Post on 28-Oct-2018
Diagnóstico molecular de
tuberculosis
Santiago Atehortúa Muñoz
MD Microbiólogo
Hospital Universitario de San Vicente Fundación.
www.sanvicentefundacion.com
Amplificación y detección de Ácidos nucleicos
Es la amplificación de ADN por PCR
una solución para el diagnóstico de
tuberculosis?
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
› Replicación de ácidos nucleicos basados en cambios de
temperatura mediados por una enzima.
› Consiste en tres pasos: Extracción – Amplificación - Detección
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PCR convencional
Hibridación Tiempo Real
Ventajas de los métodos moleculares
› Pruebas rápidas a partir de muestras clínicas.
› Diferencian e identifican microorganismos.
› Detectan microorganismos viables y no viables.
› Alta sensibilidad y especificidad.
› Detección de genes implicados en resistencia.
• 511.000 casos de TB-MDR (Resistencia INH – RIF).
290 .000 nuevos casos
221 .000 casos previamente tratados para TB
Epidemiología de la resistencia
• De acuerdo a la resistencia a los medicamentos
antituberculosos M. tuberculosis puede ser:
MDR XDR
Resistente al menos a
Isoniazida y Rifampicina
MDR con resistencia una
Quinolona ( Ofloxacina,
Levofloxacina) y algunos de los
medicamentos inyectables:
Kanamicina, Amikacina o
Capreomicina
TB monorresistente:
Resistente a un
solo fármaco.
Bases genéticas de la resistencia en M. tuberculosis
› Resistencia fenotípica = explicada por mutaciones en genes
específicos.
› La mayoría son cambios en un solo nucleótido (mutaciones
puntuales).
› > 95% de la resistencia a RIF tienen un único punto de mutación en
el gen rpoB
› 70 – 90 % de cepas resistentes a INH se detectan con la
secuenciación de la región promotora inhA, el gen inhA y el gen
katG.
www.cdc.gov
Ventajas de la detección rápida de resistencia
› Iniciar un tratamiento eficaz desde el principio.
› Reducir los periodos de contagio en los casos MDR hasta por 8
semanas
› Mejorar la respuesta clínica en los pacientes
› En EEUU se estima que la prevención de un solo caso de TB MDR le
ahorra al sistema mas de $ 250.000
www.cdc.gov
Pruebas de biología molecular para diagnóstico de
tuberculosis y detección de genes de resistencia
disponibles
› Muestras Pulmonares
› GeneXpert MTB/RIF
› Anyplex II
› MTB DR plus
› Muestras Extrapulmonares*
› GeneXpert MTB/RIF
10*Excepto sangre
Muestras baciloscopia negativas
GeneXpert MTB/RIF
1. Licuefacción del
esputo
2. 2ml
muestra al
cartucho.
3.Cartucho se
inserta dentro
plataforma
4. Muestra
automáticamente
es lavada y filtrada
5. Lisis por ultrasonido
filtro-captura
organismos para
liberar el ADN
6. amplificacióny detección en
tiempo real
7. Impresión de
resultados
PRUEBA genexpert MTB/rif
Tiempo del resultado, 1 hora y 45min
September 1, 2010, at NEJM.org. (10.1056/NEJMoa0907847)
Oscar Iván Quirós Gómez, Santiago Atehortúa Muñoz, Gloria Elena Durango,
Ana Milena Herrera, Sigifredo Ospina Ospina.
HUSVP – CES 2010
Utilidad de una técnica de biología molecular para el
diagnóstico de tuberculosis pulmonar. Hospital Universitario
San Vicente de Paúl 2010
Pruebas de sensibilidad
determinadas por PCRn %
Sensible 10 50
Resistente RIF + INH 3 15
Indeterminada 7 35
Total 20 100
Sensibilidad: 86.7 %
Especificidad: 93.7 %
VPP: 72.2%
VPN: 97.4%
sensibilidad en muestras con baciloscopia
positiva fue 100% y de 60% en muestras
con baciloscopia negativa
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Anyplex™ II MTB / MDR / XDR Detection
TOCE ™ es una nueva tecnología de lectura en tiempo real que se
basa en el análisis de temperatura de fusión.
PCR en tiempo real múltiplex
Anyplex™ II MTB / MDR / XDR Detection
› Permite la amplificación simultánea y la
detección de secuencias diana de M.
tuberculosis y genes de resistencia.
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Anyplex MTBDRplus Xpert
Principio PCR TR multiplex de
dos pasos.
Hibridación inversa PCR en Tiempo real
Resultado final MTBC, RIF, INH,
Quinolonas, Aminogl
MTBC, RIF, INH MTBC, RIF
Tiempo 3.5 h 5.35 h 2 h
Infraestructura
requerida
Sistema abierto (3 áreas
separadas)
Sistema abierto (3 áreas
separadas)
Sistema cerrado (área
control temperatura)
Sensibilidad global
(cultivo positivo MTB)
65.5% 70.9% 89.1%
Baciloscopia
Positiva
91.3% 100% 100%
Baciloscopia
Negativa
46.2% 46.2% 80.8%
Xpert: Fue superior en muestras BK negativas.
Correlación de sensibilidad a antiTB fue similar en las tres pruebas.
Interpretación pruebas moleculares M. tuberculosis
› CDC (Centros de Control y Prevención de Enfermedades):
Directo positivo
Prueba molecular positiva
Diagnóstico confirmado
TB pulmonar.
Directo positivo
Prueba molecular negativa
Buscar inhibidores,
otras Mycobacterias
Directo negativo
Alta sospecha clínica
Prueba molecular
(dxpresuntivo)
Directo negativo
Baja sospecha clínica
Prueba molecular no recomendada
Interpretación pruebas moleculares M. tuberculosis
Limitaciones de las pruebas moleculares
› Falsos Positivos:
› Contaminación de la muestra.
› Mal diseño de primers.
› Dx antiguo de Tb tratados
› Falsos negativos:
› Degradación del material genético.
› Mala preparación, transporte y almacenamiento de la
muestra.
› Problemas con los reactivos.
› Carga bacilar baja, elección inadecuada de la técnica.
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Discrepancias en las pruebas moleculares comparada
con pruebas convencionales de susceptibilidad
Prueba molecular
Sensible
Resistente
Prueba convencional
Resistente
Sensible
Interpretación
- Mutaciones codificadas por fuera región evaluada.
- Otros mecanismos de resistencia.
- Bajo nivel de resistencia.
- Poblaciones mixtas.
En quiénes pueden estar indicadas las pruebas?
› Paciente con HIV ó SIDA.
› Inmunosuprimidos (Esteroides, anti TNF)
› Sospecha de fracaso, recaída o reingreso por abandono.
› Sospecha de Tuberculosis extrapulmonar
› Contacto de paciente con multi-resistencia
› Pacientes pediátricos
› Personas privada de la libertad, indigentes y personal de la salud.
› PACIENTES CON ALTA SOSPECHA CLÍNICA Y SIN CONFIRMACIÓN
MICROBIOLÓGICA.
› La biología molecular es una buena herramienta en el apoyo
diagnóstico de la Tuberculosis.
› Gran impacto para el control de la tuberculosis en especial la MDR.
› Los resultados deben interpretarse siempre en conjunto con las
características clínicas, epidemiológicas y de laboratorio.
Conclusiones
OPS/OMS hace especial énfasis en que NINGUNO de estos
métodos reemplaza los que hasta el día de hoy son considerados
de referencia (BK, cultivo, PSF convencionales)
SON COMPLEMENTARIOS