Post on 27-Jul-2015
3. Modificación de la información para generar nuevas instrucciones
Replicación, reparación
Mutaciones
4. Informacion pasa de generacion en generacion;
• cada cadena puede servir como molde para fabricar su complementaria;
ATGCCTTTAACCGATAG
TACGGAAATTGGCTATC
Las secuencias de ADN son copiadas exactamente durante los procesos de replicación
Errores= Mutaciones
Variabilidad Genética o cambios evolutivos
Técnicas Moleculares Herramientas de la Biologia Molecular
Aloenzimas, Southern, Northern
RFLP’s
PCR- simples, multiples, cuantitativas
MicrosatélitesAFLP’s
SECUENCIACION
PRINCIPIOS EXTRACCION ADN
¿Cómo podemos extraer el DNA de cualquier tejido?
Es Importante Diferenciar dos Conceptos Extracción: sacar los componentes desde
un compartimento celular. Involucra: Lisis de las células que contienen a los AN Inactivación de nucleasas Clarificación: separación de los AN de los restos
celulares (debris). Purificación: Separación de AN:
De proteínas solubles De otros AN no deseados De Lípidos, carbohidratos De sales y otros compuestos orgánicos
EL PROBLEMA
Para muchas aplicaciones que involucran manipulación de AN es necesario disponer de éstos en estado puro.
Por qué purificar?• Nucleasas que se liberan al lisar las células degradan los
ácidos nucléicos.
• Interferentes que inhiben a las enzimas que se usan en ingeniería genética. • El desafío es separar los ácidos nucléicos deseados desde una
mezcla compleja, manteniendo la integridad de los AN
• Contaminantes: Proteínas, lípidos y carbohidratos, sales del medio, iones, etc.
Disgregación o fragmentación del tejido
Lisis celular
Clarificación
Purificación
AnálisisCualitativo:electroforesis
Cuantitativo: espectrofotometría UV
Etapas básicas de un procedimiento general para Extracción y Purificación de AN
Estas etapas deben ir acompañadas de medidas o agentes que inactiven nucleasas celulares
Durante todo el
procedimiento se
debe usar
soluciones y
material estéril, ademas
de guantes
1. Métodos de fragmentación y lisis celular para la extracción de AN
Métodos físicos Homogenización mecánica, Homogenización en solución Molienda manual en mortero Bolitas de vidrio Sonicación
El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria para romper el material de inicio (células o tejido) y la delicadeza requerida
para preservar las moléculas de interés (ADN o ARN).
• Métodos químicos– Detergentes
• Métodos enzimáticos– Lysozima: rompe enlaces -1.4- entre N-acetil murámico y N-
acetil glucosamina de peptidoglicán de la pared celular de bacterias
– Lyticasa: rompe enlaces -1.3 de glucano de levaduras– Proteasas: rompe enlaces peptídicos de prot. de pared y
membrana plasmática e interacciones célula-célula.
Procedimiento
Seleccione un tejido bien preservado
Destrucción química y mecánica de las células del tejido
Desnaturalización de las Proteínas con la proteinasa K y precipitación con la centrifugación.
La funcion basica del aislamiento del DNA esla ruptura de la estructura celular se produce un lisado, se separa el DNA soluble de los fragmentos de elementos y otros materiales insolubles y purificar este DNA de las proteinas solubles y otros acidos nucleicos.
Historicamente esto se ha hecho con soluciones organicas como el fenol-cloroformo seguidos de un precipitacion con etanol; otros utlizan sales y dialisis.
Estos metodos emplean mucho tiempo y se utilizan sustancias con peligro para la salud humana
DNA Extraction Procedure - 2
Obtain DNA from digestion Add ethanol
Centrifuge
Wash the pellet
Resuspend
http://www.youtube.com/watch?v=JNl1kjw9ZDQ&feature=related
Aloenzimas
La técnica más ampliamente usada en los inicios de la Biología molecular, consiste en la detección de las variantes electroforéticas de enzimas.
Nimiadina Herrera- STRI
Toma en cuenta el hecho de que diferentes fragmentos de proteínas no desnaturalizadas migran a diferentes velocidades a través de geles de agarosa o acrilamida (o medios de soporte como las tiras de celulosa) a los cuales se les ha aplicado una corriente electrica