Post on 09-May-2020
UNIVERSITARIOS POTOSINOS 236 JUNIO 20194 ALCÁNTARA, L. PÁGINAS 4 A 10
Recibido: 03.03.2019 I Aceptado: 05.04.2019
Palabras clave: Cáncer, cultivo celular, esferoides, microambiente del tumor (MAT) y tumor.
Cultivo celular 3D como modelopara estudiar el
cáncerLUZ EUGENIA ALCÁNTARA QUINTANAlealcantara@conacyt.mxluz.alcantara@uaslp.mxCÁTEDRA CONACYT ADSCRITA A FACULTAD DE ENFERMERÍA Y NUTRICIÓN, UASLP
JUNIO 2019 236 UNIVERSITARIOS POTOSINOS 5MODELOS 3D PARA ESTUDIAR CÁNCER
El número de publicaciones en mode-
los 3D en la década de 1990 apenas
llegó a 10 por año, en los últimos 10
años el aumento ha sido exponencial,
alcanzando casi 1 000 publicaciones
tan sólo en 2018 (Hoarau_Vechot
et al., 2018). Esto se debe principal-
mente a la aparición de nuevas técni-
cas potenciales y de gran valor en el
contexto de los estudios de interac-
ción tumoral.
Desde sus inicios, en la década de
1970, el cultivo de células en 3D ha
revelado información trascendental so-
bre los mecanismos de la homeostasis
(estabilidad y compensación interna
de un organismo, pese a los cambios
en su entorno. Esto regula el inter-
cambio con el exterior) del tejido y el
cáncer, y ha acelerado la investigación
traslacional (que facilita la transición de
la investigación básica en aplicaciones
clínicas) en biología del cáncer e inge-
niería de tejidos. En este texto tratamos
de proporcionar una visión general de
esta metodología y resaltar los bene-
ficios de los cultivos 3D en el campo
de la expansión de las interacciones
tumor-microambiente tumoral.
¿Qué es un modelo 3D?
Trabajar en 3D implica la formación
de esferoides agregados que pueden
crecer en suspensión, encapsularse
o en la parte superior de una matriz
3D; cada uno tiene sus ventajas y des-
ventajas específicas, como lo señala
Katt et al. (2016): “Los métodos 3D
se pueden dividir en las siguientes
categorías: (i) método de la gota col-
gante; (ii) método de superficie no
adherente y (iii) cultivo en suspen-
sión”, que se detallan a continuación
(Hoarau-Vechot et al., 2018).
Tipos de modelos 3D
Método de la gota colgante
Originalmente fue un método de
microbiología usado para estudiar
bacterias en un ambiente confinado
y controlado. En esta técnica se colo-
can gotas de suspensiones celulares
(conjunto de células aisladas, de agre-
A pesar de los avances registrados en las últimas décadas para el tratamiento del cáncer, éste sigue siendo una de las principales causas de muerte en el mundo, lo cual se debe —en parte— a la complejidad y heterogeneidad de los tumores. El cultivo tridimensional (3D) está motivado por la necesidad de crear modelos celulares que capten mejor las complejidades de la biología del tumor. El modelo 3D ideal eliminaría las diferencias relacionadas con las especies que generalmente se encuentran, permitiendo las pruebas de fármacos directamente en modelos humanos. Es de creciente interés para la comunidad científica estandarizar los modelos 3D óptimos que mejor imiten la especificidad del microambiente del tumor (MAT).
UNIVERSITARIOS POTOSINOS 236 JUNIO 20196 ALCÁNTARA, L. PÁGINAS 4 A 10
gados celulares, de 2 a 100 células,
distribuidos en un medio de cultivo lí-
quido en constante movimiento) en la
parte inferior de la tapa de una placa
de Petri.
La tapa en que las células cuelgan de-
bido a la tensión superficial, se coloca
luego en una placa de Petri que con-
tiene la solución salina tamponada
con fosfato conocida como PBS, para
evitar la deshidratación de las gotas.
Las células se acumulan en la punta
de la gota en la interfaz aire-líquido,
luego se agregan espontáneamen-
te y, finalmente, forman esferoides
(Jorgensen et al., 2014).
El método de la gota colgante no re-
quiere el uso de ninguna sustancia
que pueda afectar negativamente
los esferoides, ya que las células se
adhieren entre sí de manera natural y
no tienen que depender de matrices
(la matriz extracelular se considera
un componente extracelular multi-
funcional fundamental que participa
en la morfología, supervivencia, de-
sarrollo, migración y en las relaciones
inter e intracelulares de un tejido) ni
andamios (soporte para las células,
también actúa como una estación
repetidora para varias moléculas de
señalización). Sin embargo, las gotas
con volúmenes de líquido de más de
50 microlitros (μl) no se adhieren a
la placa de Petri, ya que la tensión de
la superficie del líquido se supera por
gravedad (Jorgensen et al., 2014).
También puede ser un desafío cam-
biar el medio sin molestar al esferoide.
Recientemente, se han utilizado pla-
cas colgantes en lugar de las de placa
de Petri, lo que permite la producción
de un mayor número de esferoides
3D por placa. Las placas colgantes tie-
nen una bandeja inferior llena de un
líquido que mantendrá una atmósfera
húmeda dentro de la placa para evi-
tar la evaporación y el secado. En la
parte superior de la bandeja hay una
placa colgante con orificios de acce-
so donde pueden colocarse muestras
de la suspensión celular para formar
gotas colgantes.
En general, el método de caída col-
gante es bastante simple y consisten-
te, y puede producir un esferoide por
gota para diferentes líneas celulares
(figura 1).
Figura 1.
Técnica 3D utilizada para la creación de esteroides.
a) Método de la gota colgante. Las células se depositan en la tapa de
una placa de Petri, que se voltea sobre otra igual que
contiene PBS.
Dispense la suspensión celular en una gota en la
caja de petri
Voltear la tapa para formar una gota
colgante
Las célulasse agregan
Los esteroidesse forman
Método de la gota colgante
JUNIO 2019 236 UNIVERSITARIOS POTOSINOS 7MODELOS 3D PARA ESTUDIAR CÁNCER
Método de superficie no adherente
Formación espontánea de
esferoides
Sutherland, McCredie e Inch fueron pio-
neros en técnicas de producción de es-
feroides en 1970, al utilizar un modelo
de sistema in vitro 3D para recrear las
complejidades de un tumor multicelular
para estudiar la respuesta de las célu-
las tumorales humanas al efecto de la
radioterapia. En este método, las placas
de fijación ultrabajas (que contienen
una capa de hidrogel unida covalente-
mente que inhibe de forma eficaz la
fijación celular) se usan recubriéndolas
con un sustrato inerte (agar o poli-2-hi-
droxietil metacrilato poli-HEMA, un polí-
mero que forma un hidrogel en agua),
que evita que las células se adhieran a la
superficie de los pozos, lo que las obliga
a agregarse y formar esferoides.
El método fue mejorado por Andrea
Ivasku y colaboradores en 2006, utili-
zando placas de 96 pocillos de fondo
redondo y cónico (es una microplaca
que contiene hidrogel unido de forma
covalente que minimiza la adhesión
celular, la absorción de proteínas, la
activación de enzimas y la activación
celular) para producir de forma eficien-
te esferoides en 3D a partir de células
cancerosas y no cancerosas. Las placas
utilizadas se recubrieron con 0.5 por
ciento de poli-HEMA y se secaron du-
rante tres días antes de agregarles las
células. Se estudiaron diferentes líneas
celulares y cuando las líneas celulares
específicas no pudieron formar esfe-
roides, se añadió 2.5 por ciento de la
membrana basal reconstituida líquida
(capa de matriz extracelular de sostén
y de un pequeño espesor variable que
se encuentra en la base de los tejidos
epiteliales) a las suspensiones. Esto
llevó a la generación de esferoides 3D
compactos dentro de las 24 horas des-
pués de la centrifugación.
También es posible utilizar placas
prerecubiertas comercialmente donde
la superficie del fondo es hidrófila. La
superficie inferior tiene una carga neu-
tra y se une covalentemente (es decir,
compartiendo sus pares de electrones)
a la superficie de un recipiente de po-
liestireno. Este recubrimiento evita la
adherencia de las células a la superficie,
obligándolas a estar en suspensión y,
en consecuencia, a formar esferoides
3D. El recubrimiento es estable, no cito-
tóxico y no degradable.
Figura 2.
Técnica 3D utilizada para la creación de esteroides.b) Método de superficie no adherente. Las células se siembran en una placa de adhesión ultrabaja que evita que se adhieran.
Método de superficie no adherente
Cultivo de células adherentes
Sembrar las células en una placa de
adhesión ultrabaja
Formación espontánea de
esteroides
UNIVERSITARIOS POTOSINOS 236 JUNIO 20198 ALCÁNTARA, L. PÁGINAS 4 A 10
Las técnicas de formación de esferoi-
des espontáneos son fáciles de usar y
permiten un alto rendimiento de esfe-
roides (placas de 96 o 384 pocillos).
El método es relativamente barato
cuando las placas se recubren interna-
mente, pero las placas prerecubiertas
comercialmente pueden ser más ca-
ras. Los esferoides pueden cultivarse
durante un largo periodo de tiempo y
pueden recuperarse después del culti-
vo. Sin embargo, existen algunos desa-
fíos, como el tamaño y la composición
de los esferoides resultantes (los ta-
maños de esferoides pueden ser de-
masiado heterogéneos), la formación
de esferoides a partir de un pequeño
número de células y el establecimien-
to de la proporción correcta de dos
tipos de células diferentes al realizar
cocultivos en los esferoides (figura 2).
Cultivo en suspensión
El principio de este método es colocar
una suspensión celular dentro de un
contenedor y mantener las células en
suspensión por agitación o aumentando
la viscosidad del medio (agregando car-
boximetilcelulosa, un compuesto orgáni-
co derivado de la celulosa, integrado por
grupos carboximetil enlazados a algunos
grupos hidroxilo). En el enfoque basado
en la agitación, el recipiente puede agi-
tarse o rotarse suavemente. La agitación
continua de las células evitará que se
adhieran a las paredes del recipiente y
promoverá su interacción.
Principalmente hay dos aparatos que
se utilizan en el método de cultivo en
suspensión: matraces giratorios y bio-
rreactores. Los primeros son recipien-
tes en los que se coloca la suspensión
celular y un elemento de agitación
que la mantiene en continuo movi-
miento. Este método simple produce
grandes rendimientos de esferoides.
Cambiar el medio de cultivo de los
matraces giratorios es relativamente
fácil; dado que el fluido de cultivo está
en constante movimiento, los nutrien-
tes y el O2 se transportan a los esferoi-
des y pueden eliminar sus desechos.
Sin embargo, la fuerza de cizallamiento
(o corte) aplicada a las células en ma-
traces giratorios, como resultado del
movimiento de la barra de agitación a
través de la suspensión celular, puede
modificar su fisiología celular.
Cultivos de suspensión
Figura 3.
Técnica 3D utilizada para la creación de esteroides.
c) Cultivos de suspensión. Las células se colocan en matraces giratorios
(izquierda) o biorreactores (derecha) y se ponen bajo
fuerzas gravitacionales.
Sembrar células Esteroides Sembrar células
Bior
eact
or
Mat
race
s gira
torio
s
Esteroides
JUNIO 2019 236 UNIVERSITARIOS POTOSINOS 9MODELOS 3D PARA ESTUDIAR CÁNCER
Otro inconveniente del método es la
producción de una amplia gama de
tamaños de esferoides, que pueden
ser un problema cuando se utilizan
para ensayos de detección de drogas,
ya que para éstos se necesita unifor-
midad en el tamaño de los esferoides.
Para abordar esto, los esferoides pue-
den formarse, en un primer paso, uti-
lizando placas de fijación ultrabajas, y
luego pueden transferirse a matraces
giratorios después de seleccionar el
tamaño correcto de esferoides. Esto
es necesario cuando se miden conti-
nuamente los tamaños de esferoides
para determinar los efectos del trata-
miento en su crecimiento.
Por su parte, los biorreactores son si-
milares a los matraces giratorios, pero
en lugar de mezclar la suspensión ce-
lular con una barra de agitación o una
varilla, se gira el recipiente de cultivo.
Fueron diseñados por la Administra-
ción Nacional de Aeronáutica y del Es-
pacio (NASA, por sus siglas en inglés)
en 1992 para cultivar células y tejidos
durante un vuelo espacial.
Los biorreactores están disponibles en
diferentes tamaños para permitir la pro-
ducción de grandes cantidades de esfe-
roides. De manera similar a los matraces
giratorios, los biorreactores no permiten
el control del tamaño de los esferoides,
por lo que puede incluirse un paso
previo para seleccionarlos del mismo
tamaño. Las fuerzas de cizallamiento
aplicadas a las células no son tan signifi-
cativas en los biorreactores como en los
matraces giratorios (figura 3).
¿Que es el microambiente tumoral?
Durante mucho tiempo se observó
que la iniciación, progresión y me-
tástasis (propagación) de un tumor
se debía simplemente a cambios en
la población de células neoplásicas
(es decir, cualquier crecimiento des-
controlado de células o tejidos anor-
males —benignos o malignos— en el
organismo) y los tejidos adyacentes
no neoplásicos se consideraban es-
pectadores. La importancia del mi-
croambiente tumoral surgió de la
observación, cuando se encontraron
cambios en histopatología (exámenes
microscópicos de tejido), en la inter-
faz (comunicación) entre las células
tumorales y los tejidos no neoplásicos
circundantes durante la carcinogéne-
sis (proceso por el cual una célula
sana se convierte en cancerosa).
Ahora se sabe que el microambiente
tumoral es una entidad especializada,
Figura 4.
a) Cultivo 3D utilizado para la creación de esteriodes.b) Esteroides mostrando sus características y su composición celular.
CO2, lactato
Célula cancerosa Sitio de adhesión
Debris celular
Capa exterior
Capa interior y núcleo hipóxico
Organización de diferentes tipos celulares
O2 Factores de crecimientodrogas, citocinas
UNIVERSITARIOS POTOSINOS 236 JUNIO 201910 ALCÁNTARA, L. PÁGINAS 4 A 10
Doctora en ciencias biológicas por la UNAM. Es Catedra Conacyt adscrita a la Facultad de Enfermería y Nutrición de la UASLP. Trabaja en el proyecto “Cultivo celular de células mesenquimales extraídas de diferentes fuentes y su interacción con biomateriales para la aplicación clínica”.
LUZ EUGENIAALCÁNTARA QUINTANA
dinámica, interactiva y en constante
cambio. Comprende diferentes células
que son colectivamente importantes
para la homeostasis (autorregulación)
del tejido normal, así como la progre-
sión del tumor, la migración y la resis-
tencia a la quimioterapia (figura 4).
Entender el cáncer
Para comprender mejor dichos meca-
nismos y desarrollar las estrategias de
bloqueo adecuadas, es necesario utili-
zar modelos complejos apropiados de
cultivo de tumores y microambientes.
Las plataformas de cultivo celular en
3D ayudan a sortear limitaciones, al
preservar la forma original, la polariza-
ción, el perfil genético y la heteroge-
neidad del cáncer y las células estro-
males (son células multipotenciales
primitivas con morfología fibroblastoi-
de, originadas a partir de la capa ger-
minal mesodermal y con la capacidad
de diferenciarse en diversos tejidos).
Además, la evaluación de la eficacia o
el desarrollo de un fármaco requerirá
la medición precisa de la viabilidad y
del metabolismo de las células.
El cultivo celular es una herramienta
indispensable para ayudar a descubrir
procesos fundamentales del cáncer y
nuevas terapias. Está claro que la in-
vestigación ha cambiado la dirección
del cultivo al utilizar estructuras 3D,
con microentornos bioquímicos y bio-
mecánicos más realistas. En general,
es probable que los sistemas 3D ofrez-
can un sustituto cada vez más atractivo
para el cultivo de células, ya que los
avances en el campo producen una
variedad más amplia de métodos.
Un enfoque sensato por ahora sería
combinar el método 3D adaptado de
mejor forma con un cultivo clásico,
para mejorar la selección de nuevas
dianas terapéuticas (una diana tera-
péutica o blanco molecular puede
definirse como el lugar del organismo
donde un fármaco ejerce su acción),
antes de la evaluación preclínica de
quimioterapias.
Su relevancia clínica se debe a que
permitirá comprender los mecanis-
mos que confieren resistencia a las
células cultivadas en esferoides de
cada paciente que se trata, y realizar
una terapia personalizada que impac-
te en su calidad de vida.
Referencias bibliográficas:Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C. y Pasquier, J. (2018).
Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interac-tions? International Journal of Molecular Sciences, 19(181), pp. 1-24. https://doi:10.3390/ijms19010181
Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. (2016). In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 4(12), pp.1-14. https://doi.org/10.3389/fbioe.2016.00012
Jorgensen, A., Young, J., Nielsen, J. E., Joensen, U. N., Toft, B. G., Rajpert-De Meyts, E. y Loveland, K. L. (2014). Hanging drop cultures of human testis and testis cancer samples: A model used to investigate activin treatment effects in a preserved niche. British Journal of Cancer, 110, pp. 2604-2614. https://doi: 10.1038/bjc.2014.160
Sutherland, R. M., McCredie, J. A. e Inch, W. R. (1971). Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. Journal of the National Cancer Institute, 46(1), pp.113-120. https://doi.org/10.1093/jnci/46.1.113
Ivascu, A. y Kubbies, M. (2006). Rapid generation of single-tu-mor spheroids for high-throughput cell function and toxicity analysis. Journal of Biomolecular Screening, 11(8), pp. 922-932. https://doi:10.1177/1087057106292763