Post on 14-Jan-2016
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[Cultivo Lote
Alimentado y
Esterilizacin]
by
[Camila Durn V]
[ICB552-Ingenieria Procesos de
Fermentacin]
[JC Gentina] 2012
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INDICE
CAPITULO 1 : CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO #
CAPITULO 2: ESTERILIZACION MEDIO DE CULTIVO #
CAPITULO 3: ESTERILIZACION AIRE #
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S,P,X
F, Sf
Vo
Vf
CL CLATiXiSiPiV0
T0=0X0S0P0V0
TfXfSfPfVf
F alimentacin
CAPITULO 1: CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO
25-05//La corriente de alimentacin puede ir cualquier nutriente, pero el que no puede
faltar es el limitante (Sf).
Se divide en dos etapas, y cada etapa una modalidad diferente,
comenzamos con CL, para conseguir condiciones iniciales para
el CLA, y producto de lo que ocurra en l, obtendremos los
valores finales.
CLA es un balance que se realiza durante el cultivo, un balance del sustrato limitante y
decide cmo crece el m.o, nos permite influir sobre del m.o y por ende sobre el
metabolismo de la clula en la condicin que nos interesa (proceso productivo). Lo ideal es
poder encontrar las condiciones de operacin para que el m.o se exprese o se comporte de
la manera que deseamos.
Si el m.o est limitado por Sf, entones m.o< max. Si la oferta > demanda, entonces = max y
al revs si oferta< demanda y S0=0, entonces < max. Donde Oferta =FSf [g/L] y
Demanda=(XV)/Yx/s donde el sistema es variable, X(t) y V(t).
El ambiente no se cambia en CL, lo que puede significar problemas inhibitorios si se
acumula alguna sustancia txica.
La gran VENTAJA de CLA es que se puede modular a diferencia de CL.
CL CLA CC
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Cte
Linea
l
Y=x2
FSf
t
El ambientes Es mejor en CLA, ya que se asimila al cultivo continuo al modular , pero
puede ocurrir envejecimiento del medio y de las clulas.
En la corriente de alimentacin (F) la concentracin del sustrato (Sf) debe ser lo ms
concentrado, de manera de trata que el V sea lo menor posible.
Tenemos que saber los requisitos que fijamos y modelar la oferta con ello, sin importar la
forma que tenga (lineal, exponencial, constante, etc)
Existen dos opciones:
Alternativa 1: F(t) variable y Sf cte
Alternativa 2: F cte y Sf variable.
Lo ms utilizado es la alternativa 1).
-Suposiciones que nos simplifica la vida para modelar fermentaciones:
1. El microorganismo tiene crecimiento balanceado (YX/S es Cte)
2. Consumo de Fuente de Carbono y Energa para mantencin es despreciable
3. V en el fermentador es consecuencia solo de F (densidad es la misma, no se considera V por
biomasa)
4. Producto inicial =0
La Fermentacin en CLA se justifica cuando se requiere algn tipo de control sobre . Sino
usualmente se utiliza CL.
ECUACIONES CARACTERSTICAS CLA
Biomasa (X)
Sustrato (S)
Volumen (V)
Veloc. Crecimiento ()
Flujo F=F(t)
Hasta este punto tenemos 5 incgnitas (,X,S,F,V) y 4 ecuaciones. Entonces debemos definir una
de ellas, como por ejemplo F o bien fijaremos comportamiento del m.o a travs de ( buscamos
cte pero distinta de su mximo valor) Analizaremos ambos casos.
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CASO 1: CTE => S=CTE
Entonces
Y
28-05// Reemplazamos y despejamos F
Donde
y
De esta obtenemos:
(slo si el aumento de volumen depende del flujo de alimentacin)
Luego:
Luego la biomasa no tendr un crecimiento exponencial, pero si algo similar.
-CLA ALIMENTACION EXPONENCIAL (AE)
= Cte, S=Cte Sf=Cte
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El otro caso es cuando F es constante, debemos realizar anlisis cualitativo:
Dividimos CLA en 2 zonas de distinta duracin (por el momento da lo mismo
cuanto) y las trabajaremos de manera independiente, pero unidas.
Base: Disponibilidad nutriente limitante.
Entonces fermentacin que realizamos parte con una oferta que supera la poblacin
celular y que se va a acumular el nutriente. Si se acumula [S]limitante superar
criterio 10Ks, entonces tendremos crecimiento exponencial a max. (Esto en la
primera parte)
Cunto dura?
Como estamos F constante y S constante, entonces el Valimentacin es constante por
ello si tenemos poblacin creciendo en algn momento la Vconsumo=Valimentacin y
luego la supera y se hace negativa esta V porque se consume.
Es decir : 1 acumulo :
luego
(donde FSf es cte) e indica que
se agota nutriente. La Biomasa(X) sigue aumentando en el fermentador, entonces
se acelera (aumenta)
y se llega a concentraciones cercanas a Ks .
El microorganismo debe modificar , el m.o sigue creciendo pero ajusta
(disminuye) y se genera una compensacin/equilibrio.
Cuando [S]
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Luego de la ecuacin :
Arreglamos para que funcione en todo el proceso:
integramos la variable compuesta:
Ahora vamos a las zonas:
1) Z.C.E (ZONA CRECIMIENTO EXPONENCIAL) S>>KS => =M AX
Podemos integrar sin problemas porque =max. Reemplazando S de las ecuacines
desarrolladas anteriormente:
A tiempos cortos afecta y tenemos acumulacin, a medida que avanza
Luego:
Perfil no exponencial. Tt: Tiempo de transicin (tiempo que termina) 0< t < Tt
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Z.C.E
t
Z.C.L
XVumax
X0V0
S0
Tt
u
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Donde a media que aumenta la biomasa (aumenta el tiempo) esto implica que
disminuye y por ende S tambin. La poblacin e m.o se va adaptando a las
condiciones de alimentacin.
Finalmente S se obtiene directamente de la Ecuacin de Monod
Luego reemplazamos y obtenemos lo siguiente:
Donde esta tambin disminuye, conforme avanza el tiempo(t)
Ahora para la biomasa:
X no crece linealmente (t). Ahora debemos unir ambas zonas (aproximacin), no
necesariamente coinciden todas las variables, se fuerza a que al menos una de las
variables sea idntica en ambas zonas. En este caso escogemos a la biomasa (lo +
nos interesa). Se impone que ambas expresiones X sean iguales, en igual tiempo de
transicin ( Tt)
Ah podemos observar la unin de la transicin. A pesar que analizamos el
cultivo en 2 zonas, el tiempo es uno solo, desde que comienza CLA hasta que
termina. ( ver grfico anterior).
La zona entre ambas zonas, es una zona de cambios muy rpidos, en la simulacin
se asume efecto inmediato por la [S] sobre , ya que el cambio no es instantneo.
Existen m.o que se estresan y demoran ms, no es exacto su comportamiento.
No hemos hablado de lo que ocurre inicialmente, la transicin puede pasar
desapercibida, la alimentacin comienza cuando Sf > 0 (menos traumtica)
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Arbitrariamente se decide esperar que Sf=0, y recin all comienza la
alimentacin., hay m.o que se estresan en estas condiciones y otros que no
Por qu se usa [Si]=0?
Porque resulta cmodo y debemos tener indicios para comenzar alimentacin, ya
que tambipen podramos analizar biomasa (espectrofotometra), pero no es muy
prctico. Ahora algo til es medir OD, si se agota la Fuente de carbono limitante,
tendramos un aumento de la [OD] y nos dice, par de crecer el m.o, y con este
mtodo, se determina en 2 min y all comenzamos a alimentar. Ahora si la
fermentacin es anaerobia, debisemos utilizar otro mtodo lo mismo si la fuente
de nutriente limitante es distinto del carbono.
Comenzamos con una oferta menor que la demanda para eliminar la 1 zona :
Valim < V max consumo
Donde V max consumo= X0V0max/Yx/s Adems S0 debe ser cercana a cero, o en su
defecto cero. Sino el m.o crecer a max y eso no es lo que queremos. Con esto
hacemos que ZCE no exista. Beneficios? Menor tiempo de operacin.
31-05// Para que X=cte => dx/dt =0 ( E.E)
En CLA-AC( Alimentacin constante) Z.C.L :
Entonces
donde Sf y S0 son cte, por ende Sf est ligado a S0 y X0 y
rendimiento
Si reemplazamos Sf en X, tendremos el valor de X en E.E :
Entonces primero derivamos X, obtenemos Sf, lo reemplazamos en X y obtenemos
la ltima ecuacin:
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Llegaremos a que:
Igual que en Cultivo continuo Quimiostato E.E, se asemeja al factor de dilucin,
pero aqu el volumen es variable en el tiempo. Pero lo importante es que vara
dependiendo de las condiciones de operacin, es decir, del Flujo. Pero aqu difiere
el significado de la dilucin.
Sistema Continuo: Sale biomasa a medida que esta va creciendo y mantenemos
distribucin de esta fisiolgico homogneo.
El concepto de dilucin en un CLA, la biomasa es constante. Se genera amplia
distribucin de estado fisiolgico. La dilucin est dada por el aumento de volumen
debido al flujo, este diluye la composicin celualr, pero no saca/elimina biomasa, a
diferencia del continuo.
Si hacemos el anlisis:
En P.E.E dx/dt=0 y dV/dt =F, reemplazando
Llegamos a lo mismo, pero V es dependiente del tiempo.
Ahora realicemos lo mismo para En CLA-AE :
Se tienen que cumplir ciertas condiciones, como por ejemplo el estado P.E.E donde
X=cte, =Cte => Sf=cte ( Sf sustrato limitante) y aadiremos X=cte y es p.e.e
porque el volumen vara. Debe ocurrir que
= cte =>
reemplazamos en :
, donde obtenemos X=X0
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Z.C.E
t
Z.C.L
XVumax
X0V0
S0
Tt
u
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DNDE SE PROPONE USAR CLA EN P.E.E?
Hay fermentaciones que ocurren de mejor manera con un decreciente, como lo
son los metabolitos 2. En CL es imposible encontrar esa condicin, entonces aqu
( CLA en P.E.E) tenemos la posibilidad de manejar y disminuirla. Pero cuando
estamos en P.E.E, realizamos un procedimiento parecido al pie de cuba. En este
caso hacemos CLA Cclicos, as nos evitamos la etapa por lotes.
Hacemos 1CL, termina fermentacin, saco algn %caldo de cultivo y quedo con
V0, comienzo con la alimentacin F(t) es decir, repito CLA con condicin de la 1
fermentacin.
Si no lo hacemos en P.E.E lo que sucede es que al final:
Donde X02>X01>X0 con esto limitamos la capacidad del reactor y en pocos ciclos
llegamos a concentraciones de biomasa que el reactor no puede mantener por
transferencia de oxgeno y calor.
Ahora podemos decir que V01P01 y aspero esto
podra ser un problema.
Para P.E.E como operamos a X=cte, en cada ciclo tendremos la misma
concentracin de biomasa, y esto permite sacarle el mejor provecho a la
fermentacin.
Ciclo tras ciclo, X es muy cercana a la capacidad del recator de sostener, debido a
las propiedades fsicas y calor. Existen cambios de biomasa y consumo de O2, pero
en esa variacin la acercamos al mximo KLa(transf. De O2) a esto le sacamos
partido y obtenemos mayor productividad.
La Biomasa en P.E.E NUNCA se mantiene cte, lo que permite que el flujo y
consumo de oxigeno inicial y final, disminuya su diferencia e igualarlo como una
ecuacin, para considerar formacin de producto intracelular.
1Fermentacin 2Fermentacin 3Fermentacin
X0V0
X01V01P1
X02V02P2
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Nosotros vemos la tasa de cambio, donde:
*Suponemos que no se destruye el producto
Si se degradara el producto por pH u otro mvil debisemos aadir ese factor
CMO INTEGRAMOS ESTO A LAS DEMS ECUACIONES?
Debemos conocer funcionalidades respecto del tiempo de y XV, respetando si
es AE-AL-AC, etc. Por que esto afecta la funcionalidad de
Podra ser que : , solo nos falta conocer XV. Supongamos .
En CLA-AE, es cte.
Ordenando e integrando, obtenemos :
Donde P, no aumenta exponencialmentem pero s parecido. Ahora para otro caso
variar.
El CLA se desarroll en la industria, fue fundamental para la industria de la
fermentacin. Se dieron cuenta que CL no les daba productividad y resultados
esperados con ensayo y error.
Llegaron CLA y obtuvieron mejores resultados, hacan levaduras y les sala con
alcohol, esto implicaba un menor rendimientos y tenan que lavar lo que aumentaba
los costos. CLA anduvo bien hasta 1960 app. Luego se aadieron otras
fermentaciones con un buen CLA y aparecen muchos reviews (1980) y luego se
estanc
Cuando el proceso requiere control sobre algn sustrato o , la
mejor alternativa es CLA en la industria.
Otra opcin es CC : + complejo y tremendas probabilidades de contaminacin
porque se prolonga en el tiempo. En Biolix, ferm alcohlica puede servir, no se
contaminan( Gracias a los pH, trabajan materia inertes)
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METABOLITOS Y FERMENTACIN
04-06// Metabolitos 1: Cuya produccin depende de auxotrofas, el m.o tiene la
necesidad de algn sustrato/nutriente esencial.
Para la sobreproduccin se deben realizar mutaciones (eliminar mecanismos de
control, para mxima eficiencia y economa) Esto lleva a una condicin de
auxotrofa, entonces el m.o es sobreproductor, pero se debe alimentar al medio el
nutriente esencial. Por ejemplo para la lisina, su sntesis comienza con el Ac.
Aspartico y se utiliza Corynebacterium glutamicum. Con el mutante del m.o se
logr modificar una enzima que interrumpe sntesis de metioninan y treonina, y se
genera auxotrofia , entonces debemos aadir estas al medio de manera que no se
concentre con la lisina; estas concentraciones son muy bajas y afectan la
produccin. Adems nos interesa una gran biomasa.
En CLA se puede manejar la [Treonina]mnimo pero no ms alta que la [Lisina].
Entonces tendremos m.o sobreproduciendo lisina y esto nos sirve, Hoy en dia
tambien se utiliza E.coli.
Tambin es interesante el uso de Metabolitos 2: Aquellos que no se requiere oara
que el m.o crezca. Se sintetiza en idiofase. En CL =max, luego disminuye S y
con ello y seguimos en idiofase. Algunos sobreviven concentraciones criticas del
nutrientes y otros no.
Una de las estrategias usadas fue cambiar la Fuente de carbono y energa por una
de metabolismo ms lento. Luego se volvi a la glucosa, pero manejando su
disponibilidad (CLA)
1 CL : Hasta cierta concentracin de biomasa. Se agota glucosa
2 CLA: Se aade glucosa medida (apenas crece) y comienza sntesis de metabolito
secundario.
Periodo Crecimiento Biomasa : 1 da
Periodo Produccin : 6-7 das
Lo que se trata de simular con el CL es la zona de desaceleracin que es pequea y
en CLA ms extensa. En CLA se extiende la idiofase.
Un tercer caso, + caracterstico: Inhibicin por Sustrato
Importante para produccin de Biomasa, sobre todo en cultivos de alta densidad.
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umax
Inhibicin
[S]
De acuerdo a Monod:
Se trabaja a las concentraciones de sustratos, que se obtiene en el
mximo valor de en un sistema de inhibicin, porque es el mximo
valor que podemos obtener y eso es lo que buscamos el ms alto, pero
menor que max. Por ejemplo el metanol tiene un precio razonable,
Fuente de carbono muy limpia, pero el problema es que es inhibitorio.
Algunas bacterias metilotroficas pueden asimilarlo. La mayora m.o
metilotrficos, sopportan 6-7 g/L, y mayor que eso debe dejar de crecer
el m.o
El CLA aparece como una alternativa favorable ya que podemos manejar . Donde
nos convendra una alimentacin exponencial y queremos cte, con una [S] que
mantenga el valor de deseado. Debemos encontrar la funcin alimentacin que
nos mantenga en esos rangos.
Esto puede ocurrir con otras fuentes, como el nitrgeno, el sulfato de amonio,
afecta a algunos m.o. En E.coli el sulfato de amonio es inhibitorio, para ello se
reemplaz mediante la regulacin del pH, a travs del hidrxido de amonio.
Existen m.o que no soportan 10 g/L de fosfato.
El 4 caso es el caso en que el m.o presenta el efecto crabtree.
Efecto Crabtree: Saturacin va oxidativa, lo que obliga que se abran las vas
reductivas (fermentativa). Existen levaduras que muestran este efecto (
facultativas). Este es un problema ms bien de velocidades, por ejemplo si el m.o
crece a max entonces estn abiertas las vas reductivas.
Pero si deseo ruta oxidativa, debemos controlar el ingreso de fuente de carbono y
energa para que m.o crezca a
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Otro caso es el de produccin de enzimas hidrolticas, cuando existe Represin
Catablica.
Enzimas hidroliticas: requieren presencia de inductor para producirse y la
[inductor] tambin puede inferir en el crecimiento celular.
Recin sintetizamos enzimas hidroliticas cuando se agota la fuente de carbono
metabolizable.
F.C --REPRESION CATABLICA Enzimas hidroliticas
Un ejemplo es la -amilasa, para producirla el cultivo debe ser con almidon soluble
y se genera un compuesto que induce sintesis de -amilasa. Pero cuando esto
ocurre, se metaboliza rpido la fuente de carbono y se deha de producir -amilasas,
porq se concentra el otro azcar e inhibe.
Se equilibran la Vhidrolisis y V consumo del sustrato alimenta que debe ser hidrolizado
El almidn antes de ser consumido debe ser previamente hidrolizado.
CLA-AE ms productivo que CL : Controla Alimentacin y
INDUCTORES
Poseen 3 carateristicas/condiciones :
1. Inducen
2. Inhibidores
3. Consumid por el m.o
Cuando se dan estas 3 condiciones en la penicilina acilasaque necesita un inductor :
AFA y su concentracin no puede ser mayor a 1,5 g/L sino hace una gran
inhibicin. Pero al mismo tiempo el m.o lo degrada y pierde capacidad de inductor.
La solucin sera aadir AF, adems se ha visto que a concentraciones < 1,5 la
produccin es menos de penicilina acilasas.
Entonces lo razonable es usar CLA:
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Alimentacin de AFA : Constante ( para equilibrar de velocidad de consumo y
alimentacin) y para aumentar productividad de la enzima.
Comn denominador: Control de , a travs de control de alimentacin, quizs lo
mejor sera Cultivo continuo, porque tiene mayor produccin pero a nivel
industrial, no goza de la fama porque es ms complejo de manejar y mayores
probabilidad de contaminacin.
Lo ltimo tiene que ver con 2 situaciones que entraban la aplicacin industrial de
CLA.
1) Optimizacin: fermentacin, modelacin matemtica, muchas variables que
intervienen. Aun no hay mtodo simple y efectivo para encontrar condiciones
optimas de operacin de CLA. Multivariable complejo.
Se ha resuelto con muy buen criterio de las personas que desarrollan la
fermentacin.
Mejoras: modalidad fermentacin, mejor el proceso y se logra optimizacin.
2.) Control, Alimentacin (Veloc. Alimentacin): Uno disea con un tipo de
alimentacin ( lineal, exponencial) y Qu pasa cuando la fermentacin no
responde de esta manera?
El cultivo se descontrola, lo que implica, una menor productividad. Lo ideal sera
tener sistema cerrado. Sensor mide biomasa y [S] limitante y que con esto se vea el
modelo o forma de cambiar velocidad de alimentacin.
Entonces tenemos 2 extremos:
i. Medir X y Slimitante
ii. No se puede medir.
Lo mejor que se hace en una situacin intermedia donde se busca medicin de
variables que se relacionen con la biomasa (generacin de CO2, pH, OD, cociente
respiratorio) y con la concentracin de sustrato limitante.
Hay intenciones que a travs de mediciones indirectas se crea estrategia de control,
por ejemplo, la levadura de panificacin: donde existe un sensor de alcohol basado
en el efecto crabtree. Si la velocidad de alimentacin aumenta, implica que hay
efecto crabtree, entonces se genera etanol, el sensor mide y enva seal al
controlador y disminuye la velocidad de alimentacin.