DESCUBRIENDO LA ESTRUCTURA DE DESCUBRIENDO LA ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS LAS PROTEÍNAS Lucía Pérez CoelloLucía Pérez Coello

A alumna Lucía Pérez Coello, de 2º de bacharelato do I. E. S. Otero Pedrayo de Ourense, estivo durante o verán do 2009 no IBCM (Instituto de Bioloxía Celular e Molecular de Oporto), participando no programa Estancias Científicas (ESCIVE), organizadas en España pola Fundación Española para la Ciencia y la Tecnología (FECYT).

A CONTINUACIÓN PRESÉNTANOS O TRABALLO DESENVOLVIDO DESPOIS DA SÚA ESTANCIA.

ESCIVE

OBJETIVO: impulsar el contacto de jóvenes de entre 15 y 17 años con el trabajo cotidiano en centros y departamentos de investigación españoles y portugueses.

http://www.youtube.com/watch?v=cehkhV6AIlA&feature=player_embedded

IBMC

Instituto

Biología

Molecular

Celular

BIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN E INMUNOLOGÍA

BIOLOGÍA MOLECULAR Y ESTRUCTURAL

BIOMATERIALES

GENÉTICA HUMANA Y DOLENCIAS GENÉTICAS

MECANISMOS DE ADAPTACIÓN CELULAR

NEUROBIOLOGÍA BÁSICA Y CLÍNICA

SEÑAL E IMAGEN

Descubriendo la Descubriendo la estructura de las estructura de las

proteínasproteínas

Lucía Pérez Coello

Felipe Demígio Fernandes Pereira

ESCIVE – Ciencia Viva2009

Objetivo

• Estudiar la estructura de las proteínas;

• Comprender su función;

• Determinar los mecanismos de

funcionamiento e interacción con otras

moléculas.

Lisozima

• Enzima

• Estructura tridimensional determinada por primera vez por David Phillips, en 1965.

• Se encuentra en las lágrimas, saliva y moco humanos.

• Producida por varios organismos.

• Destruye la pared celular de las bacterias. Estrutura primária da Lisozima

Pasos para determinar estructuras de

proteínas

1. Producción de 1. Producción de proteínasproteínas

• Clonación

• Expresión (Escherichia coli)

• Purificación Cromatografia• Filtración en gel• Intercambio iónico• Afinidad

2. Cristalización2. Cristalización

MEJORA DE LOS CRISTALES

Las proteínas, como muchas moléculas, pueden ser llevadas a formar cristales cuando son colocadas en condiciones apropriadas. Para que cristalice, la proteína purificada es sometida a una precipitación lenta a partir de una disolución acuosa.

ENSAIOS DE CRISTALIZACIÓN

CONDICIONES DE CRISTALIZACIÓN

OPTIMIZACIÓN

Métodos de cristalización

• Gota colgante

• Gota sentada

•Diálisis

•Difusión en gel

Diagram of hanging drop method. Reservoir solution (blue) usually contains buffer and precipitant. Protein solution (red) contains the same compounds, but in lower concentrations. The protein solution may also contain trace metals or ions necessary for precipitation of particular proteins (McRee, 1993).

  1   2   3   4   5   6

A            

   

B            

   

C            

   

D            

                       

30 mg/mL 20 mg/mL 10 mg/mL

8+2

7+3

6+4

5+5

(L)

• Preparamos 3 disoluciones (de concentraciones diferentes) que contengan Lisozima en 0,1 M NaAc pH 4.8

• Disolución reservorio: 1 ml de 10% (m/v) NaCl, 0,1 M NaAc pH 4,8 e 25% (v/v) Etilenoglicol

• La gota de la lámina contiene: 6-7 L de disolución de Lisozima y 4-3 L de disolución reservorio (volumen total de 10 L)

•Ponemos las láminas sobre los pozos y los sellamos con silicona

• Los cristales deben crecer dentro de 1-2 días y estar preparados para enfriamiento criogénico.

NUESTROS NUESTROS CRISTALESCRISTALES

Próximos pasos

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/73/X_ray_diffraction.png

Se obtiene una muestra y se somete a

enfriamiento criogénico para evitar que se

desestabilice.

DifractómetroDifractómetro

Montaje del cristalMontaje del cristal

3. Difracción3. Difracción

Ley de Bragg :

n= 2d sin

Construyendo el modeloConstruyendo el modeloLos mapas de densidad electrónica son el resultado final del experimento de difracción. Su interpretación en términos de un modelo molecular es la primer tarea del cristalográfo.

Estructuras Estructuras en 3D en 3D

LysozymeLysozyme

http://lysozyme.co.uk/lysozyme-structure.php

Presentación del trabajo realizado