (%) Hemolisis = ((As+A0) /(A100-A)) x
100%.
Donde As es la absorbancia de la muestra que es evaluada, A100 es la absorbancia de los
eritrocitos lisados en 0,1% Tritón X-100 y A0 es la absorbancia sin presencia de hemólisis.
Todos los ensayos se realizaron por triplicado (Fern et al., 2010). Los péptidos que presentaron
baja hemólisis (<20%) fueron utilizados en las siguientes fases a nivel experimental.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 46
9.3.7 Análisis de los Resultados
Todos los ensayos experimentales se realizaron por triplicado en 3 ensayos
independientes y los resultados obtenidos se analizaron en el software estadístico Graphpad
Prism 9, mediante un análisis one-way ANOVA y Tukey. Además, se determinó el promedio, la
desviación estándar, el coeficiente de variación teniendo en cuenta las réplicas en los ensayos al
analizar los compuestos P264-G274, Loop1-PS2Aa, loop2-PS2Aa y Oxicloruro de cobre con sus
concentraciones (75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 μM y 2g/L) mediante gráficos, tablas,
esquemas, entre otros.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 47
10 Resultados y Discusión
10.1 Estructura Secundaria In Silico de los Péptidos
En la (Figura 3), se muestra la estructura secundaria in silico de los péptidos obtenidos
con el software PEP-FOLD 3.5 , en la cual se puede observar que los péptidos que presentan una
estructura simulada de α-hélice (Lamiable et al., 2016).
Figura 3
Estructura Secundaria de Péptidos
Nota. estructura secundaria teórica in silico de P264- G274, Loop1-PS2Aa y Loop2-PS2Aa también denominados
3891, 3897 y 3899 respectivamente
La concentración inicial de cada uno de los péptidos del dominio 1 de la proteína
Cry46Aa1 fue determinada por espectrometría UV-Vis a una longitud de onda de 220 y 280 nm
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 48
(Tabla 2). Partiendo de estas concentraciones se prepararon soluciones stock de 500 µM en un
tampón fosfato de sodio (10 mM pH 7,2).
Tabla 2
Secuencia de Péptidos Nativos Derivados del Dominio 1 de Cry46Aa1 y sus Propiedades
Fisicoquímicas.
Péptido Secuencia PM
[g/mol]
Carga
neta a
pH
7.0
Hidrofilicidad
media
Residuos
hidrófilos
/N° total de
residuos
Concentración
inicial [µM]
P264-
G274
(3891)
PARDV**
TTSG-NH2 1129.24 +1 0,2 36%
1274.2
Loop1-
PS2Aa
(3897)
NNETY**
AVKP-
NH2
1295.42 +1 -0,1 45%
1251
Loop2-
PS2Aa
(3899)
TYFNA**
PPITA-
NH2
1320,55 +2 -0,6 17%
3041
Nota. Los péptidos fueron cuantificados por espectrometría UV-Vis y sus datos de concentración están expresados
en μM, Los asteriscos pueden corresponder a los aminoácidos= L, F, N, V y K(Peso molecular (PM), Punto
isoeléctrico (pI), estas propiedades fueron calculadas utilizando el software (Bachem AG, 2020)
Para llevar acabo los ensayos de este trabajo, lo primero que se hizo fue determinar las
propiedades físico-químicas de los fragmentos peptídicos derivados de Cry46Aa1, como se
aprecia en los resultados de la Tabla 2, donde se muestra que en el péptido perteneciente al
Loop1-PS2Aa obtuvo un 45% de residuos hidrófilos, siendo este menos bioactivo en
comparación al péptido Loop2-PS2Aa, ya que este último tiene menor porcentaje de residuos
hidrófilos con un 17%, por tal motivo este péptido tiene mayor cantidad de residuos hidrofóbicos
y por ende se puede insertar en las bicapas lipídicas de la membrana más fácilmente.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 49
Adicionalmente, en la Tabla 2, se muestran las cargas netas positivas a pH 7.0 de +1, +1
y +2 para los péptidos P264-G274, Loop1-PS2Aa y Loop2-PS2Aa, respectivamente donde este
última muestra una dominancia de sus cargas catiónicas frente a los demás péptidos evaluados,
característica que le podría facilitar su interacción de forma más factible con las superficies
aniónicas. (Yang et al., 2019). Por su parte, los asteriscos en estos péptidos se expresan para
mantener la confidencialidad puesto que tiene un valor biotecnológico y un campo de acción
considerable, debido a que demostraron tener actividad tanto en Pseudomonas sp como en líneas
cancerígenas.
10.2 Cinética de Crecimiento de Pseudomonas sp Fitopatógena
El crecimiento del inóculo de la cepa bacteriana Pseudomonas sp, fue medido a una
longitud de 600 nm. Para realizar ensayos microbiológicos bajo condiciones equivalentes es
necesario trabajar con la misma cantidad de biomasa en una fase de crecimiento similar
(Hernández-García & Acebo-González, 2013), por tal motivo se utilizó una curva de calibración
que relaciona dicha UFC con una magnitud física tal como la absorbancia. No obstante, la
absorbancia no es una medida directa del número de células viables, por esto fue necesario realizar
mediciones de biomasa mediante el método de conteo en placa, el cual permitió contar células
vivas. En la Figura 4, se muestran los resultados obtenidos a partir del comportamiento de la cepa
HSL30 a nivel experimental.
La cepa HSL30 utilizada en este proyecto, es un serotipo de Pseudomonas fitopatógena,
la cual se conoce que causa afectaciones como manchas necróticas, bacteriosis, putrefacción,
entre otras patologías en cultivos de papa y tomate. Sin embargo, no se conocía su curva de
crecimiento. Por tal motivo, fue necesario identificar su comportamiento de crecimiento en el
medio Müller-Hinton (MH), como se muestra en la Figura 4. No obstante, las condiciones del
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 50
biorreactor, la composición del medio y la procedencia de la cepa pueden inferir en el
crecimiento como se denota en un estudio, donde realizaron la cinéticas de crecimiento de
Pseudomonas sp suministrando variables como el coeficiente volumétrico de trasferencia de
oxigeno (kLa), además de otras variables como 600rpm, temperatura y medios modificados,
razón por la cual se muestras diferentes resultados en sus cinéticas mostradas (Guerra-López &
Zúñiga-Dávila, 2018).
Figura 4
Cinética del Crecimiento Exponencial de Pseudomonas sp (Fitopatógena)
0 5 10 15
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0
5×107
1×108
1.5×108
Tiempo (h)
0D
60
0
UF
C/m
L
OD600
UFC/mL
Nota. La grafica azul corresponde a la densidad óptica medida a una longitud de 600nm, mientras que la gráfica roja
muestra el crecimiento de Pseudomonas sp expresado en UFC
Con el fin de realizar los ensayos antimicrobianos inicialmente se consideraron las
variables como: velocidad de crecimiento, concentración inicial, tiempo de duplicación;
incremento total de células, entre otras en la cepa HSL30. Por tal motivo, se realizaron
mediciones durante 24 tiempos, con el fin de evaluar la cinética de crecimiento mostrada en la
Figura 4, para esto se utilizó el medio de cultivo Müller Hinton (MHB), este último fue el
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 51
utilizado en los ensayos antimicrobianos (CMI50 y CMB) debido a que permite una correcta
difusión de los compuestos, además de estabilidad de los pedidos al momento de hacer las
lecturas, por consiguiente, permite obtener datos más reproducibles.
En la Figura 4 se observa la medición de la densidad óptica a una longitud de onda de
600nm (OD600). Adicionalmente, con el fin de conocer las UFC se tomó una alícuota de cada
tiempo, sembrándose en agar MH, obteniéndose una relación entre las dos variables graficadas.
La OD inicial de 0.0899 a 600 nm correspondió a un recuento que fue de 17x106 UFC/mL. Por
su parte, para el tiempo 8 la OD fue de 0.4530 y su conteo de viables fue 9x107UFC y en el
tiempo final -medición Nº24- la OD fue realizada cada media hora presentando 0.5038 de
absorbancia con un conteo de 1x108 UFC. Con estos resultados se pudo calcular la concentración
inicial siendo de 17x106 UFC la requerida en cada ensayo. Además, de conocer el crecimiento de
la Pseudomonas sp (fitopatógena) en ausencia de les péptidos derivados de la proteína Cry y el
agroquímico, haciendo posible determinar su inhibición, midiendo sus variaciones después de
cada tratamiento.
Luego de graficar los resultados de la OD600 y las UFC se determinaron diferentes
variables, las cuales se encuentran en Tabla 3, con la finalidad de determinar su cinética y tener
claridad del comportamiento de la cepa HSL30, analizando la fase logarítmica que llegó hasta el
tiempo 17 que corresponde a 8.5 horas. Adicionalmente, se obtuvo el tiempo de duplicación de la
Pseudomonas sp (fitopatógena) con 142.85 min, estos datos se encuentran soportados por un
coeficiente de determinación (R2) de 0.9824, lo cual da una alta confiabilidad de la cinética de
esta bacteria ya que las mediciones se realizaron por triplicado, con un total de datos los cuales
se evaluaron datos estadísticos como el promedio y la desviación estándar.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 52
Tabla 3
Cinética De Crecimiento Control
Variable valor
C(b0) 17x106
Fase latencia 0
Velocidad específica de crecimiento (μ h-1 ) 0,084
Fin fase log (h) 8,5
Tiempo de duplicación (min) 142.85
Incremento cel. Total 83x107
Incremento cel. Fin fase log 79x106
Coeficiente de determinación R2 0,9824
Nota. Las variables C(b0) corresponde a la concentración inicial de Pseudomonas sp, las demás variables se
identificaron como se indica en literatura (Bansal et al., 2011; Jurado-Gámez et al., 2015)
De este modo se realizó un ensayo de cinética de crecimiento en el cual se evaluó los
péptidos pertenecientes a la proteína Cry46Aa1 a una concentración de 150 μM como se observa
en la Figura 5, permitiendo cumplir con el objetivo 2 y asimismo determinar el péptido más
bioactivo. De los péptidos evaluados tanto el P264-G274 y el Loop 1-PS2Aa mostraron una
linealidad en su crecimiento, no obstante, su medición final en el tiempo estuvo cerca al
comportamiento de crecimiento de Pseudomonas sp, por esta razón se descartaron como
candidatos del péptido más activo. Por el contrario, el Loop 2-PS2Aa evidencio el mejor
comportamiento entre compuestos evaluados revelando una curva de crecimiento menor a la
obtenida por el oxicloruro de cobre (Cu2(OH)3Cl), a la concentración de 150 μM, dicho
compuesto a las 9 horas presento el fin de su fase logarítmica, entrando a una fase estacionaria.
Mientras que el control + (Cu2(OH)3Cl) [9364.7 μM] mostro una densidad óptica sobre el eje x a
partir del tiempo 4, llevando a cabo su fin, ya que evita el crecimiento en un lapso de 4 horas.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 53
Figura 5
Cinética de Pseudomonas sp Frente a Péptidos Derivados de Cry46Aa1
0 5 10 15
0.0
0.2
0.4
0.6
Tiempo (h)
OD
60
0
Loop2-PS2Aa [150μM]
P264-G274 [150μM]
Loop1-PS2Aa [150μM]
Cu2(OH)3Cl [150μM]
Pseudomonas sp
Cu2(OH)3Cl [9364.7µM]
ns
Nota. Los Símbolos expresados en la gráfica, indican el análisis de significancia del p-valor (ns (no hay diferencia
significativa) = P> 0,05, * =P ≤ 0,05, ** = P ≤ 0,01, ***=P ≤ 0,001, ****=P ≤ 0.0001)
De los péptidos ensayados de Cry46Aa1, el que mayor actividad mostro fue el 3899
(Loop2-PS2Aa), siendo catalogado en nuestro estudio como el péptido más bioactivo, razón por
la cual se analizaron nuevas concentraciones desde 200 hasta 500 μM a parte de una
concentración adicional de 1514 μM, mostradas en la (Figura 6) para determinar su
comportamiento en el tiempo y evaluar el péptido más activo frente a Pseudomonas sp
fitopatógena, se realizó un bucle cinético con mediciones en varioskan Lux, Thermo Fisher
Scientific Inc, MA, EE.UU., cada 30min por 12h, sin embargo la concentración de 200 a 500 μM
no mostraron una diferencia significativa al observar la sobre posición de las curvas de
crecimiento, donde a partir de estas concentraciones se evidencio el fin de la fase logarítmica a
partir de las 8 horas, mientras que la concentración de 1514 μM comienza su fase estacionaria en
el momento 5.5.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 54
Figura 6
Crecimiento de Pseudomonas sp Frente al Péptido Loop2-PS2Aa
0 5 10 15
0.0
0.2
0.4
0.6
Tiempo (h)
OD
60
0
Loop2-PS2Aa [200μM]
Loop2-PS2Aa [300μM]
Loop2-PS2Aa [400μM]
Loop2-PS2Aa [500μM]
Loop2-PS2Aa [1514µM]
Pseudomonas sp
ns
✱✱✱✱Cu2(OH)3Cl [9364.7µM]
Nota. Los Símbolos expresados en la gráfica, indican el análisis de significancia del p-valor (ns = P> 0,05, * =P ≤
0,05, ** = P ≤ 0,01, ***=P ≤ 0,001, ****=P ≤ 0.0001) entre las cinéticas de crecimiento de los diferentes
compuestos
La Figura 7 muestra la inhibición del crecimiento de la cepa bacteriana HSL30 en un
rango de concentraciones de 200 μM hasta 9364.7 μM del Oxicloruro de cobre. Los resultados
mostraron que la concentración de 200 μM tiene un P- valor de 0.0052 con respecto a la
concentración de 500 μM, donde se aprecia una diferencia significativa donde la concentración
de 200 μM comienza su fase estacionaria a las 9 horas, mientras tanto, la concentración de 500
μM termina su fase logarítmica a las 4.5 horas, estas dos concentraciones tiene una fase de
latencia hasta la 1.5 horas. Cabe destacar que todos los crecimientos evaluados iniciaron con una
absorbancia cercana a 0.08.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 55
Figura 7
Pseudomonas sp en Presencia del Oxicloruro de Cobre.
0 5 10 15
0.0
0.2
0.4
0.6
Tiempo (h)
OD
60
0
Cu2(OH)3Cl [9364.7µM]
Cu2(OH)3Cl [500μM]
Pseudomonas sp
Cu2(OH)3Cl [200μM]✱✱
✱✱✱✱
✱✱✱✱
Nota. Los Símbolos expresados en la gráfica, indican el análisis de significancia del p-valor (ns = P> 0,05, * =P ≤
0,05, ** = P ≤ 0,01, ***=P ≤ 0,001, ****=P ≤ 0.0001)
10.3 Actividad Antimicrobiana de Péptidos Frente a Pseudomonas sp Fitopatógena
Adicionalmente, como cumplimiento del tercer y último objetivo, se realizó la actividad
antimicrobiana de los compuestos desde la concentración de 75 a 150 μM como se evidencia en
la (Figura 8), buscando seleccionar el péptido más bioactivo frente a la cepa HSL30 con el fin de
determinar la CMI50 se evaluaron concentraciones desde 0,5μM hasta la concentración de
150μM. Sin embargo, las primeras concentraciones no presentaron un inhibición considerable
(Datos mostrados en el Apéndice A en un rango de concentración de 0.5 a 50 μM) por tal razón
solo se analizó su actividad inhibitoria para las concentraciones de 75, 100 y 150 μM donde el
péptido nativo derivado de la proteína Cry46Aa1 que mayor actividad antimicrobiana exhibió
fue el péptido 3899 (Loop2-PS2Aa) con un porcentaje de inhibición de 20.55%, 44.41% y
51.98%, respectivamente frente a la cepa Pseudomonas sp fitopatógena. Por otro lado, respecto
al péptido 3891 (P264-G274) la concentración que mayor porcentaje de inhibición obtuvo fue a
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 56
150μM con un porcentaje de 14.7% y, en los porcentajes de inhibición en las concentraciones de
75 y 100 µM no se mostraron diferencia significativa entre ellas con un P-valor del 0.516. El
péptido 3897 (Loop1-PS2Aa) presentó los porcentajes de inhibición más baja – péptido menos
activo- de todos los compuestos evaluados. Además, no mostró diferencias significativas al
analizar las concentraciones evaluadas (75, 100 y 150 µM).
A pesar que, el Cu2(OH)3Cl obtuvo resultados con altos niveles de inhibición, estos no
superaron al péptido (Loop2-PS2Aa), posterior a esto se evaluaron concentraciones de 200 μM a
9364.7 μM. La CMI50 del péptido Loop2-PS2Aa (>100 µM) fue 3 veces menor en comparación
con el control positivos que fue de mayor a 300 µM (Tabla 4).
Figura 8
Actividad Inhibitoria de los Tratamientos Frente a Pseudomonas sp
P264-
G27
4
Loo
p1-PS2A
a
Loo
p2-PS2A
a
Cu 2
(OH
) 3C
l
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Tratamiento
% I
nh
ibic
ión
Pse
ud
om
on
as
sp
✱✱✱✱
ns
✱✱✱✱
✱✱✱✱
✱✱✱✱
✱✱✱✱
ns
[75μM]
[100μM]
[150μM]
[9364.7µM]
Nota. Los Símbolos expresados en la gráfica, indican el análisis de significancia del p-valor (ns (no hay diferencia
significativa) = P> 0,05, * =P ≤ 0,05, ** = P ≤ 0,01, ***=P ≤ 0,001, ****=P ≤ 0.0001) los datos fueron analizados
entre ellos
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 57
La alta actividad inhibitoria obtenida por los péptidos derivados del dominio 1 de la
Cry46Aa1 podrían tener relación con los péptidos catiónico encontrados en plantas, animales e
insectos, los cuales cumplen funciones de defensa contra bacterias, hongos y algunos protozoos,
donde se cree que esta función antimicrobiana se debe a las cargas positivas de los péptidos los
cuales le permiten interactuar con la membrana de estos organismos, además sus características
anfipáticas le permiten mejorara su eficacia y selectividad (Djenane et al., 2017). En
comparación con el estudio de Lemeshko donde se evaluó el péptido BTM-P1-que contiene 4
residuos de aminoácidos hidrófobos en el extremo N-terminal- lo cual se presume que juegan un
rol muy importante en la incorporación del péptido en una bicapa lipídica, facilitando la
permeabilización de la membrana. Los péptidos derivados de la proteína Cry46Aa1 evaluados
como los de Cry11Bb1, forma canales iónicos debido a su naturaleza anfipática transmembrana,
donde se puede sugerir que los péptidos evaluados podrían tener un mecanismo de barril o poro
toroidal, ya que el número de residuos y la carga positiva permite que estos se inserten en la
membrana interaccionando electrostáticamente con lípidos cargados negativamente, causando
una pérdida del equilibrio osmótico y de la potencial membrana.
En todos los casos la inhibición aumentó a medida que incrementó la concentración,
indicando que esta actividad es dosis-dependiente. Sin embargo, esta diferencia no fue muy
marcada en el péptido 3897 (Loop1-PS2Aa) en las concentraciones de 75 y 100 µM, las cuales no
mostraron diferencia significativa con un p-valor de 0.9299, mientras que la segunda y tercera
concentración su p-valor fue de 0,57.
Comparando el potencial inhibitorio entre el Oxicloruro de cobre y el péptido 3899
(Loop2-PS2Aa) se determinaron los porcentajes de inhibición mostrados en la (Figura 9) y la
Tabla 4. El péptido más bioactivo- Loop2-PS2Aa - obtuvo una inhibición mayor al 50% frente a
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 58
la cepa HSL30 a una concentración de 150 μM con un porcentaje de 51.98%, mientras que del
Oxicloruro de cobre fue 31,97% a la misma concentración. Al comparar la concentración de 300
μM del péptido 3899 (Loop2-PS2Aa) y el agroquímico se aprecia una diferencia significativa del
0.0146 donde el péptido de la Cry46Aa1 exhibió un porcentaje de inhibición del 55.2% mientras
que el Cu2(OH)3Cl tan solo un 44,59%.
Figura 9
Comparación del Porcentaje de Inhibición entre Oxicloruro de Cobre y el Péptido más
Bioactivo.
Loop2-PS2Aa Cu2(OH)3Cl
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Tratamiento
% I
nh
ibic
ión
Pse
ud
om
on
as
sp
✱✱✱✱
ns
ns
✱
✱✱✱✱
[200μM]
[300μM]
[400μM]
[500μM]
[1514 µM]
[9364.7µM]
Nota. Los Símbolos expresados en la gráfica, indican el análisis de significancia del p-valor (ns (No hay diferencia
significativa) = P> 0,05, * =P ≤ 0,05, ** = P ≤ 0,01, ***=P ≤ 0,001, ****=P ≤ 0.0001) los datos fueron analizados
entre ellos para identificar diferencia del porcentaje de inhibición y comparar el péptido más activo con el
Cu2(OH)3Cl
Al evaluar la siguiente concentración donde se evalúo A 400 μM los dos compuestos
lograron una diferencia significativa con tan solo 0.346 donde el compuesto de la Cry46Aa1
tiene un porcentaje del 56,78%, mientras que el Cu2(OH)3Cl tiene un 52.93% de inhibición, en
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 59
este punto se empieza a ver una mejoría por parte del oxicloruro de cobre, en la concentración de
500 μM los compuestos evaluados con unos porcentajes de inhibición del 57,52% para el
compuesto 3899 (Loop2-PS2Aa) y 59,73% para el Cu2(OH)3Cl, al comparar los dos compuestos
a la concentración recomendad de oxicloruro de cobre para eliminar la Pseudomonas sp (9364.7
μM de Cu2(OH)3Cl) se aprecia una inhibición por parte del agroquímico del 99,6% de la cepa
HSL30 mientras que nuestro péptido más bioactivo alcanzo una inhibición del 64,21% con un P-
valor <0,0001 y una diferencia media de 35.45 como se aprecia en la (Figura 9).
Estos resultados nos sugieren que la actividad del péptido más bioactivo puede estar
asociado en su gran cantidad de aminoácidos hidrofóbicos como Thr, Tyr, Phe, Ala, Val y Ile los
culés le permiten insertarse en la bicapa lipídica en mayor proporción y de forma más fácil,
donde se puede ver una relación dependiente a la concentración, es así como los péptidos
anclados forman poros gracias a sus aminoácidos hidrofílicos que quedan expuestos causando la
pérdida del equilibrio osmótico y el potencial membrana, donde el péptido 3899 (Loop2-PS2Aa)
tiene tan solo un 17% de residuos hidrofílicos, siendo el péptido con mayor cantidad de residuos
hidrofóbicos, con un 83%, también se puede ver un mecanismo de forma anular o alfombra,
donde el péptido alcanza una concentración limite en membrana, razón por la cual las células
bacterianas presentan un colapso de la membrana causando su muerte por la pérdida de
citoplasma, por consiguiente estos péptidos podrían tener la capacidad de traspasar dicha
membrana y unirse a proteínas como el ARN polimerasa, y la topoisomerasa I, al encontrarse
con estos péptidos pueden causar la inhibición del crecimiento bacteriano de las Pseudomonas sp
fitopatógenas mediante la interacción de los ácidos nucleicos, además se estaría afectando la
síntesis proteica, al alterar las enzimas involucradas en la síntesis proteica (Won et al., 2009).
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 60
Se considera posible que estos péptidos puedan tener efectos dentro del plegamiento de
proteínas, al inhibir las chaperonas de Pseudomonas sp este péptido podría tener efectos en la
cadena respiratoria, al inhibir su consumo y formar especies reactivas de oxígeno, además de
tener efectos con los precursores de peptidoglucano, lo cual brinda un amplio esquema de los
diferentes mecanismos de acción que podría tener este péptido con la cepa HSL30, razón que de
ser posible sugiere su utilización en plantas infectadas con Pseudomonas sp (Kwon et al., 2019).
Con el fin de determinar la capacidad de eliminar el 99,9% de la población bacteriana, se
realizó un ensayo de CMB para identificar la concentración más baja con dicho efecto, sin
embargo, el oxicloruro de cobre a 9364.7 μM fue el único compuesto que demostró dicha
capacidad. Para finalizar los resultados, en la Tabla 4 se identifica el resumen de las
concentraciones utilizadas en cada compuesto, los porcentajes de inhibición frente a las cepas
HSL30 y su CMI50 y CMB. El péptido con menor porcentaje de inhibición frente a la cepa
HSL30 fue el Loop1-PS2Aa. mientras que el péptido más Loop2-PS2Aa fue que presento mayor
porcentaje de inhibición y una CMI50 > a 100 μM. por tanto, el oxicloruro de cobre presento una
CMI50 3 veces mayor a la del Loop2-PS2Aa. De los compuestos evaluados el único que presento
una CMB fue el oxicloruro de cobre ya que fue evaluado a una concentración mayor que el resto
de los compuestos como se aprecia los diferentes compuestos evaluados junto a sus
concentraciones y porcentajes de inhibición. A pesar que el oxicloruro de cobre mostro mayores
porcentajes de inhibición, a partir de la concentración de 500μM, el péptido más activo obtuvo
bajos porcentajes de actividad hemolítica, convirtiéndolo en un compuesto más seguro para su
manipulación y con poco riesgoso de causar intoxicación, además los péptido de Cry46Aa1 tiene
una mayor capacidad de inhibición de las biopelículas formadas por la cepa HSL30 como se
muestra en ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 61
Tabla 4
Compuestos Evaluados frente Pseudomonas sp Fitopatógena
Compuesto evaluado Concentración % Inhibición
Cepa HSL30
CMI50
(µM) CMB
P264-G274 (3891) 75μM 10.67
>150 >150 µM 100μM 11.29
150μM 14.74
Loop1-PS2Aa (3897) 75μM 9.60
>150 >150µM 100μM 10.00
150μM 10.59
Loop2-PS2Aa (3899) 75μM 20.56
>100 >1514 µM
100μM 44.42
150μM 51.98
200μM 53.57
300μM 55.19
400μM 56.78
500μM 57.52
1514 µM 64.21
Oxicloruro de cobre
(Cu2(OH)3Cl) 75μM 23.79
>300 9364.7 µM
100μM 26.37
150μM 30.97
200μM 31.98
300μM 44.59
400μM 52.93
500μM 59.73
9364.7 µM 99.6
Nota. Los compuestos P264-G274 y Loop1-PS2Aa solo fueron evaluados hasta la concentración de 75μM por sus
bajos porcentajes de inhibición.
En otro estudio similar, se evaluó el péptido BTM-P1 de la pro toxina Cry11Bb1, frente a
bacterias Gram-negativas, como Gram-positivas, evidenciando una CMI a 7.1 µM donde según
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 62
este estudio su actividad biológica puede explicarse por un mecanismo que implica la formación
de canales permeables a iones en la biomembranas, por tal motivo se encuentra una notable
diferencia, sin embargo, se evaluó contra Pseudomonas aeruginosa obteniendo una inhibición
del 80 y 86 %, aunque sus altos niveles de actividad antimicrobiana, pudieron deberse a sus
cadenas de mayor tamaño y su mayor cantidad de cargas catiónicas que le permiten interactuar
con las superficies aniónicas de los microorganismos (Arias et al., 2009).
En un trabajo similar los investigadores desarrollaron librerías de peptídicos mutantes, el
péptido PA2- GNU7 mostro selectividad contra Pseudomonas aeruginosa este péptido mosto
una CMI de 2 µM, sin embargo, no tiene actividad contra otras especies recalcando que las
cargas positivas son esenciales, aunque de igual forma los aminoácidos, son de gran importancia
debido a su ordenamiento espacial que le permite interferir en ciertos procesos, por tal motivo la
creación de librerías peptídicas en estos estudios son de gran importancia ya que nos permiten
probar diferentes moléculas prometedoras basándose en estudios computacionales y
modelamiento de proteínas, evaluando estos compuestos biotecnológicos a partir de proteínas
nativas o mutantes (Kim et al., 2020).
10.4 Actividad Hemolítica de los Péptidos en Eritrocitos Humanos
Los ensayos de actividad hemolítica son de gran importancia para determinar el potencial
y efecto que pueden tener los compuestos al estar en contactos con los mamíferos, apreciándose
una posible citotoxicidad en las células sanguíneas. En la (Figura 10), se muestran los resultados
obtenidos de la actividad hemolítica de los péptidos nativos de la proteína Cry46Aa1, y el
agroquímico Oxicloruro de cobre Cu2(OH)3Cl, para esta actividad se utilizó como control
positivo el Tritón X-100, sustancia química que permite una lisis total de los glóbulos rojos.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 63
Figura 10
Determinación de la Actividad Hemolítica
P264-
G27
4
Loop1-PS2A
a
Loop2-PS2A
a
Cu 2
(OH) 3Cl
Trito
nX-1
00
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Tratamiento
Acti
vid
ad
Hem
oli
tica
(%
) [75μM]
[100μM]
[150μM]
TritonX-100
✱✱✱✱
✱✱✱✱
Nota. Los péptidos derivados del dominio 1 de Cry46Aa1 ensayados frente eritrocitos de mamíferos P264-G274
(3891), Loop1-PS2Aa (3897) y Loop2-PS2Aa (3899) en las concentraciones de 75 μM, 100 μM y 150 μM. El Tritón
x-100 fue utilizado como nuestro control positivo. Las barras representan el promedio de las mediciones, además
estas muestran su desviación estándar.
La actividad hemolítica (Figura 10) de los compuestos evaluados de la Cry46Aa1,
muestran una citotoxicidad inferior al 20% en el rango de concentración de 75 a150 µM del 3891
y 3897, lo cual indica que las concentraciones evaluadas, no alcanzaron la concentración letal
media, con excepción del agroquímico Cu2(OH)3Cl, el cual sobrepaso este porcentaje a partir de
la concentración de 100 μM con un 56,77% de hemolisis, a pesar que las diferencias
significativas de los compuestos, a compararse con el control positivo, la diferencia absoluta
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 64
entre el Oxicloruro de cobre Cu2(OH)3Cl, a la concentración de 150 μM y el Triton-X100 fue de
solo 5.39%. Estos resultados muestran claramente la alta actividad hemolítica del agroquímico
evaluado, podría afectar salud, tal cual indican otros estudios que hablan de las intoxicación con
cobre a consecuencia de la ingestión del Oxicloruro de cobre (Cu2(OH)3Cl), en la agricultura y la
ganadería, son un problema muy común, como muestra el estudio realizado en salta (Poodts,
2010), donde se evaluaron 54 vacas con crías y algunos toros que había tenido ingesta de este
agroquímico muy común, sobreviviendo tan solo 6 vacas, estos mamíferos presentaron una
intoxicación crónica por cobre debido a la ingestión prolongada de cantidades pequeñas del
metal, debido a que esta zona se dedica a la agricultura donde es recurrente el uso del oxicloruro
de cobre, el cual se acumula en el organismo hasta alcanzar niveles tóxicos en animales y
personas. En otro estudio similar se evaluó la inocuidad de dos proteínas Cry altamente
utilizadas en cultivos transgénicos (Cry8Ka5 y Cry1Ac), estas frente a células de mamíferos,
además de pruebas hemolíticas, donde se encontró nula actividad frente a eritrocitos, así como
contra las células de mamíferos (Farias et al., 2014).
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 65
11 Conclusiones
En este trabajo se identificó que el péptido 3899, correspondiente al Loop2-PS2Aa,
presentó mitigación dentro de la cinética de crecimiento de la cepa HSL30, evidenciándose en
sus porcentajes de inhibición, a su vez este péptido presentó una CMI50, por tanto, fue >100 μM
mientras que en los otros dos péptidos estudiados Loop1-PS2Aa y P264-G274 fue de >150 μM.
Esto podría deberse, a la gran cantidad de aminoácidos hidrofóbicos como Thr, Tyr, Phe, Ala,
Val y Ile los culés le permitirían insertarse en la bicapa lipídica en mayor proporción y de forma
más fácil, donde se puede ver una relación dosis-dependiente a la concentración, por otro lado, el
Cu2(OH)3Cl el cual obtuvo una CMI50 a partir de la concentración >300 µM. Sin embargo, el
agroquímico, fue la más alta hemolisis de todos los compuestos, superando la HC50 a partir de la
concentración de 100 μM con un 56,7% y obteniendo un 94,6% con la concentración de 150 μM,
lo que permitió concluir que este agroquímico es efectivo frente la cepa HSL30, a pesar de su
alta actividad hemolítica.
Finalmente, dentro de las propiedades fisicoquímicas más relevante de los péptidos
antimicrobianos se encuentra que la carga positiva es un parámetro importante. Sin embargo, las
colas negativas permiten que el péptido penetre la membrana. En consecuencia, fue determinante
la presencia de estas cargas en el péptido Loop2-PS2Aa como se evidencia en la actividad
antimicrobiana.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 66
12 Recomendaciones
En este trabajo se logró identificar que el péptido 3899, correspondiente al péptido
denominado Loop2-PS2Aa, fue el más activo entre los péptidos evaluados derivados de la
proteína Cry46Aa1.Por lo que se recomienda, evaluar concentraciones más altas, que permitan
obtener resultados que igualen la inhibición del control positivo, con la ventaja de minimizar el
impacto ambiental y el uso de estos agroquímicos a base de metales pesados.
Adicionalmente, se recomienda realizar ensayos donde se pueda evaluar un efecto
sinérgico entre el péptido más activo y el Cu2(OH)3Cl, con el fin de aumentar y a su vez ayudar a
minimizar las concentraciones utilizadas de agroquímicos a base de metales pesados como el Cu,
disminuyendo sus altos niveles de citotoxicidad.
Finalmente, también se recomienda diseñar nuevas librerías de péptidos mutados,
intensificando la carga catiónica con Aas como Arginina o Lisina, y además tener en cuenta los
aminoácidos Thr, Tyr, Phe, Ala, Val e Ile, los cuales se cree que son los responsables de la
inserción en la bicapa lipídica. Además, de marcarlos con fluorescencia para analizar su
mecanismo de acción ensayando actividad in vitro en la cepa HSL30 y otras especies
fitopatogenas de importancia económica.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 67
Referencia Bibliográfica
Alippi, A., Lopéz, A., Rollan, M., Ronco, L., & Aguilar, O. (2002). Fluorescent Pseudomonas
species causing post-harvest decay of endives in Argentina. Revista Argentina de
Microbiologia, 34–4, 193–198. https://europepmc.org/article/med/12600002
Alvarado-Martínez, A. (2013). Detección de Ralstonia solanacearum en Solanum tuberosum L.
en el Estado de Sonora, México. Revista de La Facultad de Ciencias Agrarias, 45(2), 29–
45. http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=382837655025
Argerich, C., Troilo, L., Fazzone, M. R., Izquierdo, J., Strassera, M. E., Balcaza, L., Santo, S. D.,
Miranda, O., Rivero, M. L., Castro, G. G., & Iribarren, M. J. (2013). Manual de Buenas
prácticas Agrícolas en la cadena de tomate. Fao, 1–258.
Arias, M., Orduz, S., & Lemeshko, V. V. (2009). Potential-dependent permeabilization of
plasma membrane by the peptide BTM-P1 derived from the Cry11Bb1 protoxin. Biochimica
et Biophysica Acta - Biomembranes, 1788(2), 532–537.
https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2008.12.009
Bachem AG. (2020). Bachem - Peptide Calculator. https://www.bachem.com/service-
support/peptide-calculator
Bansal, Golombok, Brouwers, & Tesselaar. (2011). Cinetica de la fase exponencial de la curva
de crecimiento microbiano. Industrial and Engineering Chemistry Research, 50(5), 3011–
3020.
Barreteau, H., Bouhss, A., Fourgeaud, M., Mainardi, J. L., Touzé, T., Gérard, F., Blanot, D.,
Arthur, M., & Mengin-Lecreulx, D. (2009). Human- and plant-pathogenic Pseudomonas
species produce bacteriocins exhibiting colicin M-like hydrolase activity towards
peptidoglycan precursors. Journal of Bacteriology, 191(11), 3657–3664.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 68
https://doi.org/10.1128/JB.01824-08
Barros Meza, J., Cabrera Álvarez, J., Fuentes Forero, J., & Garcés Wilches, M. C. (2016).
Evaluación de la cito-genotoxicidad in vitro en eritrocitos y linfocitos humanos de los
extractos de Croton niveus, Piper marginatum e Hyptis suaveolens, especies vegetales
utilizadas en medicina tradicional del Departamento del Atlántico en el año 2016.
Universidad del Norte.
Beiki, F., Busquets, A., Gomila, M., Rahimian, H., Lalucat, J., & García-Valdés, E. (2016). New
pseudomonas spp. are pathogenic to citrus. PLoS ONE, 11(2), 1–16.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148796
Bernal, R. (2010). Enfermedades de Tomate (Lycopersicum esculentum Mill.) En Invernadero en
las Zonas de Salto y Bella Unión (Unidad de Comunicación y Transferencia de Tecnología
de inia (ed.); N° 181). INIA. http://www.inia.org.uy
Bio Render. (2021). BioRender. https://biorender.com/
Blanco, Y. (2006). La Utilización de la Alelopatía y sus Efectos en diferentes Cultivos Agrícolas.
5–16. http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=193215825001
Cai, R., Lewis, J., Yan, S., Liu, H., Clarke, C. R., Campanile, F., Almeida, N. F., Studholme, D.
J., Lindeberg, M., Schneider, D., Zaccardelli, M., Setubal, J. C., Morales-Lizcano, N. P.,
Bernal, A., Coaker, G., Baker, C., Bender, C. L., Leman, S., & Vinatzer, B. A. (2011). The
Plant Pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato Is Genetically Monomorphic and under
Strong Selection to Evade Tomato Immunity. PLOS Pathogens, 7(8), e1002130.
https://doi.org/10.1371/JOURNAL.PPAT.1002130
Chen, L., Jia, L., Zhang, Q., Zhou, X., Liu, Z., Li, B., Zhu, Z., Wang, F., Yu, C., Zhang, Q.,
Chen, F., & Luo, S. Z. (2017). A novel antimicrobial peptide against dental-caries-
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 69
associated bacteria. Anaerobe, 47, 165–172.
https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2017.05.016
CIOMS, & OMS. (2016). Pautas éticas internacionales para la investigación relacionada con la
salud con seres humanos. In Pautas éticas internacionales para la investigación biomédica
en seres humanos.
Clinical Laboratory Standards Institute. (2018). Methods for Dilution Antimicrobial
Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically ; Approved Standard — Ninth
Edition. CLSI document M07-A9. Clinical and Laboratory Standars Institute, 32(2), 18.
Colombia, M. de saud de. (2012). Ministerio de salud, Resolucion numero 8430 de 1993.
Ministerio de Salud., 32(4), 471–473. https://doi.org/10.7705/biomedica.v32i4.1526
Condalab. (2019). Caldo Nutritivo El Caldo Nutritivo se utiliza para el cultivo general de una
amplia variedad de microorganismos que no sean muy exigentes nutricionalmente . Test
microbiológico. Inspired by Knowledge, Cat. 1216, 2–3.
DANE. (2020). Boletín Técnico. https://www.dane.gov.co/
Dehghan-Manshadi, M., Nikpoor, A. R., Hadinedoushan, H., Zare, F., Sankian, M., Fesahat, F.,
& Rafatpanah, H. (2021). Protective immune response against P32 oncogenic peptide-
pulsed PBMCs in mouse models of breast cancer. International Immunopharmacology, 93,
107414. https://doi.org/10.1016/j.intimp.2021.107414
Djenane, Z., Nateche, F., Amziane, M., Gomis-Cebolla, J., El-Aichar, F., Khorf, H., & Ferré, J.
(2017). Assessment of the antimicrobial activity and the entomocidal potential of Bacillus
thuringiensis isolates from Algeria. Toxins, 9(4). https://doi.org/10.3390/toxins9040139
dos Santos, L. de A., Taveira, G. B., Ribeiro, S. de F. F., Pereira, L. da S., Carvalho, A. de O.,
Rodrigues, R., Oliveira, A. E. A., Machado, O. L. T., Araújo, J. da S., Vasconcelos, I. M., &
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 70
Gomes, V. M. (2017). Purification and characterization of peptides from Capsicum
annuum fruits which are α-amylase inhibitors and exhibit high antimicrobial activity
against fungi of agronomic importance. Protein Expression and Purification, 132, 97–107.
https://doi.org/10.1016/j.pep.2017.01.013
Engel, S. M. (2011). American Politicians Confront the Court. American Politicians Confront
the Court, 2–3. https://doi.org/10.1017/cbo9780511994890
Farias, D. F., Ponte Viana, M., Ramos De Oliveira, G., Beneventi, M. A., Marques Soares, B.,
Pessoa, C., Pessoa, I. P., Silva, L. P., Vasconcelos, I. M., Grossi De Sá, M. F., & Urano
Carvalho, A. F. (2014). Evaluation of cytotoxic and antimicrobial effects of two Bt cry
proteins on a GMO safety perspective. BioMed Research International, 2014.
https://doi.org/10.1155/2014/810490
Fern, M., Dı, D., Torre, B. G. De, Cabrales-rico, A., Vall, M., Andreu, D., & Rivas, L. (2010).
Lysine Nε-Trimethylation, a Tool for Improving the Selectivity of Antimicrobial Peptides.
American Chemical Society, 53, 5587–5596. https://doi.org/10.1021/jm100261r
Gleeson, T., & Wada, Y. (2012). Water Balance of Global Aquifers Revealed by Groundwater
Footprint. Nature, 4 8 8(May 2014), 200. https://doi.org/10.1038/nature11295
González, I., Arias, Y., & Peteira, B. (2009). Interacción Planta-Bacterias Fitopatógenas: caso
de estudio Ralstonia Solanacearum- Plantas Hospedantes. Rev. Protección Veg, 24(2), 69–
80. http://scielo.sld.cu/pdf/rpv/v24n2/rpv01209.pdf
Guerra-López, M., & Zúñiga-Dávila, D. (2018). Pseudomonas sp. LMTK32 production in
modified media for pelleting seeds of maca (Lepidium meyenii walp.). Revista Peruana de
Biologia, 25(2), 161–168. https://doi.org/10.15381/rpb.v25i1.14034
Gutiérrez-Pacheco, M. M., Bernal-Mercado, A. T., Vázquez-Armenta, F. J., Mart ínez-Tellez, M.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 71
A., González-Aguilar, G. A., Lizardi-Mendoza, J., Madera-Santana, T. J., Nazzaro, F., &
Ayala-Zavala, J. F. (2019). Quorum sensing interruption as a tool to control virulence of
plant pathogenic bacteria. Physiological and Molecular Plant Pathology, 106, 281–291.
https://doi.org/10.1016/j.pmpp.2019.04.002
Hernández-García, D., & Acebo-González, A. (2013). Turbimetria. Revista CENIC, 44(1), 1–18.
https://www.redalyc.org/pdf/1812/181226886003.pdf
HiMedia. (2016). Mueller Hinton Broth. HiMedia Laboratories, 37(1941), 1–2.
http://www.himedialabs.com/TD/M391.pdf
Jahangiri, A., Neshani, A., Mirhosseini, S. A., Ghazvini, K., Zare, H., & Sedighian, H. (2021).
Synergistic effect of two antimicrobial peptides, Nisin and P10 with conventional antibiotics
against extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii and colistin-resistant
Pseudomonas aeruginosa isolates. Microbial Pathogenesis, 150, 104700.
https://doi.org/10.1016/j.micpath.2020.104700
Jouzani, G. S., Valijanian, E., & Sharafi, R. (2017). Bacillus thuringiensis: a successful
insecticide with new environmental features and tidings. Applied Microbiology and
Biotechnology, 101(7), 2691–2711. https://doi.org/10.1007/s00253-017-8175-y
Jurado-Gámez, H., Gúzman-Insuasty, M., & Jarrín-Jarrín, V. (2015). Determinación De La
Cinética, Pruebas De Crecimiento Microbiano. Revista de La Facultad de Medicina
Veterinaria y de Zootecnia, 62(2), 40–56.
http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/remevez/article/view/51993
Kim, H., Hye, J., Chang, S., & Hyun, J. (2020). European Journal of Medicinal Chemistry
Development of a novel hybrid antimicrobial peptide for targeted killing of Pseudomonas
aeruginosa. European Journal of Medicinal Chemistry, 185, 111814.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 72
https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2019.111814
Kwon, J. Y., Kim, M. K., Mereuta, L., Seo, C. H., Luchian, T., & Park, Y. (2019). Mechanism of
action of antimicrobial peptide P5 truncations against Pseudomonas aeruginosa and
Staphylococcus aureus. AMB Express, 2, 9:122. https://doi.org/10.1186/s13568-019-0843-0
Lamiable, A., P, Thévenet, P., Rey, J., Vavrusa, M., Derreumaux, P., & Tufféry, P. (2016). RPBS
Web Portal. PEP-FOLD3. https://mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/cgi-
bin/portal.py#forms::PEP-FOLD3
Maldonado, N., Robledo, C., & Robledo, J. (2018). La espectrometría de masas MALDI-TOF en
el laboratorio de microbiología clínica. Revista Infectio, 22(1), 35–45.
Marcelletti, S., & Scortichini, M. (2014). Definition of plant-pathogenic Pseudomonas
genomospecies of the Pseudomonas syringae complex through multiple comparative
approaches. Phytopathology, 104(12), 1274–1282. https://doi.org/10.1094/PHYTO-12-13-
0344-R
Moreira García, J., & Vera Pincay, J. (2016). Contaminación por agroquímicos en agua, suelo y
fruto en el cultivo de tomate (Lycopersicon esculentum Mill) en las comunidades: Guabital
y Las Maravillas del Cantón Rocafuerte, época seca, 2016. Universidad Laica Eloy Alfaro
de Manabí Facultad.
OECD. (2017). Estudios Económicos de la OCDE Colombia. Estudios Económicos de La OCDE
Colombia, 46. www.oecd.org/eco/surveys/economic-survey-colombia.htm
Oueslati, M., Mulet, M., Gomila, M., Berge, O., Hajlaoui, M. R., Lalucat, J., Sadfi-Zouaoui, N.,
& García-Valdés, E. (2019). New species of pathogenic Pseudomonas isolated from citrus
in Tunisia: Proposal of Pseudomonas kairouanensis sp. nov. and Pseudomonas nabeulensis
sp. nov. Systematic and Applied Microbiology, 42(3), 348–359.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 73
https://doi.org/10.1016/j.syapm.2019.03.002
Peña sanchez, R. ricardo, & Paez mendieta, J. E. (2005). Bacterias Fitopatógenas.
https://virtual.uptc.edu.co/ova/fito/archivo/BACTERIAS.pdf
Pérez Álvarez, S., Coto Arbelo, O., Echemendía Pérez, M., & Ávila Quezada, G. (2015).
Pseudomonas fluorescens Migula , ¿ control biológico o patógeno ? Protección Veg, 30(3),
225–234.
Poodts, G. (2010). Intoxicación Aguda con Cobre en Bovinos por Ingestión de Oxicloruro de
Cobre. www.produccion-animal.com.ar
Prada-Prada, S., Flórez-Castillo, J., Farfán-García, A., Guzmán, F., & Hernández-Peñaranda, I.
(2020). Antimicrobial activity of Ib-M peptides against Escherichia coli O157: H7. PLoS
ONE, 15(2), 15–20. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0229019
Rouse, S. L., Matthews, S. J., & Dueholm, M. S. (2018). Ecology and Biogenesis of Functional
Amyloids in Pseudomonas. Journal of Molecular Biology, 430(20), 3685–3695.
https://doi.org/10.1016/j.jmb.2018.05.004
Salazar de Vegas, E. Z., Nieves, B., Ruíz, J., & Vila, J. (2008). Utilidad del Sistema API 20NE
para identificar especies del género Acinetobacter y otros bacilos gramnegativos no
fermentadores. Revista de La Sociedad Venezolana de Microbiología, vol.28(n.2), 89–95.
http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1315-25562008000200004
Sánchez, N., Rueda, N., Flórez Á (2013). Capacidad de Atenuación de la Infección Producida
por Pectobacterium Carotovorum en Solanum tuberosum a partir de Microorganismos
Aislados de Suelo Colombiano con Actividad Lactonasa o Acilasa. [Tesis de pregrado].
Universidad de Santander.
Slabbinck, B., De Baets, B., Dawyndt, P., & De Vos, P. (2010). Análisis de Pseudomonas
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 74
Fitopatógenas Usando Métodos Inteligentes de Aprendizaje: Un Enfoque General Sobre
Taxonomía y Análisis de Ácidos Grasos Dentro del Género Pseudomonas.
http://www.scielo.org.mx/pdf/rmfi/v28n1/v28n1a1.pdf
Téllez, G. A., & Castaño, J. C. (2010). Péptidos antimicrobianos. Infectio 14(1), 55–67.
Vargas-González, G., Alvarez-reyna, V. D. P., & Guigón-López. (2019). Impacto ambiental por
uso de plaguicidas en tres áreas de producción de melón en la Comarca Lagunera , México
Environmental impact by usage of pesticides in three melon producing areas in the
Comarca Lagunera , Mexico. CienciaUAT, 13(2), 113–127.
https://doi.org/10.29059/cienciauat.v13i2.1141
Velásquez Alcalá, S., Cabrera Marutz, C., & Vrhovac Biljesko, J. (2014). Enfermedades
profesionales en la industria del cobre: extracción, manufactura y reciclaje. In Med Segur
Trab (Internet) (Vol. 60, Issue 237).
Velásquez C, L. F., Rojas T, D. S., & Cerón S, J. A. (2018). Proteínas de Bacillus thuringiensis
con actividad citotóxica : Parasporinas Proteins of Bacillus thuringiensis with cytotoxic
activity : Parasporins. Colomb. Biotecnol, XX(2), 89–100.
https://doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v20n2.73668
Wei, J., Hameed, M., Wang, X., Zhang, J., Guo, S., Anwar, M. N., Pang, L., Liu, K., Li, B.,
Shao, D., Qiu, Y., Zhong, D., Zhou, B., & Ma, Z. (2020). Antiviral activity of phage
display-selected peptides against Japanese encephalitis virus infection in vitro and in vivo.
Antiviral Research, 174. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2019.104673
Won, H., Kang, S., & Lee, B. (2009). Action mechanism and structural requirements of the
antimicrobial peptides , gaegurins. BBA - Biomembranes, 1788(8), 1620–1629.
https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2008.10.021
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 75
WWAP (Programa Mundial de Evaluación de los Recursos Hídricos de las Naciones Unidas).
(2017). Informe Mundial de las Naciones Unidas sobre el Desarrollo de los Recursos
Hídricos 2017.
Yang, Z., Zheng, J., Chan, C. F., Wong, I. L. K., Heater, B. S., Chow, L. M. C., Lee, M. M. M.,
& Chan, M. K. (2019). Targeted delivery of antimicrobial peptide by Cry protein crystal to
treat intramacrophage infection. Biomaterials, 217(June), 119286.
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2019.119286
Yudina, T. G., Brioukhanov, A. L., Zalunin, I. A., Revina, L. P., Shestakov, A. I., Voyushina, N.
E., Chestukhina, G. G., & Netrusov, A. I. (2007). Antimicrobial activity of different proteins
and their fragments from Bacillus thuringiensis parasporal crystals against clostridia and
archaea. Anaerobe, 13(1), 6–13. https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2006.09.006
Zahedifard, F., Lee, H., No, J. H., Salimi, M., Seyed, N., Asoodeh, A., & Rafati, S. (2020).
Comparative study of different forms of Jellein antimicrobial peptide on Leishmania
parasite. Experimental Parasitology, 209, 107823.
https://doi.org/10.1016/j.exppara.2019.107823
Zayas, R. (2014). Los tóxicos ambientales y su impacto en la salud de los niños. Revista Cubana
de Pediatría, June 2007.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 76
Apéndices
Para determinar la CMI50 se evaluaron concentraciones desde 0,5μM hasta la
concentración de 50μM.Sin embargo, las primeras concentraciones fueron irrelevantes, por tal
razón solo se analizó su actividad inhibitoria desde la concentración de 16μM donde el péptido
de Cry46Aa1 que mejor resultado mostro para esta concentración fue el 3891 (P264-G274) con
un 6,76% de inhibición frente a Pseudomonas sp fitopatógena
Apéndice A. Actividad de los tratamientos frente a Pseudomonas sp cepa HSL30
Para las concentraciones de 32μM y 50μM el péptido que mayor porcentaje de inhibición
obtuvo fue el 3899 (Loop2-PS2Aa) con un 13,60% y 16,38% respectivamente, sin embargo, el
Cu2(OH)3Cl obtuvo un mayor porcentaje de inhibición en la concentración de 50μM con un
20,05%.
En todos los casos la inhibición aumento a medida que incremento la concentración,
indicando que esta actividad es dosis-dependiente, sin embargo, esta relación se presentó menos
marcada en algunos casos, por ej. El péptido 3891 (P264-G274) sus primeras dos
concentraciones no mostraron diferencia significativa con un p-valor de 0,2490, en el caso del
péptido 3897 (Loop1-PS2Aa) su p-valor para primeras concentraciones fue de 0,9631 y la última
concentración de 50Μm con respecto a la anterior obtuvo un p-valor de 0,1208. Todos los
tratamientos obtuvieron una diferencia significativa con respecto al control- y control+ según el
test de Tukey su P ≤ 0.0001.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 77
Tratamientos frente a Pseudomonas sp concentración de 16μM hasta 50μM
P264-
G27
4
Loop1-PS2A
a
Loop2-PS2A
a
Cu 2
(OH) 3Cl
Pseud
omon
as sp
Cu 2
(OH) 3Cl
0
50
100
Tratamiento
% I
nh
ibic
ión
Pse
ud
om
on
as
sp
[16μM]
[32μM]
[50μM]
[9364.7µM]
Pseudomonas spns✱✱✱✱
ns✱
✱✱✱✱✱
✱✱✱✱
✱✱✱✱
✱✱✱✱
Nota. Los Símbolos expresados en la gráfica, indican el análisis de significancia del p-valor ( ns = P> 0,05, * =P ≤
0,05, ** = P ≤ 0,01, ***=P ≤ 0,001, ****=P ≤ 0.0001) los datos fueron analizados entre ellos
Una de las mayores problemáticas, para los agricultores y una ventaja para ciertas
bacterias fitopatógenas, como es el caso de Pseudomonas sp, es la formación de biopelículas,
estructuras tan complejas que permite la asociación y organización de estos macroorganismos,
además hace parte del medio para llevar a cabo su comunicación o mecanismo conocido como
quórum sensing (QS) y a su vez le confiere protección contra agroquímicos y fijación a las
diferentes superficies. En la Tabla A2 Con el objetivo de determinar la actividad antibiofilm de
los péptidos del dominio 1 de la toxina Cry46Aa1, estos se ensayaron en diferentes
concentraciones, se muestran las mediciones de la OD595 para medir la formación de
biopelículas obteniendo los valores más bajos con el péptido 3899 (Loop2-PS2Aa ) lo cual no
sugiere que este fue el tratamiento con menor formación de biopelícula, su p-valor para la
concentración de 16 μM, 32 μM y 50 μM con respecto al control- fue ≤ 0.0001, mientras que el
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 78
Cu2(OH)3Cl mostro las absorbancias más altas indicando que su actividad no fue tan buena, al
determinar su p-valor en relación con el control-, en 16 μM no se encuentra diferencia
significativa obteniendo un 0,2723, mientras que cuando se relacionas las concentraciones de 32
μM y 50 μM entre ellas, estas no muestran diferencia significativa con un p-valor del 0.9277.
Densidad óptica de los tratamientos antibiofilm
P264-
G27
4
Loo
p1-PS2A
a
Loo
p2-PS2A
a
Cu 2
(OH
) 3C
l
contr
ol -
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Tratamiento
OD
59
5
[16μM]
[32μM]
[50μM]
[1x108ufc/mL]
ns
ns
✱✱✱✱
✱✱
ns
ns
✱✱
Nota. Los Símbolos expresados en la gráfica, indican el análisis de significancia del p-valor ( ns = P> 0,05, * =P ≤
0,05, ** = P ≤ 0,01, ***=P ≤ 0,001, ****=P ≤ 0.0001) los datos fueron analizados entre ellos y el control –
En todos los casos se puedo determinar que, al aumentar la concentración, se disminuyó
las absorbancias, por tal razón al evaluar su % inhibitorio durante la formación de biopelículas en
Pseudomonas sp, esta se ve relacionada con la concentración
En el Tabla A3, los péptidos evaluados de Cry46Aa1, el que mayor actividad antibiofilm
tuvo fue el 3899 (Loop2-PS2Aa), donde su concentración de 16 μM presento un 47,61% de
inhibición, la concentración de 32μM mostro una disminución en la formación del 51,75%,
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 79
mientras que para le concentración de 50μM fue del 57,13%, así mismo el Cu2(OH)3Cl presento
un 4,67%, 16,11% y 18,58% respectivamente, los valores de p-valor al comparar las
concentraciones más altas estuvo en un P ≤ 0.0001, excluyendo los péptidos 3891 (P264-G274)
y 3897 (Loop1-PS2Aa) que tuvieron una diferencia significativa entre ellos ≤ 0,0083, al
comparar todos las concentraciones con el control- se aprecia un P ≤ 0.0001.
Actividad antibiofilm de los tratamientos frente a Pseudomonas sp
P264-
G27
4
Loop1-PS2A
a
Loop2-PS2A
a
Cu 2
(OH) 3Cl
Contr
ol -
Cu 2
(OH) 3Cl
0
50
100
Tratamiento
% I
nh
ibic
ión
Pse
ud
om
on
as
sp
[16μM]
[32μM]
[50μM]
[9364.7µM]
Control -ns✱✱✱✱
ns✱
✱✱✱✱✱
✱✱✱✱
✱✱✱✱
✱✱✱✱
Nota. Los Símbolos expresados en la gráfica, indican el análisis de significancia del p-valor ( ns = P> 0,05, * =P ≤
0,05, ** = P ≤ 0,01, ***=P ≤ 0,001, ****=P ≤ 0.0001) los datos fueron analizados entre ellos para identificar
diferencia del porcentaje de inhibición e identificar el péptido más activo.