¿Embriones al freezer?

Universidad Ricardo PalmaFacultad de Ciencias Biológicas

Escuela Académico Profesional de BiologíaCurso: Taller de Biotecnología Animal

Ciclo 2010-I

Hidalgo Nicho, Eduardo Alejandro

¿Para qué nos sirve crio-preservar a los embriones?

Las ventajas se dan tanto desde el punto biológico como económico

En general, se tienen dos metodologías de

conservación de embriones

•Conservación in vitro (corto plazo)

•Conservación mediante criogenia (largo plazo)

  Ventajas Desventajas

Cigotos

Máximo número de cigotos congelados

No permite la selección basada en la morfología

Se disminuye el trabajo de cultivo de embriones hasta etapas posteriores

La tasa de supervivencia es comparable a la de embriones clivados

Posible congelar cigotos a aquellas pacientes que presentan síndrome de hperestimulación

ovárica

Menos cuestionamiento ético

EmbrionesPermite selección embrionaria  Con alta tasa de supervivencia  

BlastocistosSelección de acuerdo con su desarrollo y

características morfológicasUn porcentaje menor de

embriones llega a la etapa de blastocistoCon alta tasa de implantación

Un poco de historia…

Smith A. V. (1953)ACP 15% de GlicerolEmbriones de conejo

Whittingham et al. (1973)Tº bajas de congelación y almacenamiento.

Protocolos de embrio-congelación

Congelación lenta

Descenso térmico lento Disminuye concentración de CPA (PROH, DMSO

y glicerol)Congeladores Programables

Supervivencia del 78%

Congelación ultrarápida o Vitrificación

Descenso térmico lento Disminuye concentración de CPA

(Etilenglicol)Congeladores Programables

Rev. Colombiana de Obstetricia y Ginecología Vol. 57 No. 4 • 2006 • (291-300)

Congelación lenta

1.5 M PrOH + 0.2 M sucrosa

Preparar 0.5 mL de PBS + 20 % de suero + 0.2 M de sucrosa

0.5 M PrOH

1.0 M PrOH

1.5 M PrOH

1. Colocar al embrión por 5 min.

2. Colocar al embrión por 5 min.

3. Colocar al embrión por 5 min.

Bajar la Tº 1Cº/min hasta los -7ºC (mantener por 10 min)

Bajar la Tº -0.3Cº/min hasta los -35ºC (Luego bajar rápidamente hasta los -50ºC – 150ºC)

Inmersión en N líquido

Para la descongelación se prepara PBSs + 0.2 M sucrosa, PBSs + 0.1 M sucrosa, y medio de cultivo + suplemento de suero. Preparar baño maría a 30ºC. Retirar embrión de N líquido, esperar 30s y someterlo al baño maría. Finalmente, cultivarlos a 37ºC.

Método Original de Whittingham

Roa N. et al. Revista científica FCV-LUZ. 1998. 40-52

Vitrificación

Seleccionar embriones

1. Mórula compacta

2. Blastocito temprano

3. Blastocisto extendido

Equilibración del embrión en la pajuela, en una solución crioprotectora del 50% (v/v) ó 4-6M aprox., durante 2-5 min., dependiendo del tipo de célula, concentración de crioprotector y temperatura durante el tratamiento.

Inmersión en Nitrógeno líquido y almacenamiento

c

Fert

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Rep

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da 2

009;

cap

. 49

La vitrificación en algunos grupos

GrupoDesarrollo de blastocisto(%)

Referencia bibliográfica

Equino 88 Med Vet 2001; vol. 18 (9): 527-546.

Porcino33

Biology of Reproduction 2004; vol. 71: 432-437

Bovino35

Biology of Reproduction 1999; vol. 60: 534-539

Ratón 39,1 Arch. med. vet.2002; vol.34 (2)

Humano60,2

Fertilidad y Reproducción asistida 2009; cap. 49

Mukaida T, et al. Hum Reprod 2006; 21:3 246-52.: La vitrificación de balstocistos mejoran si se hace colapsar artificialmente la cavidad blastocélica antes de la vitrificación

Roa N. et al. Revista científica FCV-LUZ. 1998. 40-52

Método de Vitrificación

c

Tasa de embarazo in vivo producidas por diferentes protocolos de crio-preservación

c

c

c

c

c

c

F. Guignot et al. Theriogenology 66 (2006) 1004–1011

c

Estadio de Desarrollo Congelación lenta Vitrificación

Zigotos PROH40% de

EtilenglicolEstados divididos DMSO

Blastocisto PROH 1,5 M + 0,1 M de sucrosa

Protocolos de embrio-congelación

La congelación de embriones puede ser realizada en diferentes estadios de desarrollo, teniendo cada uno diferentes tasas de sobrevida, así como también

ventajas y desventajas. La eficiencia de un programa de congelación es evaluada por la observación de la integridad morfológica del embrión en descongelación,

la habilidad de clivar in vitro y su capacidad de implantación.

Rev. Colombiana de Obstetricia y Ginecología Vol. 57 No. 4 • 2006 • (291-300)

Los principales factores que afectan la congelación y

almacenamiento de los embriones

1. Tipo de concentración y los componentes crio-protectores

2. Formación de hielo

Fotografía criomicroscópica del oocito de ratón suspendido en 1 M MeSO4 y

enfriado a -32ºC/min.

3. Tasa de enfriamiento

4. Temperatura de almacenamiento

5. Tasa de descongelación

6. Tasa de dilución y temperatura

Exposición del embrión a los CPA

Existe una deshidratación parcial

Se trata de evitar la formación de los cristales de hielo

6% de solución de glicerol. (A) 0.1 8C/min,(B) 1 8C/min, (C) 10 8C/min, y (D) 100 8C/min y puesto en N líquido.

Leibo, SP: Theriogenology69 (2008) 37–47

Scherzer, J et al.: ReprodDomAnim43 (2008) 371–376

Leibo, SP: Theriogenology69 (2008) 37–47

Cálculo de la pérdida de agua en un oocito de ratón

suspendido en 1M de MeSO4 y enfriado a Tº bajo

cero.

Efecto de los crio-protectores permeables en el embrión de equino

Med Vet 2001; vol. 18 (9): 527-546.

Med Vet 2001; vol. 18 (9): 527-546.

Efecto de los crio-protectores permeables + no permeables en el embrión de equino

Luego de la crio-preservación viene la descongelación…

El tiempo de descongelación, varía según el método de congelación

Protocolo de Descongelación de la C.L.

La crio-preservación de diferentes especies

Bovinos: La tasa de preñez son del 80-90% ccon respecto a las obtenidas con embriones frescos control

Ovinos y caprinos: Los resultados son similares al anterior

Equinos: Experimentan una mejor respuesta a la vitrificación. Faltan más experimentos.

Seidel GE, Theriogenology, 65 (2006): 228-235.

Porcinos

Presentan una elevada sensibilidad a la Crio-preservación

Existe una remoción de lípido

Esakiet al, BiolReprod, 71: 432-437, 2004

Información adicional de la

Exposición