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Los estudios inmunofenotípicos de lasleucemias mieloblásticas deben ser inter-pretados en el contexto de los datos mor-

fológicos citoquímicos, clínicos y cito-genéticos. Las células hematopoyéticas ex-presan antígenos en función de su estadiomadurativo y de la estirpe celular a la quecorresponden. Los blastos de las leucemiasreflejan el grado de diferenciación en el

que se ha producido el stop madurativoasí como el fenotipo al que correspondela línea celular. A este fenotipo se añadenexpresiones aberrantes en las células queproliferan, como infidelidades de línea,asincronismos madurativos o diferentesMedicine 2001; 8(54): 2907-2910

APORTACIONES DE LA CITOMETRÍADE FLUJO EN EL DIAGNÓSTICO

DE LAS LEUCEMIAS AGUDASI. Benet Monforte y A.I. Teruel Casasus

Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital Clínico Universitario. Facultad de Medicina. Universidad de Valencia. Valencia.

Fig. 1. Expresión de CD45/SSC en médula ósea por citometría. A: médula ósea con las regiones en las que se delimitan las distintas poblaciones celulares. B: patrón correspondiente a una leucemiamieloblástica M0, los blastos se sitúan en la región de baja intensidad para CD45 y baja SSC. C: patrón de leucemia mieloblástica M2 discreta positividad para CD45 y SSC intermedio con celularidadgranulocítica diferenciada que tiende a expresar mayor SSC. D: patrón de leucemia mieloblástica M3 con blastos hipergranulares situados en la región de blastos con SSC elevada.

intensidades de fluorescencia respecto alas células normales.No existe una clasificación inmunofenotí-pica de las leucemias mieloblásticas ni unacorrelación exacta con la clasificación FABaunque si que es posible establecer unacierta relación (tabla 1).

Es necesario aplicar un panel de anti-cuerpos monoclonales definido para el es-tudio de las leucemias mieloblásticas. Estepanel deberá incluir marcadores frente a:células precursoras, los distintos grados dediferenciación, líneas mieloides, linfoides By T, eritroide y megacariocíticas (tabla 2).

Para elegir el panel de anticuerpos mo-noclonales se plantean dos posibilidades,o desde un principio utilizar un panel am-plio de monoclonales, o realizar el estu-dio en dos etapas, una primera orientati-va y la segunda dirigida (tabla 3). Laelección dependerá de las condiciones del

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ENFERMEDADES DE LA SANGRE (V)

TABLA IInmunofenotipo de las leucemias mieloblásticas según la clasificación FAB

CD11b/ CD41/Clasificación FAB Anti-MPO CD13/ CD15 CD14 Glicoforina CD61/ HLA-DR CD9 CD34

CD33 A y C CD42

M0 + ± – – – – + + +

M1 + + – – – – + + +

M2 mielocítico +++ + – – – – – + –

M3 promielocítico + + + – – – – + ±

M4 mielomonocítico + + + + – – + + ±

M5 monocítico – + – + – – + + –

M6 mieloeritroide – + – – + – + ± –

M7 megacariocítico – + ± – ± + + + –

Modificada de San Miguel JF, González M, Cañizo MC, Anta JP, Zola H et al. Surface marker analysis in acute mieloid leucemia and correlation with FAB classification. Br J Haematol 1986; 64: 547-560.

Célula precursora pluripotente

Célula precursoramultipotente CFU-GEMM

Célula precursora linfoide

Célula precursoracomprometida CFU-GM

Mieloblastos: CD13, CD33, CD34, HLA-DR Monoblasto: CD13, CD33, CD34, HLA-DR

Promonocito: CD13, CD33, CD11b, CD14, HLA-DRPromielocito: CD13, CD33

Monocito: CD13, CD33, CD11b, CD14, HLA-DR

Mielocito: CD13, CD33, CD11b, CD14

Metamielocito: CD13, CD11b, CD14

Neutrófilo: CD13, CD11b, CD14

La intensidad de CD14 en serie granulocítica es mas débil que en la monocítica

Fig. 2. Expresión antigénica en la diferenciación mieloide.

laboratorio. Aunque la segunda opción pre-tende ser economicista en el gasto de an-ticuerpos monoclonales, la primera aho-rra en tiempo y trabajo. En ocasiones elretraso en el estudio hace que las mues-tras se estropeen y los resultados sean di-fícilmente interpretables.Es conveniente realizar triples marcajescon anticuerpos monoclonales con fluo-rescencia directa habitualmente isociana-to de fluoresceina (FITC), ficoeritrina (PE)y complejo de proteína peridinum-clorofi-la (PerCP), así como utilizar controles iso-tipo adecuados.Una vez realizado el marcaje el siguientepaso es el de seleccionar la región dondese considera que se encuentran los blas-tos. Cuando los blastos no son la totalidadde las células es importante poderlos iden-tificar adecuadamente con la menor can-tidad de células de la hematopoyesis nor-mal contaminantes.Para dibujar la región de los blastos sepuede realizar mediante parámetros detamaño celular o forward light scatter(FSC) y granulariddad celular o sidewayslight scatter (SSC). Con este método enocasiones pueden solaparse los blastoscon linfocitos, monocitos o eritroblastosnormales. Para mejorar esta selección esrecomendable realizar un tercer marcajecon algún anticuerpo. Se ha utilizado elCD34 aunque tiene el inconveniente deque en ocasiones no todos los blastos ex-presan CD34. Es muy útil la utilizacióndel anticuerpo leucocitario común anti-CD45 unido a PerCP como tercer color.De esta forma se dibuja la región con losparámetros de fluorescencia CD45 y SSC.Tiene la ventaja de que las células de la hematopoyesis normal presentan una dis-

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APORTACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO EN EL DIAGNÓSTICO DE LAS LEUCEMIAS AGUDAS

TABLA 2Expresión de antígenos en las líneas

hematopoyéticas

Células precursoras TdT, CD34, HLA-DR

Células mieloides MPO, CD13, CD33, CD15, CDw65, CD11b

Células monocíticas CD33, CD13, CD64, CD14, CD68, CD4

Células eritroides Glicoforina A y C, CD71

Células megacariocíticas CD41, CD61, CD42

Linfocitos B CD79a, CD19, CD22,CD10

Linfocitos T CD3, CD2, CD7

Células NK CD16, CD56

TABLA 3Panel de anticuerpos para el estudio de las leucemias agudas

Anticuerpos monoclonales Especificidad

1.er Panel CD19, CD10, CD22cit, CD79a Línea B

CD7, CD2, CD3cit Línea T

CD33, CD13, anti-MPO Mieloide

TdT, CD34, HLA-DDR Precursores

Opcional CD14, CD15 Mieloide

2.o Panel IgMcit, Igs Linfoide B

CD1a, CD4, CD5, CD8 Linfoide T

CD41, CD61, CD42 Megacariocíticos

Anti-glicoforina Eritroides

Opcional CD11b, CD11c, CD36, CD68, CD56, CD16

Cit: citoplásmico, s: superficie.Modificada de Matutes E, Catovsky D. The value of scoring systems for the diagnosis of biphenotypic leucemia and nature B-cel disorders. Leu-kemia and lymphoma 1994; 13: 11-14.

TABLA 4Score inmunofenotípico de las leucemias bifenotípicas

Puntuación Serie linfoide B Serie linfoide T Serie mieloide

2 CD79a CD3cit MPO

CD22cit

IgMcit

1,5 CD19 CD2 CD13

CD10 CD5 CD33

1 TdT TdT CD14

CD11b

CD7 CD11c

MPO: mieloperoxidasa; cit: citoplásmico.Se considera bifenotípica cuando reune > 2 puntos en línea mieloide y en una de las otras líneas linfoides.Según Matutes E, Catovsky D. The value osf scoring systems for the diagnosis of biphenotypic leukemia and nature B-cel disorders. Leukemiaand lymphoma 1994; 13: 11-14.

TABLA 5Características inmunofenotípicas de las leucemias mieloblásticas

LAM-M0 Anti-MPO+ en 50%, CD13+, CD33+, linfoides -, CD34+, TdT+, HLA-DR +

LAM-M1 Anti-MPO+, CD13+, CD33+. CDw65+, CD11b+Precursores: CD34+. HLA-DR, CD117+, TdT+CD7+ confiere mal pronóstico

LAM-M2 < expresión CD34 y mayor CD15CD19+ sugiere t(8;21) CD2+ y CD7+ sugiere no t(8;21)CD56+ en t(8;21) remisiones y supervivencia más cortas

LAM-M3 CD45 débil, alto SSCHLA-DR- (25% de los casos +), CD34- (28% de los casos +)CD19+ 2n 2l 23% de los casosCD13 heterogéneo intenso, CD33 intenso homogéneoCD34-/CD15- o CD34+/CD15- o CD34-/CD15+ con CD13 heterogéneo sugiere t(15;17)Puede ser CD2+ sugiere variante hipogranular

LAM-M4 CD33+, CD13+, CD11b+, CD14+, CD64+, CD68+, CD4+, CD34-CD33 intenso mejor pronósticoAsociación con CD2+ y CD58+ (su ligando) sugiere inv16 con eosinofilia

LAM-M5 CD33+ débil, HLA-DR+ intenso, CD64+, CD4+CD14 variable, débil desfavorableCD117+ en M5a y negativo en M5b

LAM-M6 Glicoforina A+, CD71+ en formas madurasMarcadores mieloides + en blastos mieloides

LAM-M7 CD41+, CD61+, CD42+, FcVIII+, factor plaquetario 4+

Mieloide/NK HLA-DR-, CD33+, CD56+, CD16- según ScottCD16-, CD7+, CD33+, CD34+, CD56+, HLA-DR+ según Suzuki

tribución suficientemente diferenciada yes fácil reconocer la región de los blas-tos (fig. 1). Los linfocitos presentan in-tensidad de CD45 elevada y SSC bajo,mientras que los monocitos son mas dé-biles para CD45 y tienen mayor SSC. Losgranulocitos tienen SSC más elevado porsu granularidad y la expresión de CD45es intermedia, los eritroblastos son ne-gativos para CD45 y SSC, de esta formala región intermedia es la que corres-ponde a los blastos. Con estos paráme-tros algunas leucemias presentan patro-nes característicos como se muestra enla figura 1 que orientan en su reconoci-miento.La positividad para mieloperoxidasa (MPO)es propia de línea mieloide, se acompaña

de CD33 y CD13. El primero desapareceen los estadios más maduros mientras queel CD13 se mantiene. Ambos son positi-vos en serie monocítica. El HLA-DR se pier-de en la maduración granulocítica a nivelde promielocito y persiste en la monocí-tica. El CD14 es más intenso en serie mo-nocítica que en la granulocítica (fig. 2).El inmunofenotipo ayuda a diferenciar leu-cemias mieloblásticas de linfoblásticas,contribuye definitivamente en el diagnós-tico de leucemias como la M0, la M7, mie-loide/NK, bifenotípicas (tabla 4) y aportadatos sugestivos de algunos tipos de leu-cemias con características especiales (ta-bla 5). Mediante el estudio de cuatro fluo-rocromos es posible identificar blastos confenotipos aberrantes que se diferencian de

la hematopoyesis normal y permiten cuan-tificar el número de blastos a nivel 10–4 yrealizar el seguimiento de enfermedad mí-nima residual.

BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA

Burnett AK. Acute myeloid leukemia. Clin Hematol 2001;14: 1-18.Matutes E, Catovsky D. The value of scoring systems forthe diagnosis of biphenotypic leukemia and nature B-cel di-sorders. Leukemia and Lymphoma 1994; 13: 11-14.Nguyen D, Diamond L. Diagnostic Hematology. A patternapproach. Oxford: Butterworth Heinemann, 2000; 175-256.San Miguel JF, González M, Cañizo MC, Anta JP, Zola H, etal. Surface marker analysis in acute mieloid leukemia andcorrelation with FAB classification. Br J Haematol 1986; 64:547-560.Weir EG, Borowitz MJ. Flow cytometry in the diagnosis ofacute leukemia. Sem Hemat 2001; 38: 124-138.

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ENFERMEDADES DE LA SANGRE (V)