CITOGENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

APLICADA A LA HEMATOLOGÍA

Bqco. Gonzalo OjedaCátedra Hematología Clínica

Fa.C.E.N.A – U.N.N.E2012

TECNICAS HABITUALES

• ANÁLISIS CROMOSÓMICO (CARIOTIPO, BANDEO G, FISH, MULTI FISH, ETC)

• BIOLOGIA MOLECULAR (PCR, RT-PCR, REAL TIME PCR, PCR MULTIPLEX, NESTED PCR, RFLP, ETC.)

UTILIDAD

• DIAGNÓTSTICO• TIPIFICACIÓN• SEGUIMIENTO (ERM)• ELECCIÓN TERAPÉUTICA??

Análisis cromosómico (cariotipo)

-Método inmediato o directo: los tejidos que en estado natural presentan mitosis activas (médula ósea, tumores, placenta), pueden tratarse directamente con una solución hipotónica, tinciones y cariotipo inmediato.

-Método a corto plazo: el índice mitótico puede aumentarse por incubación de estos tejidos en presencia de colchicina durante 4-6 hs antes del tratamiento hipotónico.

-Método a largo plazo: otros tejidos se cultivan hasta que presenten mitosis activas (generalmente 72 hs). La sangre periférica es el tejido utilizado más a menudo. También se utiliza líquido amniótico (generalmente 10 días).

Análisis cromosómico (cariotipo)

Obtención de las muestras:

-Sangre periférica y MO: 3-4 ml anticoagulados con heparina.

-Tumores, placenta: biopsias en solución fisiológica ó medio de cultivo.

-Líquido amniótico: amniocentesis en medio de cultivo estéril.

Análisis cromosómico (cariotipo)

Realización del cariotipo

Recorrer el extendido bandeado en microscopio con menor aumento y al detectar una metafase, pasar al objetivo de inmersión. Realizar el recuento cromosómico y proceder a su clasificación. El centrómero divide al cromosoma en brazos cortos (p) y brazos largos (q).La técnica de bandeo permite identificar regiones y bandas en los brazos que se numeran desde el centrómero.

Análisis cromosómico (cariotipo)

Idiograma de un cariotipo masculino normal

Análisis cromosómico (cariotipo)

Metafase con bandeo G

Análisis cromosómico (cariotipo)

Metafase con bandeo G

-7,+8, del(5q), t(9;22)(q34;q11), +21

Citogenética en leucemia mieloblástica aguda (M1)  

t(8;21)(q22;q22)-Y,-7,+8, del(5q)

Citogenética en leucemia mieloblástica aguda (M2) 

t(15;17)(q22;q21) +8

-Dos cromosomas recombinanates-15q22: PML (promyelocites)-17q21: RAR-15q+: PML/RAR (inhibidor de la diferenciación celular y de la apoptosis)-Pronóstico: bueno

Citogenética en leucemia promielocítica aguda (M3) 

Citogenética en leucemia mieloide crónica  

  Translocación recíproca t(9;22)(q34;q11) (Rowley, 1973)

La traslocación Ph se observa en:- el 90-95% de los pacientes con LMC- el 35% de LLA del adulto- el 5% de LLA del niño- el 3% de LMA En LMC al momento del diagnóstico todas las células de la médula ósea son Ph +

LLC: citogenética molecular

LLC con trisomía 12. Tres señales rojas están presentes en los núcleos trisómicos.

LLC: citogenética molecular

LLC con deleción bialélica 13q14. Dos de los cuatro núcleos no muestran hibridización con el color rojo.

LLC: citogenética molecular

LLC con deleción monoalélica de p53. La señal roja identifica el gen p53 y la señal verde el centrómero del cromosoma 17.

SKY FISH

HGC FISH

MULTIBANDYNG FISH

ESTUDIO CITOGENÉTICO

Especificidad: muy alta

Sensibilidad/diagnóstico: depende del tamaño del clon

Sensibilidad para EMR: muy baja

Requerimiento: células en división

Fracaso: falta de células en división

Ventaja: revela alteraciones adicionales

BIOLOGIA MOLECULAR• Electroforesis de ADN SSCP

(Conformacional)• PCR ( Real Time, Nested, RFLP, etc)• RT PCR• Southern, Western y Northern Blot• MICROARRAYS

SSCP : Single Strand Conformational Polymorphism

• Los fragmentos migran en función de su carga

• Se utilizan geles NO desnaturalizantes

• A medida que aumenta el tamaño del fragmento disminuyes la sensibilidad

• Puede detectar mutaciones puntuales

NESTED PCRSe realizan 2 ciclos de PCRLos primeros primers amplifican una secuen-cia mayorEl segundo par de primers se utiliza para secuenciar una secuen-cia interna de laregión previamente amplificada

Detection of sickle cell disease by polymerase chain reaction (PCR). After two rounds of amplification (nest-PCR) of DNA from a single blastomere, a 364-base pair DNA fragment is produced, which is then digested with a restriction enzyme (DdeI). DNA fragments are separated by electrophoresis on a 10% polyacrylamide gel. DNA size makers are shown in lane 1. Lane 2 and 3 are DNA from a heterozygous carrier before and after enzyme digestion, respectively; lanes 4 and 5 are DNA from a homozygous normal DNA before and after digestion, respectively; and lanes 6 and 7 are DNA from a homozygous affected, before and after digestion, respectively. Different patterns with various numbers of bands represent different genotypes

RFLP (Genotyping of Kell, Duffy, Kidd and RHD in patients with b

Thalassemia-Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia Print version ISSN 1516-8484 Rev. Bras. Hematol. Hemoter. vol.22 no.2 São José do Rio Preto May/Aug. 2000)

• Polymerase chain reaction (PCR) amplification:The PCR analysis for the presence of RHD was performed in two genomic regions, intron 4 and exon 10. For intron 4, 3 primers (RHI41, RHI42 and RHI43) yielded a product of 115 bp for RHD and 236 bp for RHCE. For exon 10, a common 5'primer (EX10F) was used for both RHD and RHCE. When paired with the RHD-specific 3'-untranslated region (UT) primer (RHD3UT), it produced a product of 245 bp, and when paired with the RHCE-specific 3'-UTR (RHCE3UT), it yielded a product of 160 bp

• RFLP analysis:. The enzymes Bsm I, Mnl I and Ban I were used to determine, respectively KEL 1/KEL 2 (698C>T), JK A/JK B (838A>G) and FY A/ FY B (125 G>A) Furthermore, the Sty I enzyme was used to distinguish between normal and mutated GATA-1 binding motif (-33T>C), because the GATA-1 binding site is critical for expression of Fyb protein in the red cell membrane

EL GEN QUIMERICO

BCR/ABL

t(9;22)(q34;q11)

• En el cromosoma 22 se encuentra la región BCR (Breakpoint Cluster Region), denominada también gen BCR

• En el cromosoma 9 se encuentra el gen ABL que normalmente codifica una proteína de 145 kd, con actividad tirosincinasa que juega un rol crítico en el control y proliferación celular.

PROMUEVE LA DIMERIZACION

El producto principal es la oncoproteina p 210

La oncoproteína afecta enormemente la transducción de señales

Patologías Oncohematológicas asociadas al reoredenamiento

BCR/ABL• LMC (95%)• LLA ( 3-5 % en niños y 20-30% en

adultos)• LMA ( 2%)• LMC Ph(-) : t(8;22) (p11;q11)BCR-

FGFR1• CRISIS BLASTICA DE LMC

( coexpresión de p210 y p190)

COMO PODEMOS DETECTAR LA EXPRESION DEL GEN BCR/ABL

• PCR del gen BCR/ABL• RT – PCR del mRNA ( 190, 210,

230)• FISH

Utilidad de la detección

• Clasificación de LMC no clásicas• Clasificación de LLA Ph +• Factor predictivo ( grado de

expresión de p190)• Control de tratamiento

MICROARRAYS• SIRVEN PARA EVALUAR EL GRADO

DE EXPRESION DE DIFERENTES GENES

• PUEDEN ANALIZAR HASTA 400.00 FRAGMENTOS EN FORMA SIMULTANEA

USOS• DETECCION DE MUTACIONES Y

POLIMORFISMOS• DETECCION DE EXPRESION GENICA EN

DISTINTOS TEJIDOS (EN CONDICIONES NORMALES O PATOLOGICAS)

• SECUENCIAMIENTO DE ADN Y GENOTIPIFICACION

• EN LEUCEMIAS: EXPRESION DE PROTEINAS DE RESISTENCIA AL TRATAMIENTO

Enfermedad Residual Mínima en enfermedades

hematológicas

Remisión completa: menos de 5% de células neoplásicas detectables por microscopía óptica.

Enfermedad Residual Mínima (ERM): persistencia de un bajo número de células malignas que son indetectables por técnicas citomorfológicas convencionales.

Se necesitan varias técnicas sensibles para conocer la efectividad del tratamiento que permitan una evaluación más precisa de la masa tumoral y predecir recaídas antes de la manifestación clínica.

Enfermedad Residual Mínima en enfermedades

hematológicas

La eficacia de las diferentes técnicas disponibles para detectar ERM están basadas en:

• Especificidad (para discriminar células malignas de normales, sin resultados falsos positivos o negativos);

• Sensibilidad (límite de detección);

• Reproducibilidad y aplicabilidad (fácil standardización y velocidad en la obtención de resultados para su aplicación clínica).

Enfermedad Residual Mínima en enfermedades

hematológicas

Las técnicas para detectar ERM pueden clasificarse según la estructura celular identificada: • Caracterísiticas generales de las células neoplásicas como la morfología y el crecimiento de colonias “in vitro”;• Características citogenéticas evaluadas por análisis cromosómico convencional o por hibridización fluorescente in situ (FISH); • Inmunofenotipo antigénico de las células neoplásicas por medio de la citometría de flujo; • Contenido de DNA detectado por citometría de flujo (aneuploidía) y • Estructura del DNA analizada por PCR.

Enfermedad Residual Mínima en enfermedades

hematológicas

Límite de detección (sensibilidad):- morfología: de 1-5%, lo que es equivalente a una masa residual de 1010 –1011 de células malignas. - citogenética: está dentro del rango anterior o algo superior. - FISH: La sensibilidad varía entre 10-2 y 10-4. - Citometría de flujo: permite la detección de fenotipos aberrantes para la distinción entre células leucémicas y normales con una sensibilidad de 10-3 a 10-5. - PCR es la prueba mas sensible en la detección de ERM con una sensibilidad de 10-5 a 10-6 (regiones de fusión pueden ser usadas como targets para detectar ERM).