Post on 06-Feb-2022
Autora: Clara Arias Sojo
Tutora: Nuria Cañameras Riba
20/09/2021
Treball final de grau
Enginyeria de Sistemes Biològics
EFECTE DE DIFERENTS CONDICIONS DE CULTIU DURANT LA FASE DE
MULTIPLICACIÓ in vitro DE Cannabis sativa L cv. Carmagnola
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 1
Resum
En l’estudi realitzat s’analitzen els efectes que poden generar diversos medis de cultiu en la fase de
multiplicació de Cannabis sativa cv. Carmagnola. Els medis de cultiu emprats han estat el medi de
Murashigue i Skoog (1962) i el medi β proporcionat per l’empresa Valenveras S.L., amb l’addició de
l’hormona citoquinínica thidiazuron a diferents concentracions.
S’han realitzat dos assajos, un per a cada medi de cultiu, on s’apliquen diversos tractaments combinant
la concentració de citoquinina, el tipus d’agar i recipient de cultiu utilitzat.
S’han analitzat diversos paràmetres com la longitud, taxa total, taxa viable, pes fresc, pes sec i
contingut hídric dels microbrots obtinguts. També s’han quantificat altres variables com la floració, la
formació de cal·lus, la presencia d’olor i l’aparició d’hiperhidricitat.
D’acord amb resultats obtinguts, s’observa diferents comportaments segons el subcultiu. A més a més,
no es pot establir un medi de cultiu que permeti obtenir taxes elevades de multiplicació.
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 2
Resumen
En el estudio realizado se analizan los efectos que pueden generar diversos medios de cultivo en la fase
de multiplicación de Cannabis sativa cv Carmagnola. Los medios de cultivo utilizados han sido el medio
de Murashige y Skoog (1962) y el medio β proporcionado por la empresa Valenveras S.L., con la adición
de la hormona citoquinínica thidiazuron en diferentes concentraciones.
Se han realizado dos ensayos, uno para cada medio de cultivo, donde se aplican diversos tratamientos
combinando la concentración de citoquinina, el tipo de agar y recipiente de cultivo utilizado.
Se han analizado diversos parámetros como la longitud, tasa total, tasa viable, peso fresco, peso seco y
contenido hídrico de los microbrotes obtenidos. También, se han cuantificado variables como la floración,
la formación de calus, la presencia de olor y la aparición de hiperhidricidad.
En los resultados obtenidos, se observan diferentes comportamientos según el subcultivo. Además, no se
puede establecer un medio de cultivo que permita obtener tasas elevadas de multiplicación.
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 3
Abstract
The study analyzes the effects that can be generated by various culture media in the multiplication
phase of Cannabis sativa cv. Carmagnola. The culture media used were the Murashigue and Skoog
(1962) medium and the β medium provided by the company Valenveras S.L., with the addition of
thidiazuron in different concentrations.
Two assays have been performed, one for each culture medium, where various treatments are applied
combining the cytokine concentration, the type of agar and culture vessel used.
Various parameters have been analyzed such as the length, total rate, viable rate, fresh weight, dry
weight and water content of the vegetal material obtained. Other variables have also been quantified
such as flowering, callus formation, the presence of scent and the appearance of hyperhydricity.
Acoording to the results obtained, different behaviors are observed depending on the subculture. In
addition, it is not possible to establish a culture medium that allows high rates to be obtained.
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 4
Contingut
Índex de figures ...................................................................................................................................... 6
Índex de taules ....................................................................................................................................... 7
Símbols i acrònims .................................................................................................................................. 9
Agraïments ........................................................................................................................................... 10
1. INTRODUCCIÓ ............................................................................................................................... 11
1.1. Origen de l’espècie ................................................................................................................ 11
1.2. Botànica ................................................................................................................................ 11
1.3. Cannabinoides ....................................................................................................................... 12
1.4. Cultivars de cànem i requisits legislatius de cultiu ............................................................... 15
1.5. Cultiu in vitro del Cànem ....................................................................................................... 16
1.6. Motivació de l’estudi............................................................................................................. 18
2. Objectius ....................................................................................................................................... 19
2.1. Objectiu principal .................................................................................................................. 19
2.2. Objectius secundaris ............................................................................................................. 19
3. Material i mètodes ........................................................................................................................ 20
3.1. Material vegetal .................................................................................................................... 20
3.2. Medis base de cultiu ............................................................................................................. 20
3.2.1. Solucions mare .............................................................................................................. 20
3.2.2. Preparació dels medis de cultiu .................................................................................... 22
3.3. Condicions de treball ............................................................................................................ 24
3.4. Assajos de multiplicació ........................................................................................................ 25
3.4.1. Primer assaig ................................................................................................................. 25
3.4.2. Segon assaig .................................................................................................................. 27
3.4.3. Paràmetres de control .................................................................................................. 29
3.4.4. Tractament estadístic .................................................................................................... 30
4. Resultats ........................................................................................................................................ 32
4.1. Assaig de multiplicació medi β .............................................................................................. 32
4.1.1. Longitud ........................................................................................................................ 32
4.1.2. Taxa total....................................................................................................................... 35
4.1.3. Taxa viable..................................................................................................................... 38
4.1.4. Pes fresc ........................................................................................................................ 41
4.1.5. Pes sec ........................................................................................................................... 44
4.1.6. Contingut hídric ............................................................................................................. 47
4.1.7. Presència de flors .......................................................................................................... 49
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 5
4.1.8. Presència d’olor ............................................................................................................ 50
4.1.9. Hiperhidricitat ............................................................................................................... 52
4.1.10. Formació de cal·lus ....................................................................................................... 53
4.2. Assaig de multiplicació medi MS ........................................................................................... 55
4.2.1. Longitud ........................................................................................................................ 56
4.2.2. Taxa total....................................................................................................................... 57
4.2.3. Taxa viable..................................................................................................................... 58
4.2.4. Pes fresc ........................................................................................................................ 59
4.2.5. Pes sec ........................................................................................................................... 61
4.2.6. Contingut hídric ............................................................................................................. 62
4.2.7. Presència de flors .......................................................................................................... 63
4.2.8. Presència d’olor ............................................................................................................ 63
4.2.9. Hiperhidricitat ............................................................................................................... 64
4.2.10. Formació de cal·lus ....................................................................................................... 65
5. Discussió dels resultats ................................................................................................................. 66
6. Conclusions ................................................................................................................................... 69
Bibliografia ............................................................................................................................................ 70
Annex estadístic .................................................................................................................................... 76
Assaig de multiplicació medi β .......................................................................................................... 76
Subcultiu A .................................................................................................................................... 76
Subcultiu B .................................................................................................................................... 79
Assaig de multiplicació medi MS ....................................................................................................... 82
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 6
Índex de figures
Figura 1 - Esquema general de la biosíntesi de metabòlits primaris i secundaris de C.sativa) ............ 14
Figura 2 - Aplicacions del Cannabis sativa legals i il·legals segons el contingut en THC ....................... 16
Figura 3 - Medi de cultiu preparat en tubs d'assaig i pots de cultiu ..................................................... 23
Figura 4 - Microbrots viables ................................................................................................................ 24
Figura 5 - Esterilitzador per radiació infraroja Sterilbio (J.P. Selecta, S.A.)........................................... 24
Figura 6 - Tubs i pots amb material vegetal a la cambra d'incubació ................................................... 29
Figura 7 - Longitud dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A) ............................................ 33
Figura 8 - Longitud dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B) ............................................ 35
Figura 9 - Taxa total dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A) .......................................... 36
Figura 10 - Taxa total dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B) ........................................ 38
Figura 11 - Taxa viable dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A) ...................................... 39
Figura 12 - Taxa viable dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B) ...................................... 40
Figura 13 - Pes fresc dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A) .......................................... 42
Figura 14 - Pes fresc dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B) .......................................... 43
Figura 15 - Pes sec dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A) ............................................ 45
Figura 16 - Pes sec dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B) ............................................ 46
Figura 17 - Contingut hídric dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A) .............................. 47
Figura 18 - Contingut hídric dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B) .............................. 48
Figura 19 - Material vegetal cultivat en pot i en tub d'assaig ............................................................... 55
Figura 20 - Longitud dels microbrots per a cada tractament (MS) ....................................................... 56
Figura 21 - Taxa total dels microbrots per a cada tractament (MS) ..................................................... 58
Figura 22 - Taxa viable dels microbrots per a cada tractament (MS) ................................................... 59
Figura 23 - Pes fresc dels microbrots per a cada tractament (MS) ....................................................... 61
Figura 24 - Pes sec dels microbrots per a cada tractament (MS) ......................................................... 62
Figura 25 - Contingut hídric dels microbrots per a cada tractament (MS) ........................................... 63
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 7
Índex de taules
Taula 1 - Classificació dels components trobats ................................................................................... 12
Taula 2 - Diverses aplicacions farmacològiques de cànnabis medicinal, THC i altres component ....... 13
Taula 3 - Llistat de varietats permeses per a la producció industrial (Comissió Europea,2020) .......... 15
Taula 4 - Composició del medi base de Murashige i Skoog (1992) ....................................................... 21
Taula 5 - Composició del medi β ........................................................................................................... 22
Taula 6 - Longitud (Subcultiu A, Tub) .................................................................................................... 33
Taula 7 - Longitud (Subcultiu A, Pot) ..................................................................................................... 33
Taula 8 - Longitud (Subcultiu B, Tub) .................................................................................................... 34
Taula 9 - Longitud (Subcultiu B, Pot) ..................................................................................................... 34
Taula 10 - Taxa total (Subcultiu A, Tub) ................................................................................................ 36
Taula 11 - Taxa total (Subcultiu A, Pot) ................................................................................................. 36
Taula 12 - Taxa total (Subcultiu B, Tub) ................................................................................................ 37
Taula 13 - Taxa total (Subcultiu B, Pot) ................................................................................................. 37
Taula 14 - Taxa viable (Subcultiu A, Tub) .............................................................................................. 39
Taula 15 - Taxa viable (Subcultiu A, Pot) ............................................................................................... 39
Taula 16 - Taxa viable (Subcultiu B, Tub) .............................................................................................. 40
Taula 17 - Taxa viable (Subcultiu B, Pot) ............................................................................................... 40
Taula 18 - Pes fresc (Subcultiu A, Tub) .................................................................................................. 41
Taula 19 - Pes fresc (Subcultiu A, Pot) .................................................................................................. 41
Taula 20 - Pes fresc (Subcultiu B, Tub) .................................................................................................. 43
Taula 21 - Pes fresc (Subcultiu B, Pot)................................................................................................... 43
Taula 22 - Pes sec (Subcultiu A, Tub) .................................................................................................... 44
Taula 23 - Pes sec (Subcultiu A, Pot) ..................................................................................................... 44
Taula 24 - Pes sec (Subcultiu B, Tub)..................................................................................................... 46
Taula 25 - Pes sec (Subcultiu B, Pot) ..................................................................................................... 46
Taula 26 - Contingut hídric (Subcultiu A, Tub) ...................................................................................... 47
Taula 27 - Contingut hídric (Subcultiu A, Pot) ....................................................................................... 47
Taula 28 - Contingut hídric (Subcultiu B, Tub) ...................................................................................... 48
Taula 29 - Contingut hídric (Subcultiu B, Pot) ....................................................................................... 48
Taula 30 - Percentatge de floració dels propàguls (A) .......................................................................... 49
Taula 31 - Percentatge de floració dels propàguls (B) .......................................................................... 50
Taula 32 - Percentatge de presència d’olor (A) .................................................................................... 51
Taula 33 - Percentatge de presència d’olor (B) ..................................................................................... 51
Taula 34 - Percentatge d'hiperhidricitat (A) ......................................................................................... 52
Taula 35 - Percentatge d'hiperhidricitat (B) .......................................................................................... 53
Taula 36 - Percentatge de formació de cal·lus (A) ................................................................................ 54
Taula 37 - Percentatge de formació de cal·lus (B) ................................................................................ 54
Taula 38 - Longitud (MS) ....................................................................................................................... 56
Taula 39 - Taxa total (MS) ..................................................................................................................... 57
Taula 40 - Taxa viable (MS) ................................................................................................................... 59
Taula 41 - Pes fresc (MS) ....................................................................................................................... 60
Taula 42 - Pes sec (MS) ......................................................................................................................... 61
Taula 43 - Contingut hídric (MS) ........................................................................................................... 62
Taula 44 - Percentatge de presència d’olor .......................................................................................... 64
Taula 45 - Percentatge d'hiperhidricitat ............................................................................................... 64
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 8
Taula 46 - Percentatge de formació de cal·lus ...................................................................................... 65
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 9
Símbols i acrònims ∆9THC: ∆9 tetrahidrocannabinol
CBD: Cannabidiol
C+P+0: Tractament en pot sense TDZ i agar Comercial
C+P+0,25: Tractament en pot amb 0,25 μM de TDZ i agar Comercial
C+P+0,5: Tractament en pot amb 0,5 μM de TDZ i agar Comercial
C+T+0: Tractament en tub sense TDZ i agar Comercial
C+T+0,25: Tractament en tub amb 0,25 μM de TDZ i agar Comercial
C+T+0,5: Tractament en tub amb 0,5 μM de TDZ i agar Comercial
D+P+0: Tractament en pot sense TDZ i agar Difco
D+P+0,25: Tractament en pot amb 0,25 μM de TDZ i agar Difco
D+P+0,5: Tractament en pot amb 0,5 μM de TDZ i agar Difco
D+T+0: Tractament en tub sense TDZ i agar Difco
D+T+0,25: Tractament en tub amb 0,25 μM de TDZ i agar Difco
D+T+0,5: Tractament en tub amb 0,5 μM de TDZ i agar Difco
EM: Esclerosis múltiple
Intensitat de llum PAR: 60 a 90 μmol m-2s-1
MS: Medi de cultiu de Murashige i Skoog
TDZ: Thidiazuron
THC : Tetrahidrocannabinol
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 10
Agraïments
A la Dra. Nuria Cañameras per permetre la meva participació en aquest projecte i ampliar els meus
coneixements sobre el cultiu in vitro gràcies al seu ajut en la direcció i correcció del treball.
A Olga Gener i Carmen Grech per ajudar-me amb el funcionament del laboratori.
A Marta Ginovart Gisbert per resoldre tots els dubtes sobre l’estadística del treball i sempre estar
disponible quan es requereix el seu ajut.
A l’empresa Valenveras S.L. per proporcionar el material vegetal per a poder estudiar el cultiu in vitro de
Cannabis sativa.
A totes les persones que m’han donat suport durant la realització del treball.
I per últim, a la meva família per creure en mi durant tots aquest anys i al meu avi Martín.
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 11
1. INTRODUCCIÓ
1.1. Origen de l’espècie
Cannabis sativa és una espècie originaria d’Àsia (Ángeles et al., 2014) i el seu ús per a produir
fibres i confeccionar diversos productes tèxtils data del 4000 aC, mentre que el registre en ús en
la medicina tradicional data de 2700 aC. Posteriorment el seu cultiu es va estendre a l’orient mitjà,
Europa i Amèrica del Sud durant el segle XVI (Waldo, 2006).
D’acord amb el coneixement popular se li ha atribuït propietats, entre d’altres, analgèsiques,
relaxants musculars, antidepressives, hipnòtiques, immunosupressores, antiinflamatòries i
ansiolítiques (Russo, 2007).
Es una planta que es pot aprofitar casi en la seva totalitat ja que proporciona fibres tèxtils,
combustible, pot ser un aliment i també pot ser utilitzada com a font medicinal. La planta va passar
de ser recol·lectada a ser cultivada i s’estudia si va ser el primer exemple de domesticació (Ferrer,
2005). Encara que l’espècie vegetal, com acabem de dir, s’ha cultivat i utilitzat des de fa molt
temps, recentment ha sorgit un gran interès terapèutic i industrial (Ángeles et al., 2014).
Es caracteritza per contenir una gran família de compostos anomenats cannabinoides, els quals
majoritàriament, son sintetitzats per aquesta planta i han despertat un gran interès degut al
descobriment del sistema cannabinoide endogen (Ángeles et al., 2014).
1.2. Botànica
És una planta herbàcia anual, pertanyent a la família Cannabaceae, que s’ha cultivat a gairebé a
totes les parts del món des dels tròpics fins als contraforts alpins (Chandra et al., 2017), de fins a
4 m d’alçada, de tija erecta i fulles palmades estipulades on les inferiors son oposades i les
superiors alternes. Les fulles es troben sobre pecíols de fins 7 cm de llarg. Els seus tricomes
glandulars segreguen una resina com a manera de protegir la planta contra agressions externes.
Presenta dos tipus d’inflorescències: masculina i femenina. Les masculines són ramificades, laxes
i amb moltes flors, mentre que, les femenines son denses però amb poques flors (Ángeles et al.,
2014).
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 12
1.3. Cannabinoides
Una de les principals característiques d’aquesta espècie vegetal és la capacitat de segregar
components específics terpenofenòlics (cannabinoides o fitocannabinoides) els quals s’han estudiat
rigorosament des del descobriment de l’estructura química del tetrahidrocannabinol també conegut
com THC. Normalment s’obté una concentració més elevada de THC en els tricomes glandulars de les
flors femenines d’algunes varietats.
S’han trobat en total 565 components de cannabinoides, terpens, flavonoides, alcaloides, estilbens,
amides fenòliques i lignanamides, incloent 120 fitocannabionides (ElSohly et al., 2017).
Les característiques principals d’aquests components estan detallades a la Taula 1 (Flores-Sanchez &
Verpoorte, 2008).
Taula 1 - Classificació dels components trobats
Component Funció
Cannabinoides (THC) Interacció amb tot el sistema de receptors
endògens
Terpens ( Òxid de cariofileno) Activitat antibacteriana i antifúngica, agent
anticoagulant amb plaquetes
Flavonoides Activitat farmacològica i regulació de l’acció dels
cannabinoides
Alcaloides Activitat biològica a baixes dosis
Estilbens Actuen com a mecanisme de defensa en la planta i
tenen capacitat farmacològica (antibacteriana,
antiinflamatòria, protecció cardiovascular...)
Amides fenòliques i lignanamides Activitat citotòxica, antiinflamatòria, analgèsica i
antioxidant
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 13
La capacitat de sintetitzar diversos metabòlits secundaris (Figura 1) amb característiques molt
peculiars fan que la planta capti molt interès a l’industria farmacèutica (Taula 2) (Flores-Sanchez i
Verpoorte, 2008).
Taula 2 - Diverses aplicacions farmacològiques de cànnabis medicinal, THC i altres component
Producte Component / Ingredient actiu
Prescripció / Efectes clínics Administració Referència / Companyia
Cannabis flors varietat Bedrocan®
Flors seques, 18% ∆9-THC i 0,2% CBD
Espacitat amb dolor de l’EM o lesió medul·lar; nàusees i vòmits, radioteràpia, quimioteràpia i medicació contra el VIH; tractament pal·liatiu del càncer i VIH
Fumar Office of Medicinal Cannabis (OMC)
Cannabis flors varietat Bedrobinol®
Flors seques, 13% ∆9-THC i 0,2% CBD
Espacitat amb dolor de l’EM o lesió medul·lar; nàusees i vòmits, radioteràpia, quimioteràpia i medicació contra el VIH; tractament pal·liatiu del càncer i VIH
Fumar Office of Medicinal Cannabis (OMC)
Marinol® THC sintètic (càpsules)
Nàusees i vòmits per quimioteràpia, pèrdua de gana associada a pèrdua de pes pel VIH
Oral Solvay Pharmaceuticals, Inc.
Sativex® Extracte de Cannabis, 27 mg/mL ∆9-THC i 25 mg/mL CBD
Dolor neuropàtic en EM Oromucosal GW Pharm Ltd.
CesametTM THC (càpsules) Nàusees i vòmits per quimioteràpia contra el càncer
Oral Valeant Pharmaceuticals International
Ajulemic acid (CT-3)
∆8-THC-11-oic acidb analog, CB1 and CB2 agonist
Efecte analgèsic en dolor neuropàtic crònic
Oral Karst et al. (2003)
Dexanabinol (HU-211)
11-OH∆8-THCa analog, N-methyl-D-aspartate antagonist
Neuroprotecció Intravenós Knoller et al. (2002)/Pharmos Ltd.
Rimonabant /Acomplia® (SR141716A)
NPCDMPCH, CB1 selective antagonist
Adjunt a la dieta i a l’exercici físic en tractament d’obesitat o amb sobrepès en pacients amb factors de risc associats a diabetis tipus II
Oral Van Gall et al. (2005); Henness et al. (2006)/ Sanofi-Aventis; Aronne (2007)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 14
(Flores-Sánchez i Verpoorte,
2008).
La utilització de una varietat concreta de Cannabis sativa per a una determinada aplicació
d’interès està relacionada amb la concentració de THC i CBD de la varietat (Chandra et al., 2017).
TIPUS
1
2
3
∆9-THC (> 0,5 %) + CBD (>0,5%)
[CBD]> [∆9-THC]
[∆9-THC]
Droga
Tipus intermig
Fibra
Figura 1 - Esquema general de la biosíntesi de metabòlits primaris i secundaris de C.sativa)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 15
1.4. Cultivars de cànem i requisits legislatius de cultiu
Per a poder cultivar Cannabis sativa per a la producció industrial a qualsevol territori de l’estat
espanyol, s’han de complir els següents requisits (Departament d'Acció Climàtica, Agricultura i
Desenvolupament Rural, 2021) (Figura 2):
És necessari utilitzar llavors certificades de varietats inscrites en el Catàleg comú de varietats
d'espècies de plantes agrícoles de la Unió Europea, o de varietats que compten amb una
autorització provisional de comercialització, segons la Decisió 2004/842/CE3 de la Comissió,
d'1 de desembre de 2004, i que tenen un contingut en el principi estupefaent
tetrahidrocannabinol (THC) menor del 0,2%.
El cultiu només pot destinar-se a l'obtenció de fibra, gra i llavors.
Cal fer la Declaració Agrària (DUN), on s’ha de declarar anualment les parcel·les de l’explotació
i la destinació de la producció. Mitjançant aquest tràmit s’inscriurà l’explotació al REGEPA
(Registre General de la Producció Agrícola).
Existeix un nombre molt elevat de varietats de cànem i per tal de distingir les que es consideren de
tipus marihuana (THC > 0,2%) de les que es poden cultivar industrialment (THC < 0,2%) la Unió Europea
ha establert un llistat de varietats relacionades amb la concentració de THC (Taula 3), i que són les
que es poden cultivar en territori espanyol. Com es pot observar a la Taula 3, la varietat emprada en
aquest treball final de grau, Cannabis sativa cv. Carmagnola, es troba dintre del marc de varietats
permeses a nivell Europeu. Aquesta varietat és una de les més antigues aprovades per la Unió
Europea, ja que resulta interessant pel seu elevat contingut en alfa-cel·lulosa, hemicel·lulosa, lignines
i altres components com proteïnes, pectines i aminoàcids.
Taula 3 - Llistat de varietats permeses per a la producció industrial (Comissió Europea,2020)
Adzelviesi Carmaleonte Fedora 17 Gliana Kompolti Olivia Succesiv
Alive SK Chamaeleon Felina 32 Glyana Lipko Orion 33 Teodora
Armanca Codimono Fibranova Helena Lovrin 110 Purini Tiborszallasi
Asso CS Fibrante Henola Marcello Rajan Tisza
Austa Sk Dacia Secuieni Fibrol Ivory Marina Ratza Tygra
Balaton Delta-405 Fibror 79 KC Bonusz Markant Santhica 23 Uniko B
Beniko Delta-llosa Finola KC Dora Matrix Santhica 27 Uso-31
Bialobrzeskie Dioica 88 Futura 75 KC Virtus MGC 1013 Santhica 70 Villanova
Cannakomp Earlina 8 FC Futura 83 KC Zuzana Mietko Secueieni
Jubileu
Ielkopolskie
Carma Eletta Campana Férimon KCA Borana Monoica Silvana Wojko
Carmagnola Epsilon 68 Glecia Kompolti híbrid TC Muka 76 Sofia Zenit
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 16
L’interès en el cultiu del cànem industrial està augmentant ja que permet als agricultors millorar
agronòmicament les condicions de cultiu i alhora pot permetre obtenir un marge brut una mica
més elevat que el d’altres cultius extensius. Quan aquest cultiu s’introdueix en una rotació de
cultius afavoreix que els cereals augmentin el seu rendiment, en torn a un 30% enfront a si aquests
es cultiven en monocultiu (comunicació personal Dr. Gil Gorchs).
(Departament d'Acció
Climàtica,Agricultura i Desenvolupament Rural, 2021).
1.5. Cultiu in vitro del Cànem
La micropropagació in vitro es una tècnica que permet cultivar les espècies vegetals en un entorn molt
controlat (medi de cultiu i condicions ambientals), sota condicions asèptiques per tal d’eliminar
possibles contaminacions exògenes. Segurament, el principal avantatge d’aquesta tècnica de cultiu és
la capacitat d’obtenir un gran nombre de individus en poc temps i en espais més reduïts.
Les condicions de cultiu, especialment el medi, son dissenyades específicament per a realitzar un
creixement òptim de la varietat objecte de multiplicació. Per això, s’estan realitzant diversos estudis
per ajustar les concentracions dels diferents components dels medis de cultiu, principalment els
reguladors de creixement i els nutrients en les diferents fases de la micropropagació.
Figura 2 - Aplicacions del Cannabis sativa legals i il·legals segons el contingut en THC
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 17
Els cultius in vitro consten de les següents fases establertes (Murashige, 1974; Debergh & Maene,
1981):
FASE 0 : Selecció del material vegetal de partida.
FASE I: Introducció del material vegetal a condicions de in vitro. L’objectiu és aconseguir
un cultiu de teixit asèptic, mitjançant una solució desinfectant, que permeti eliminar
possibles contaminacions exògens. Es poden utilitzar diversos tipus d’explants (fulles,
nusos, gemes, cèl·lules vegetals, ...). En el cas de voler obtenir un explant lliure de
qualsevol tipus de contaminació (virus, fongs o bacteris) cal iniciar el cultiu emprant àpexs
meristemàtics.
FASE II: Multiplicació del material vegetal. Es comencen a obtenir nous individus i la
tècnica comença a tenir efecte sobre el propàguls cultivats. Durant aquesta fase es poden
anar realitzant subcultius (cada 4 – 6 setmanes) fins a arribar al nombre d’individus
desitjats o fins que arribin a les característiques físiques necessàries per a passar a la
següent etapa.
FASE III: Allargament i arrelament dels individus obtinguts a l’anterior fase per tal de
preparar-los per sotmetre’ls a les condicions de in vivo.
FASE IV: Aclimatació ex vitro del material vegetal.
Richez-Dumanois et al. (1986) van observar que el cultiu in vitro de C. sativa era viable i que la
proliferació de nous microbrots viables es veia afavorida en presència de citoquinines en el medis de
cultiu. La investigació i innovació del cultiu in vitro d’aquesta espècie s’ha continuat realitzant al llarg
del temps i es segueix observant la capacitat de multiplicació que té ja sigui in vitro o ex vitro (Caplan
et al., 2018; Lata et al., 2010; Marzocchi & Caboni, 2020).
La majoria de les investigacions sobre la micropropagació de l’espècie en condicions in vitro es basen
en la millora dels medis de cultiu per potenciar el desenvolupament dels microbrots cultivats i la seva
potencialitat de formar nous individus viables a partir de l’aplicació de reguladors de creixement.
Wróbel et al. (2020) comenten la importància del temps que passa entre subcultius successius, ja que
han observat que en augmentar el nombre de subcultius la capacitat de generació de nous individus
es veu reduïda. També s’ha relacionat l’aparició de hiperhidricitat i formació de cal·lus amb el temps
entre subcultius (Page, 2020).
Una gran proporció dels estudis realitzats utilitzen com a medi de cultiu el formulat per Murashige i
Skoog ja que dona bons resultats per a multiplicar C.sativa.
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 18
No obstant, existeixen altres medis de cultiu que donen resultats favorables com el medi B5, MB ,
DKW ( medi de Driver i Kuniyuki). Page et al. (2020) compararen els medis esmentats anteriorment i
determinaren que el material vegetal cultivat en medi DKW proporcionava un nombre major de
individus viables. Monthony et al. (2020) afirmen que es pot mantenir material vegetal durant anys
sense observar mortalitat de microbrots quan s’utilitza medi de cultiu DKW.
La propagació de plantes en condicions in vitro està molt influenciada per factors ambientals o per el
tipus de hormona o regulador de creixement aplicat (Lata et al., 2016). Aquest components químics
són clau per a regular el desenvolupament fisiològic de l’espècie durant la micropropagació (George
et al., 2008). S’ha de realitzar un esforç continu per tal d’identificar nous components amb la capacitat
d’estimular un creixement més òptim i evitar l’aparició de trastorns fisiològics en els cultius in vitro
(Tarkowská et al., 2003).
Azcón-Bieto (2000) comenta que les citoquinines son reguladors de creixement que afavoreixen la
divisió cel·lular i la formació de nous orgànuls en diferents espècies vegetals, d’aquí la seva gran
importància en el cultiu in vitro. En el cas de C.sativa, d’acord amb Lata et al (2009) l’aplicació de una
dosi de 0,5 μM de TDZ permet obtenir taxes elevades de formació de nous microbrots.
1.6. Motivació de l’estudi
Aquest TFG ha estat fruit d’un encàrrec de col·laboració entre l’Escola d’Enginyeria Agroalimentària i
de Biosistemes de Barcelona i l’empresa Valenveras, S.L. Aquesta empresa es dedica a la investigació
de plantes que tenen interès medicinal i/o industrial, entre elles el Cannabis sativa.
Prèviament a la realització d’aquest estudi s’han realitzat dos TFG. Un d’ells realitzat per Fernández
(2021) i l’altre per Mangas (2021). Ambdós TFG van tractar la fase d’establiment del cultiu, amb
l’objectiu de determinar una pauta correcta de desinfecció del material vegetal. També es van estudiar
diferents medis de multiplicació en els primers subcultius establerts.
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 19
2. Objectius
2.1. Objectiu principal
L’objectiu principal d’aquest TFG és estudiar l’efecte de diferents medis de cultiu en la fase de
multiplicació in vitro de Cannabis sativa cv. Carmagnola.
2.2. Objectius secundaris
Per tal d’aconseguir l’objectiu principal s’han establert els següents objectius secundaris:
- Avaluar l’efecte d’addicionar agar Difco o Comercial.
- Estudiar la resposta a les diferents concentracions de thidiazuron.
- Observar les possibles variacions en el material vegetal després de diversos subcultius
successius.
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 20
3. Material i mètodes
3.1. Material vegetal
L’espècie vegetal emprada en aquest TFG ha estat Cannabis sativa L. cv. Carmagnola i va ser facilitada
per l’empresa Valenveras, S.L. El material facilitat van ser brots apicals. La font d’explantació emprada
van ser les gemes apicals.
Aquest material va ser introduït a condicions de in vitro en el mes d’octubre del 2020 per tal de
realitzar diferents assajos previs als realitzats en aquest TFG. En conseqüència el material emprat en
el nostre estudi havia estat sotmès a una fase d’iniciació i a una fase de multiplicació amb diferents
subcultius. En concret, abans d’iniciar el primer assaig d’aquest TFG, el material vegetal s’havia
subcultivat en dues ocasions en medis de multiplicació formulats amb la solució base de Murashige &
Skoog (1962) o emprant el medi β, el qual havia estat subministrat per l’empresa esmentada i,
emprant diferents tipus i dosis citoquiníniques. L’interval entre subcultius va ser de 5 setmanes.
3.2. Medis base de cultiu
3.2.1. Solucions mare
Els diferents assajos de multiplicació del material vegetal realitzats en aquest TFG s’han formulat a
partir del medi base de cultiu descrit per Murashige & Skoog (1962) i del medi β. El medi β també és
un medi de cultiu que conté macro i microelements. No es coneix la seva formulació específica ja que
es tracta d’un medi comercial de l’empresa Phytoplant Research. Ambdós medis van ser addicionats
amb compostos orgànics (Taules 4 i 5) i ajustats a pH de 5,7-5,8, utilitzant hidròxid sòdic (0,4 N), ja que
previ a l’ajustament els dos medis eren acidòfils. La gelificació del medi es va fer amb agar. El tipus
d’agar així com el regulador de creixement van ser diferents segons l’assaig realitzat.
Per a la realització del medi MS va caldre preparar prèviament les solucions concentrades dels macro
i micronutrients citats (Taula 4). En el cas del medi β (Taula 5) no va ser necessari fer cap preparació
prèvia, ja que l’empresa facilita la formulació del medi a partir de dues solucions mare preparades
(solucions A i B). Aquestes solucions es mantenien refrigerades a 4 °C.
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 21
Taula 4 - Composició del medi base de Murashige i Skoog (1992)
Sal Mineral Pes (mg/L)
NH4NO3
KNO3
1650
1900
HBO3
KI
Na2MoO4 · 2 H2O
CoCl2 · 6 H2O
6,2
0,83
0,25
0,025
KH2PO4 170
CaCl2 · 2 H2O 440
MgSO4 · 7 H2O 370
MnSO4 · 4 H2O
ZnSO4 · 7 H2O
CuSO4 · 5 H2O
22,3
8,6
0,025
Na2EDTA
FeSO4 · 7 H2O
37,3
27,8
Tiamina ( Vitamina B1) 0,5
Piridoxina ( Vitamina B6 ) 0,5
Àcid nicotínic 0,5
Glicocol·la 2
Inositol 100
Sacarosa 30000
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 22
Taula 5 - Composició del medi β
Sal Mineral Pes (mg/L)
Fórmula β (A) -
Fórmula β (B) -
Tiamina ( Vitamina B1) 0,5
Piridoxina ( Vitamina B6 ) 0,5
Àcid nicotínic 0,5
Glicocol·la 2
Inositol 100
Sacarosa 30000
3.2.2. Preparació dels medis de cultiu
La pauta que es segueix per a preparar cada medi de cultiu és:
1. Afegir 250 mL d’aigua destil·lada per cada litre de cultiu a preparar en un vas de precipitat.
2. Col·locar el vas de precipitat damunt d’una agitador magnètic.
3. Introduir en el vas de precipitat un imant que permeti una agitació constant.
4. Afegir les diverses solucions mare que contenen els components bàsics del medis de cultiu al
vas de precipitat.
5. Afegir el regulador de creixement amb la concentració corresponent.
6. Homogeneïtzar la solució i amb l’ajut d’un matràs aforat enrasar al volum final de medi.
7. Ajustar el pH del medi utilitzant el pH-metre (CRISON model dígit 501). La resolució del aparell
és de 0,01 unitats de pH amb un error de mesura ≤ 0,005. El pH dels medis ha d’estar comprès
entre el valors de 5,7-5,8. Per fer l’ajust en el cas de l’assaig amb medi β, medi amb un pH
molt àcid (pH < 3) cal afegir varies gotes de NaOH 2 N, l’ajust final es fa, al igual que en els
medis MS, amb d’una solució de NaOH de 0,4 N.
8. Pre-escalfar el medi de cultiu en una font de calor (microones) fins arribar a uns 60 °C.
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 23
9. Afegir el compost gelificant (agar: dosis i tipus variable segons tractament) al medi i escalfar
al microones fins arribar a 90 °C.
10. Homogeneïtzar correctament el medi després d’haver afegit l’agar.
11. Repartir el medi de cultiu en tubs d’assaig i pots. Per a als tubs d’assaig s’introdueixen 15 mL
de medi/ tubs d’assaig, es tapen amb els taps d’alumini corresponents (Sero-Taps de la marca
J.P. Selecta S.A.). Per als pots es posen 100 mL de medi / pot, es tapen amb el tap corresponent
i es cobreixen amb film plàstic d’embalatge resistent a l’autoclau.
12. Esterilitzar el medi de cultiu amb una autoclau vertical Presoclave II 30 LA de la marca J.P.
Selecta, S.A. Les condicions han de ser:
- Temperatura 121 °C
- Pressió de vapor 1 bar
- Temps 20 minuts
13. Deixar refredar a temperatura ambient els tubs i pots un cop finalitzat el procés
d’esterilització. Els tubs amb el medi de cultiu cal inclinar-los (45 °) per tal d’evitar l’acumulació
de gotes d’aigua en tota la superfície del medi com a conseqüència de la condensació del
vapor d’aigua. Amb aquesta precaució, l’aigua de condensació només s’acumula en un punt
més baix de la superfície del medi.
14. El medi abans de la seva utilització es deixa reposar, una vegada gelificat, durant 24 h a una
temperatura de 20 °C (Figura 3).
Figura 3 - Medi de cultiu preparat en tubs d'assaig i pots de cultiu
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 24
3.3. Condicions de treball
En tots els assajos les condicions de treball són les mateixes.
Tota manipulació del material vegetal cal fer-la en un entorn estèril per a minimitzar la possibilitat de
contaminar-lo amb fongs o bactèries exògenes, és a dir, presents en el ambient i per això es fa sota
condicions de flux laminar (Figura 4).
Totes les eines que s’utilitzen (pinces, bisturís, paper de filtre, paper mil·limetrat) son esterilitzades a
l’autoclau i desprès son emprades en condicions de flux laminar.
La cambra de flux laminar disposa d’esterilitzadors per radiació infraroja Sterilbio (J.P. Selecta, S.A.)
que faciliten mantenir les pinces i bisturís en condicions estèrils, ja que aquests aparells permeten
sotmetre l’esmentat material a una temperatura de 900 °C (Figura 5). Un temps d’esterilització de 5 s
a 8 s evita contaminacions bacterianes o fúngiques. Cal treballar amb varis jocs de pinces i bisturís, ja
que després d’aquest procés cal deixar refredar-los, abans d’utilitzar-les en el material vegetal, fins a
temperatura ambiental.
Cal connectar la cambra de flux laminar uns 30 min abans de ser utilitzada per assegurar que l’aire que
circula es estèril, després es neteja les superfícies amb una solució d’etanol al 70 %. La major part del
material que s’introdueix dins la cambra de flux laminar, normalment és prèviament ruixat amb una
la solució d’etanol.
Figura 4 - Microbrots viables Figura 5 - Esterilitzador per radiació infraroja Sterilbio (J.P. Selecta, S.A.)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 25
3.4. Assajos de multiplicació
En aquest TFG es van realitzar dos assajos consecutius de micropropagació, és a dir, de multiplicació
del material vegetal en condicions de cultiu in vitro.
Aquests assajos han estat producte de la continuació d’un estudi anterior on es va avaluar l’efecte de
dos medis base de cultiu i diferents tipus de citoquinines. L’espècie i varietat vegetal van ser les
emprades en aquest TFG.
A partir dels resultats obtinguts a l’anterior TFG, (Mangas, 2021), s’han formulat els dos assajos
d’aquest TFG. Per això el regulador de creixement emprat ha estat el thidiazuron (TDZ) , ja que és la
citoquinina que havia permès un millor desenvolupament i taxa de multiplicació (Mangas, 2021).
El TDZ s’ha utilitzat per micropropagar una amplia gamma d’espècies llenyoses a causa de la seva gran
capacitat per estimular la proliferació i regeneració de brots (Huetteman & Preece, 1993; Lu, 1993).
En el dos assajos busquem ajustar la concentració de la citoquinina, veure quins resultats obtenim
utilitzant dues classes d’agar (comercial o Difco-Bacto) i les diferències de multiplicar en tubs o pots
de cultiu.
A l’anterior estudi es va realitzar el cultiu in vitro de Cannabis sativa emprant dosis de 0,25, 0,5 i 1 μM
de TDZ (Mangas, 2021). En aquest treball s’utilitza les dosis 0, 0,25 i 0,5 μM de TDZ per tal de
determinar si per a una concentració més baixa d’hormona citoquinínica s’obtenen millors resultats
en el creixement del material vegetal.
Per tal d’aconseguir suficient estoc per a iniciar l’assaig, va ser necessari fer un subcultiu entre l’assaig
de Mangas (2021) i el nostre (representant un tercer subcultiu) per poder formular la totalitat dels
tractaments. En conseqüència els nostres assaigs van representar un quart i cinquè subcultiu.
3.4.1. Primer assaig
a) Tractaments
L’assaig consta de 12 tractaments, tots ells formulats amb medi β.
3 concentracions de TDZ × 2 tipus d’agar × 2 tipus de contenidor = 12 tractaments
● Tres concentracions TDZ:
- 0 μM
- 0,25 μM
- 0,5 μM
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 26
● Dos tipus d’agar:
- Agar Comercial de la marca Scharlau
- Agar Difco-Bacto
● Tipus de recipient on es cultiva:
- Tub d’assaig de vidre
- Pot de vidre
El material emprat va ser:
- Tubs d’assaig (1 propàgul/tub d’assaig) : 24 tubs/tractament = 24 propàguls/tractament
- Pots de vidre: 3 pots/tractament. En cada pot s’inserien 8 propàguls; 8 × 3 = 24
propàguls/tractament
El material vegetal que va ser necessari per a fer l’assaig amb els 12 tractaments fou:
Material vegetal per tubs d’assaig:
6 𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡𝑠 ·24 𝑝𝑟𝑜𝑝à𝑔𝑢𝑙𝑠
𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡= 144 𝑝𝑟𝑜𝑝à𝑔𝑢𝑙𝑠
Material vegetal per pots:
6 𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡𝑠 ·3 𝑝𝑜𝑡𝑠
𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡·
8 𝑝𝑟𝑜𝑝à𝑔𝑢𝑙𝑠
𝑝𝑜𝑡= 144 𝑝𝑟𝑜𝑝à𝑔𝑢𝑙𝑠
Per a dur a terme l’assaig vam necessitar 288 propàguls.
b) Medi de cultiu
Per a cada concentració hormonal es va necessitar:
- Tubs d’assaig: 24 tubs de 15 mL cada tub i per a dos tipus diferent d’agar.
Volum de medi β per a una concentració de TDZ, dos tipus d’agar i en tub:
24 𝑡𝑢𝑏𝑠/𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡 ·15 𝑚𝐿
1 𝑡𝑢𝑏· 2 𝑡𝑖𝑝𝑢𝑠 𝑑′𝑎𝑔𝑎𝑟 = 720 𝑚𝐿/𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡
- Pots: 3 pots amb 100 mL de medi i per a dos tipus d’agar.
Volum de medi β per a una concentració hormonal, dos tipus d’agar i en pot:
3 𝑝𝑜𝑡𝑠/𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡 ·100 𝑚𝐿
1 𝑝𝑜𝑡· 2 𝑡𝑖𝑝𝑢𝑠 𝑑′𝑎𝑔𝑎𝑟 = 600 𝑚𝐿/𝑡𝑟𝑎𝑐𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡
Per a una concentració hormonal van ser necessaris 1320 mL de medi de cultiu, per tant, per a tres
concentracions de citoquinina diferent es necessitaren 3960 mL.
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 27
c) Selecció del material vegetal
Es van introduint un a un els 288 micropropàguls, procedents dels microbrots obtinguts en l’estudi
anterior, aleatòriament en els tubs i pots de cultiu de cada tractament. No es va agafar cap microbrot
que hagués iniciat el procés de floració, ja que per aquest estudi no ens interessava que la floració
pogués distorsionar els resultats.
Els tubs d’assaig amb els nous propàguls es van col·locar a les gradetes corresponents i juntament amb
els pots es van traslladar a la cambra d’incubació on van estar durant 5 setmanes en les següents
condicions de cultiu:
- Temperatura: 24 °C ± 1
- Intensitat de llum : 60 a 90 μmol m-2s-1
- Fotoperíode : 16 hores de llum i 8 hores de foscor
- Tipus de llum: Fluorescent Grolux
Aquest assaig es va repetir 2 vegades fent dos subcultius successius.
3.4.2. Segon assaig
a) Tractaments
L’assaig consta de 6 tractaments, tots ells formulats amb medi MS.
3 concentracions de TDZ × 1 tipus d’agar × 2 tipus de contenidor = 6 tractaments.
Tres concentracions TDZ:
- 0 μM
- 0,25 μM
- 0,5 μM
Tipus d’agar:
- Agar Comercial de la marca Scharlau
Tipus de recipient on es fa el cultiu:
- Tub d’assaig de vidre
- Pot de vidre
El material emprat va ser:
- Tubs d’assaig (1 propàgul/tub d’assaig): 24 tubs/tractament 24 propàguls/tractament
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 28
- Pots de vidre: 3 pots/tractament. En cada pot s’introdueixen 8 propàguls 8 × 3= 24
propàguls/tractament.
El material vegetal que es va necessitar per a realitzar l’assaig:
Material vegetal per tubs d’assaig:
3 𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡𝑠 ·24 𝑝𝑟𝑜𝑝à𝑔𝑢𝑙𝑠
𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡= 𝟕𝟐 𝒑𝒓𝒐𝒑à𝒈𝒖𝒍𝒔
Material vegetal per pots:
3 𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡𝑠 ·3 𝑝𝑜𝑡𝑠
𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡·
8 𝑝𝑟𝑜𝑝à𝑔𝑢𝑙𝑠
𝑝𝑜𝑡= 𝟕𝟐 𝒑𝒓𝒐𝒑à𝒈𝒖𝒍𝒔
En total es necessitava 144 propàguls per aquest assaig.
b) Medi de cultiu
Per a cada concentració hormonal es va necessitar:
- Tubs d’assaig: 24 tubs de 15 mL cadascun
Volum de medi MS per a cada concentració de TDZ i per un tipus d’agar
24 𝑡𝑢𝑏𝑠/𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡 ·15 𝑚𝐿
𝑡𝑢𝑏= 𝟑𝟔𝟎 𝒎𝑳/𝒕𝒓𝒂𝒄𝒕𝒂𝒎𝒆𝒏𝒕
- Pots: 3 pots de 100 mL
Volum de medi MS per a cada concentració de TDZ i per un tipus d’agar
3 𝑝𝑜𝑡𝑠/𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡 ·100 𝑚𝐿
𝑝𝑜𝑡= 𝟑𝟎𝟎 𝒎𝑳/𝒕𝒓𝒂𝒄𝒕𝒂𝒎𝒆𝒏𝒕
Per a una concentració hormonal es van necessitar 660 mL de medi de cultiu, per tant, per a tres dosis
de citoquinina es necessitaren 1980 mL.
c) Selecció del material vegetal
Es va introduir un a un els 144 propàguls, procedents dels microbrots obtinguts a partir del tercer
subcultiu del material vegetal de l’estudi anterior, aleatòriament en els tubs i pots de cultiu
corresponents a cada tractament. Com a l’anterior assaig descrit, no es van utilitzar com a font de
multiplicació aquells microbrots que haguessin iniciat el procés de floració.
Els tubs d’assaig amb els nous propàguls obtinguts es van col·locar a les gradetes corresponents i amb
els pots de cultiu es van traslladar a la cambra d’incubació on van estar 5 setmanes amb les següents
condicions de cultiu (Figura 6):
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 29
- Temperatura: 24 °C ± 1
- Intensitat de llum: 60 a 90 μmol m-2s-1
- Fotoperíode: 16 hores de llum i 8 hores de foscor
- Tipus de llum: Fluorescent Grolux
Aquesta assaig a diferència de l’anterior només es va realitzar un cop.
3.4.3. Paràmetres de control
Per a cada repetició dels assaigs es van analitzar diversos paràmetres per tal de quantificar la influència
de cada tractament en el creixement de les plantes.
Longitud
Es va mesurar l’alçada de cada microbrot obtingut. Per a mesurar la longitud s’ha utilitzat paper
mil·limetrat.
Taxa de multiplicació viable i total
La taxa de multiplicació és la quantitat de microbrots que poden formar un individu nou, com a taxa
viable s’entén els microbrots que es poden utilitzar per a obtenir un nou individu, mentre que per a
taxa total s’inclouen fragments que poden ser utilitzats per a generar nous individus i els que per
certes característiques no s’utilitzen per multiplicar el material.
Figura 6 - Tubs i pots amb material vegetal a la cambra d'incubació
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 30
Pes sec i Pes fresc
Pes del material vegetal després de realitzar una deshidratació d’aquest a una temperatura de 80 °C
durant 24 hores. La biomassa fresca del material vegetal es mesura quan es treuen els propàguls de
la cambra de cultiu. S’utilitza una balança de precisió de la marca Scaltec model SPB32 amb una
resolució de 0,1 mg i una capacitat màxima de 120 g.
Contingut d’aigua
El percentatge d’aigua que té cada propàgul obtingut a partir de la mesura del pes sec i pes fresc.
Degut a que possiblement es va produir una rehidratació del material vegetal un cop tret de l’estufa
pel pas del temps mentre es pesaven els propàguls, s’obtenen valors de contingut d’aigua molt
diversos i amb desviacions molt diferents. Com a conseqüència el programari estadístic emprat no ha
pogut fer les proves estadístiques correctament i s’ha optat per no realitzar per aquest paràmetre les
comparacions dels percentatges de contingut hídric entre tractaments aplicats.
Hiperhidricitat
La hiperhidricitat és una alteració morfològica força comuna quan es multiplica teixit vegetal in vitro.
Aquesta alteració fa que es produeixin certs desordres a nivell fisiològic. Normalment, aquest
paràmetre està vinculat a una acumulació excessiva d’aigua en el teixit.
Es va quantificar la presència d’hiperhidricitat en cada assaig en observar el fenomen durant la
multiplicació del material vegetal i en realitzar els diversos controls dels paràmetres. Aquest
paràmetre s’ha expressat com al percentatge de propàguls que presenten teixit vitrificat respecte el
nombre total de propàguls obtinguts al tractament que s’està estudiant.
Altres paràmetres
Durant el desenvolupament del cultiu s’observa que alguns propàguls han iniciat el procés de floració,
fan olor o han format cal·lus.
3.4.4. Tractament estadístic
Amb les dades obtingudes després de realitzar ambdós assajos, es fa l’anàlisi de variància (ANOVA)
per tal de demostrar si n’hi ha diferències significatives entre els tractaments aplicats per cada
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 31
paràmetre de control. Realitzant el tractament estadístic, es va arribar a la conclusió que per tal
d’obtenir resultats coherents a partir de les proves estadístiques s’havien de tractar per separat les
dades obtingudes segons el tipus de recipient de cultiu emprat.
En dur a terme aquesta separació de dades, ja es pot aplicar l’anàlisi de variància (ANOVA) per poder
determinar si hi ha diferències significatives, amb un nivell de significança del 5 %.
Abans de poder realitzar l’ANOVA, es necessita fer una prova de variància per a comprovar si es pot
assumir igualtat de variàncies o no per a les variables a estudiar amb un nivell de significança del 5 %.
En el cas de poder assumir igualtat de variàncies, es realitzar una ANOVA de dos factors (concentració
de thidiazuron, el tipus de gelificant aplicat i la interacció dels dos factors) i el seu comparador de
mitjanes corresponent. Si almenys una variància no és igual, no es pot assumir igualtat de variàncies i
per tant, es realitza la prova Welch-ANOVA d’un factor (tractament aplicat) i amb el seu separador de
mitjanes Games-Howell.
A l’annex es troben les taules obtingudes en les diverses proves estadístiques realitzades per cada
variable.
El tractament estadístic de les dades s’ha realitzat amb el programa Minitab 18.
En el cas dels paràmetres com la hiperhidricitat, presència de flors, olor i formació de cal·lus es va
considerar que no era necessari realitzar un estudi estadístic de les dades obtingudes. En ser
paràmetres detectats en fer els controls del cultius només s’expressen a partir del percentatge de
propàguls que presenten teixit vitrificat, han florit, fan olor o en els quals se ha format un cal·lus
respecte el material vegetal obtingut a cada tractament. No és un objectiu d’aquest estudi determinar
quina concentració de thidiazuron indueix més l’aparició d’hiperhidricitat, fomenta més la floració del
material o la formació de cal·lus. L’estudi de la influència del tipus d’hormona i dosi emprada en el
cultiu in vitro respecte aquest paràmetres pot ser objecte d’estudi en treballs futurs.
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 32
4. Resultats
4.1. Assaig de multiplicació medi β
A continuació, i per cadascuna de les variables controlades, es comenten els resultats obtinguts en els
dos subcultius successius (A i B) realitzats en medi de multiplicació β.
4.1.1. Longitud
a) Subcultiu A
Per tal d’analitzar les dades obtingudes a partir del material vegetal desenvolupat en tubs d’assaig, es
realitza una prova de variàncies per comprovar si es pot assumir igualtat de variàncies. Per aquest
tipus de recipient de cultiu, es pot assumir que les dades tenen variància igual (valor p ≥ 0,05) (Taula
A.1).
Es dur a terme una anàlisi de la variància o ANOVA amb dos factors amb els resultats obtinguts dels
propàguls cultivats en tub, no es troben diferències significatives per a cap dels factors (concentració
de thidiazuron i tipus d’agar) (valor p ≥ 0,05) (Taula A.2). Com es pot observar a la Taula 6, les longituds
dels microbrots desenvolupats en tub d’assaig s’han estabilitzat.
Al igual que el material vegetal cultivat en tub d’assaig, les dades obtingudes a partir dels propàguls
desenvolupats en pot, presenten variàncies iguals (valor p ≥ 0,05) (Taula A.3). En canvi, en realitzar
l’ANOVA de dos factors corresponent, s’observa que hi ha diferències significatives entre els resultats
obtinguts com a conseqüència de la interacció entre la dosi de citoquinina i tipus de gelificant utilitzat
(valor p ≤ 0,05) (Taula A.4). El respectiu comparador de mitjanes afirma que els microbrots
desenvolupats en medis de cultiu formulats amb agar Difco són més allargats, a excepció del material
vegetal obtingut amb aquest agar i amb una dosi de 0,5 μM de TDZ que en presenten una longitud
inferior al igual que els propàguls obtinguts amb agar Comercial sense citoquinina (Taula 7) (Figura 7).
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 33
Taula 6 - Longitud (Subcultiu A, Tub) Taula 7 - Longitud (Subcultiu A, Pot)
Tractament Tub Longitud (cm) Tractament Pot Longitud (cm)
D+T+0 1,3 ± 0,4 a D+P+0 1,7 ± 0,4 a
D+T+0,25 1,5 ± 0,5 a D+P+0,25 1,6 ± 0,4 a
D+T+0,5 1,5± 0,4 a D+P+0,5 1,0 ± 0,2 b
C+T+0 1,4 ± 0,4 a C+P+0 1,1 ± 0,4 b
C+T+0,25 1,5 ± 0,3 a C+P+0,25 1,2 ± 0,2 ab
C+T+0,5 1,3± 0,5 a C+P+0,5 1,4 ± 0,4 ab
Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la desviació estàndard. Les lletres que acompanyen a les mitjanes fan
referència a els nivells de significació, les mitjanes que comparteixen lletra no són significativament diferents. Utilitzant el
mètode de Tukey amb un nivell de significança del 5 % es comparen les mitjanes obtingudes del material vegetal desenvolupat
en tub d’assaig. En el cas del material cultivat en pot s’utilitza el mateix mètode per a separar les mitjanes.
C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)
Figura 7 - Longitud dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 34
b) Subcultiu B
En relació al subcultiu B i pel material desenvolupat en tub d’assaig, la prova de variància indica que
no es pot assumir igualtat de variàncies (valor p ≤ 0,05) (Taula A.21), la prova Welch-ANOVA demostra
que hi ha diferències significatives entre tractaments (valor p ≤ 0,05) (Taula A.22). Els microbrots
desenvolupats en medi gelificat amb agar Comercial en presència de 0,5 μM de TDZ són més allargats
que els desenvolupats amb el mateix gelificant però amb dosis inferiors de TDZ. A més a més,
s’observa una tendència, encara que no sigui significativa, a obtenir microbrots més allargats emprant
gelificant Difco (Taula 8).
En el cas d’utilitzar pots de cultiu, tampoc es pot assumir variàncies iguals (valor p ≥ 0,05) (Taula A.23),
en realitzar una ANOVA de dos factors (concentració de TDZ i tipus de gelificant aplicat), s’observen
diferències significatives per el tipus de gelificant aplicat (valor p ≤ 0,05) (Taula A.24). Els microbrots
desenvolupats en medi de cultiu formulat amb agar Difco són més allargats en comparació al material
vegetal obtingut amb tractaments on s’ha emprat agar Comercial (Taula 9) (Figura 8).
Taula 8 - Longitud (Subcultiu B, Tub) Taula 9 - Longitud (Subcultiu B, Pot)
Tractament Tub Longitud (cm) Tractament Pot Longitud (cm)
D+T+0 1,3 ± 0,4 ab D+P+0 1,3 ± 0,4 a
D+T+0,25 1,5 ± 0,6 ab D+P+0,25 1,3 ± 0,4 a
D+T+0,5 1,4 ± 0,7 ab D+P+0,5 1,5 ± 0,5 a
C+T+0 1,2 ± 0,3 b C+P+0 1,1 ± 0,2 b
C+T+0,25 1,2 ± 0,4 b C+P+0,25 1,2 ± 0,4 b
C+T+0,5 1,6 ± 0,5 a C+P+0,5 1,3 ± 0,3 b
Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la desviació estàndard. Les lletres que acompanyen a les mitjanes fan
referència a els nivells de significació, les mitjanes que comparteixen lletra no són significativament diferents. Utilitzant el
mètode Games-Howell amb un nivell de significança del 5 % es comparen les mitjanes obtingudes del material vegetal
desenvolupat en tub d’assaig. En el cas del material cultivat en pot s’utilitza el mètode Tukey amb un nivell de significança del
5 % per a separar les mitjanes.
C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 35
4.1.2. Taxa total
La taxa de multiplicació total indica la quantitat de individus nous que es poden desenvolupar a partir
del propàguls obtingut en realitzar el cultiu in vitro incloent aquells microbrots que per certes
característiques no es poden emprar com a material vegetal de multiplicació.
Aquest paràmetre s’expressa com a possibles nous individus per propàgul obtingut en el cultiu in vitro
realitzat.
a) Subcultiu A
En el cas del material vegetal crescut en tub d’assaig, no es pot assumir que totes les variàncies són
iguals segons la prova de variància realitzada (valor p ≤ 0,05) (Taula A.5), la prova Welch-ANOVA indica
que no s’observen diferències significatives entre els tractaments aplicats (valor p ≥ 0,05) (Taula A.6).
No obstant, les dosis més elevades de TDZ presenten una tendència a formar un major nombre de
nous rebrots (Taula 10).
Les dades obtingudes a partir del material vegetal obtingut en pot, no presenten variància igual (valor
p ≤ 0,05) (Taula A.7), segons la prova Welch-ANOVA es poden observar diferències significatives entre
els tractaments (valor p ≤ 0,05) (Taula A.8), el material vegetal tractat amb agar Difco i amb una dosi
hormonal de TDZ de 0,5 μM presenta una capacitat de formar nous individus més reduïda que els
Figura 8 - Longitud dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 36
propàguls desenvolupats amb el mateix tipus d’agar però amb una concentració hormonal de 0,25
μM (Taula 11).
També per aquesta variable i tipus de recipient, s’observa en general, que els tractaments amb Difco
sense presència hormonal o a dosis baixes indueixen més formació de nous individus enfront de l’agar
Comercial (Figura 9).
Taula 10 - Taxa total (Subcultiu A, Tub) Taula 11 - Taxa total (Subcultiu A, Pot)
Tractament Tub Taxa total Tractament Pot Taxa total
D+T+0 2,5 ± 0,8 a D+P+0 4,3 ± 2,8 ab
D+T+0,25 3,0 ± 0,9 a D+P+0,25 4,8 ± 1,2 a
D+T+0,5 3,5 ± 1,4 a D+P+0,5 2,0 ± 0,8 b
C+T+0 2,8 ± 0,4 a C+P+0 2,3 ± 2,3 ab
C+T+0,25 2,2 ± 1,2 a C+P+0,25 3,6 ± 1,0 ab
C+T+0,5 4,2 ± 2,5 a C+P+0,5 3,5 ± 0,5 ab
Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la desviació estàndard. Les lletres que acompanyen a les mitjanes fan
referència a els nivells de significació, les mitjanes que comparteixen lletra no són significativament diferents. Utilitzant el mètode
Games-Howell amb un nivell de significança del 5 % es comparen les mitjanes obtingudes del material vegetal desenvolupat en
tub d’assaig. En el cas del material cultivat en pot s’utilitza el mateix mètode per a separar les mitjanes.
C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)
Figura 9 - Taxa total dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 37
b) Subcultiu B
En el cas de cultivar en tubs d’assaig, no es pot assumir que les variàncies de les dades obtingudes
siguin totes iguals segons la prova de variància realitzada (valor p ≤ 0,05) (Taula A.25), per tant, es
realitza la prova Welch-ANOVA on s’observen diferències significatives entre els tractaments aplicats
(valor p ≤ 0,05) (Taula A.26). El material vegetal obtingut emprant gelificant Difco presenta una taxa
total superior a la obtinguda amb agar Comercial, a excepció feta del material obtingut amb aquest
tipus de gelificant a elevada concentració (0,5 μM de TDZ) (Taula 12).
Les dades recollides a partir del material vegetal cultivat en pot, presenten variància diferent segons
la prova de variància realitzada (valor p ≤ 0,05) (Taula A.27), s’observen diferències significatives entre
tractaments (valor p ≤ 0,05) indicades per la prova Welch-ANOVA (Taula A.28). El comportament quan
es cultiva en pots es diferent al observat quan es cultiva en tub d’assaig. La taxa total de multiplicació
resulta superior en el material obtingut en agar Comercial a 0,25 i 0,5 μM de TDZ enfront d’una menor
taxa obtinguda en medis sense TDZ per a qualsevol tipus de gelificant (Taula 13) (Figura 10).
Taula 12 - Taxa total (Subcultiu B, Tub) Taula 13 - Taxa total (Subcultiu B, Pot)
Tractament Tub Taxa total Tractament Pot Taxa total
D+T+0 1,7 ± 0,7 b D+P+0 2,0 ± 1,2 c
D+T+0,25 4,4 ± 3,2 a D+P+0,25 4,7 ± 2,8 ab
D+T+0,5 4,5 ± 3,3 a D+P+0,5 5,5 ± 3,6 ab
C+T+0 1,8 ± 1,1 b C+P+0 3,2 ± 2,1 bc
C+T+0,25 2,5 ± 1,7 ab C+P+0,25 6,1 ± 3,3 a
C+T+0,5 3,6 ± 2,1 a C+P+0,5 6,5 ± 3,0 a
Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la desviació estàndard. Les lletres que acompanyen a les mitjanes fan
referència a els nivells de significació, les mitjanes que comparteixen lletra no són significativament diferents. Utilitzant el
mètode Games-Howell amb un nivell de significança del 5 % es comparen les mitjanes obtingudes del material vegetal
desenvolupat en tub d’assaig. En el cas del material cultivat en pot s’utilitza el mateix mètode per a separar les mitjanes.
C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 38
4.1.3. Taxa viable
a) Subcultiu A
Segons la prova de variància realitzada per aquesta variable, es pot assumir que les dades obtingudes
tenen totes una variància igual (valor p ≥ 0,05) (Taula A.9), per tant, es realitza una anàlisi de la
variància (ANOVA) amb dos factors (concentració de TDZ, el tipus d’agar emprat i la interacció dels
dos factors).
L’ANOVA indica que pel material vegetal cultivat en tub d’assaig, només es troben diferències
significatives (valor p ≤ 0,05) per la concentració de citoquinina aplicada (Taula A.10), s’observa que
la concentració hormonal de 0,5 μM de TDZ afavoreix la formació de nous microbrots viables (Taula
14) (Figura 11).
En el cas d’utilitzar pots com a recipient de cultiu (Taula 15), també es pot assumir que les variàncies
de les dades són iguals segons la prova de variància realitzada (valor p ≥ 0,05) (Taula A.11), l’ANOVA
no indica diferències significatives per a cap dels dos factors ni la seva interacció (valor p ≥ 0,05) (Taula
A.12).
Figura 10 - Taxa total dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 39
Taula 14 - Taxa viable (Subcultiu A, Tub) Taula 15 - Taxa viable (Subcultiu A, Pot)
Tractament Tub Taxa viable Tractament Pot Taxa viable
D+T+0 1,8± 0,7 b D+P+0 3,2 ± 2,5 a
D+T+0,25 2,7 ± 1,0 b D+P+0,25 4,0 ± 1,8 a
D+T+0,5 3,2 ± 1,2 a D+P+0,5 2,0 ± 0,8 a
C+T+0 2,5 ± 0,5 b C+P+0 1,2 ± 2,8 a
C+T+0,25 1,3 ± 1,2 b C+P+0,25 3,2 ± 1,8 a
C+T+0,5 3,0 ± 1,5 a C+P+0,5 2,7 ± 0,8 a
Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la desviació estàndard. Les lletres que acompanyen a les mitjanes fan
referència a els nivells de significació, les mitjanes que comparteixen lletra no són significativament diferents. Utilitzant el
mètode de Tukey amb un nivell de significança del 5 % es comparen les mitjanes obtingudes del material vegetal desenvolupat
en tub d’assaig. En el cas del material cultivat en pot s’utilitza el mateix mètode per a separar les mitjanes.
C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)
b) Subcultiu B
La prova de variància realitzada tant per el material vegetal cultivat en tub d’assaig com en pot, indica
que no es pot assumir igualtat de variàncies (valor p ≤ 0,05) (Taula A.29 i A.31). La prova Welch-
ANOVA d’aquesta variable, i per aquest subcultiu (Taula A.30), ens indica que hi ha diferències
significatives entre tractaments (valor p ≤ 0,05). En concret, s’observa que la taxa viable dels
Figura 11 - Taxa viable dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 40
microbrots desenvolupats en tubs d’assaig amb agar Difco a una concentració 0,5 μM de TDZ és
superior a l’obtinguda pels microbrots generats en medis de cultiu sense regulador de creixement per
a qualsevol gelificant (Taula 16).
En el cas de cultivar en pots de cultiu, també s’observen diferències significatives (valor p ≤ 0,05)entre
tractaments en fer la prova Welch-ANOVA corresponent (Taula A.32). En general, s’observen que les
majors taxes viables es donen en presència de regulador de creixement i per qualsevol dels gelificants
utilitzats. En general, a major concentració citoquinínica major taxa de multiplicació (Taula 17) (Figura
12).
Taula 16 - Taxa viable (Subcultiu B, Tub) Taula 17 - Taxa viable (Subcultiu B, Pot)
Tractament Tub Taxa viable Tractament Pot Taxa viable
D+T+0 0,4 ± 0,7 c D+P+0 0,6 ± 0,9 c
D+T+0,25 2,7 ± 2,9 ab D+P+0,25 2,9 ± 3,0 ab
D+T+0,5 2,9 ± 2,6 a D+P+0,5 4,5 ± 3,8 a
C+T+0 0,5 ± 0,9 bc C+P+0 2,0 ± 1,6 bc
C+T+0,25 1,3 ± 1,4 abc C+P+0,25 3,8 ± 1,9 a
C+T+0,5 2,4 ± 1,9 ab C+P+0,5 4,5 ± 2,8 a
Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la desviació estàndard. Les lletres que acompanyen a les mitjanes fan
referència a els nivells de significació, les mitjanes que comparteixen lletra no són significativament diferents. Utilitzant el
mètode Games-Howell amb un nivell de significança del 5 % es comparen les mitjanes obtingudes del material vegetal
desenvolupat en tub d’assaig. En el cas del material cultivat en pot s’utilitza el mateix mètode per a separar les mitjanes.
C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)
Figura 12 - Taxa viable dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 41
4.1.4. Pes fresc
a) Subcultiu A
La prova de variància realitzada tant per el material vegetal cultivat en tub d’assaig com en pot, indica
que no es pot assumir igualtat de variàncies (valor p ≤ 0,05) (Taula A.13 i A.15).
Tot i que la prova Welch-ANOVA demostra que no hi ha diferències significatives en la biomassa fresca
obtinguda en els diferents tractaments realitzats en tub d’assaig (valor p ≥ 0,05) (Taula A.14), si
s’observa una tendència a presentar un major pes fresc el material vegetal desenvolupat en medi de
cultiu amb solidificat Difco (Taula 18).
En el cas dels microbrots desenvolupats en pots de cultiu, la prova Welch-ANOVA corresponent indica
que hi ha diferències significatives (valor p ≤ 0,05) segons el tractament aplicat (Taula A.16), s’observa
la mateixa tendència que l’obtinguda en tubs d’assaig. A més a més, en aquest tipus de recipient, el
material desenvolupat en medis de multiplicació formulats amb agar Difco i en presència d’hormona
són diferents a la resta de tractaments, llevat del tractament formulat amb Difco sense hormona
(Taula 19) (Figura 13).
Taula 18 - Pes fresc (Subcultiu A, Tub) Taula 19 - Pes fresc (Subcultiu A, Pot)
Tractament Tub Pes fresc (g) Tractament Pot Pes fresc (g)
D+T+0 0,4297 ± 0,2213 a D+P+0 0,6070 ± 0,2510 ab
D+T+0,25 0,4054 ± 0,1181 a D+P+0,25 1,0070 ± 0,4770 a
D+T+0,5 0,5990 ± 0,3310 a D+P+0,5 0,8972 ± 0,0876 a
C+T+0 0,3740 ± 0,2870 a C+P+0 0,5055 ± 0,1091 c
C+T+0,25 0,2545 ± 0,0713 a C+P+0,25 0,5320 ± 0,2550 bc
C+T+0,5 0,2717 ± 0,1449 a C+P+0,5 0,5165 ± 0,1603 c
Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la desviació estàndard. Les lletres que acompanyen a les mitjanes fan
referència a els nivells de significació, les mitjanes que comparteixen lletra no són significativament diferents. Utilitzant el
mètode Games-Howell amb un nivell de significança del 5 % es comparen les mitjanes obtingudes del material vegetal
desenvolupat en tub d’assaig. En el cas del material cultivat en pot s’utilitza el mateix mètode per a separar les mitjanes.
C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 42
b) Subcultiu B
La prova de variància realitzada tant per els propàguls cultivats en tub d’assaig com en pot, indica que
no es pot assumir igualtat de variàncies (valor p ≤ 0,05) (Taula A.33 i A.35).
La prova Welch-ANOVA indica que hi ha diferències significatives (valor p ≤ 0,05) en la biomassa fresca
obtinguda en els diferents tractaments realitzats en tub d’assaig (Taula A.34). El material vegetal
obtingut a partir d’aplicar la concentració de 0,5 μM de TDZ amb agar Difco presenta un major pes
fresc (0,8950 g) que la resta de tractaments, a excepció feta, del tractament formulat amb 0,25 μM de
TDZ amb el mateix tipus d’agar (Taula 20).
Emprant pots de cultiu, s’observen diferències significatives entre tractaments segons la prova Welch-
ANOVA (valor p ≤ 0,05) (Taula A.36), el material desenvolupat en medis de multiplicació formulats
amb solidificant Difco són diferents a la resta de tractaments en contenir una major biomassa fresca,
a excepció feta, del material obtingut amb agar Comercial a dosi alta de TDZ (0,5 μM) (Taula 21) (Figura
14).
Figura 13 - Pes fresc dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 43
Taula 20 - Pes fresc (Subcultiu B, Tub) Taula 21 - Pes fresc (Subcultiu B, Pot)
Tractament Tub Pes fresc (g) Tractament Pot Pes fresc (g)
D+T+0 0,4535 ± 0,2255 b D+P+0 0,9032 ± 0,2314 a
D+T+0,25 0,7930 ± 0,5350 ab D+P+0,25 1,0504 ± 0,3908 a
D+T+0,5 0,8950 ± 0,5100 a D+P+0,5 0,9541 ± 0,3808 a
C+T+0 0,4880 ± 0,2198 b C+P+0 0,4329 ± 0,1949 c
C+T+0,25 0,4541 ± 0,2499 b C+P+0,25 0,5101 ± 0,2495 bc
C+T+0,5 0,5198 ± 0,3362 b C+P+0,5 0,7630 ± 0,3321 ab
Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la desviació estàndard. Les lletres que acompanyen a les mitjanes fan
referència a els nivells de significació, les mitjanes que comparteixen lletra no són significativament diferents. Utilitzant el
mètode Games-Howell amb un nivell de significança del 5 % es comparen les mitjanes obtingudes del material vegetal
desenvolupat en tub d’assaig. En el cas del material cultivat en pot s’utilitza el mateix mètode per a separar les mitjanes.
C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)
Figura 14 - Pes fresc dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 44
4.1.5. Pes sec
a) Subcultiu A
La prova de variància realitzada pel material vegetal cultivat en tub d’assaig especifica que es pot
assumir que les dades presenten variàncies iguals (valor p ≥ 0,05) (Taula A.17), en canvi, per els
microbrots desenvolupats en pots de cultiu, les dades presenten variàncies diferents (valor p ≤ 0,05)
(Taula A.19).
En el cas dels tubs d’assaig no s’observen diferències significatives per a cap dels dos factors
(concentració de TDZ i tipus d’agar emprat) segons l’ANOVA realitzada (valor p ≥ 0,05) (Taula A.18).
No obstant, es pot observar una certa tendència a obtenir més biomassa seca quan el gelificant és
agar Difco. Tot i que el programari estadístic ha determinat que els tractaments no són prou diferents,
a la Taula 22 es pot observar que els microbrots obtinguts amb una dosi de citoquinina de 0,5 μM amb
agar Difco presenta un pes sec major en comparació amb el tractament amb la mateixa dosi hormonal
però amb gelificant Comercial (Figura 15).
Quan el recipient són pots de cultiu, l’anàlisi estadística Welch-ANOVA realitzat indica que no hi ha
diferències significatives entre tractaments (valor p ≥ 0,05) (Taula A.20). No obstant, al igual que el
material vegetal desenvolupat en tub d’assaig, es pot apreciar que els tractaments amb gelificant Difco
presenten una biomassa seca una mica més elevada que els tractaments on s’ha emprat agar
Comercial (Taula 23).
Taula 22 - Pes sec (Subcultiu A, Tub) Taula 23 - Pes sec (Subcultiu A, Pot)
Tractament Tub Pes sec (g) Tractament Pot Pes sec (g)
D+T+0 0,0393 ± 0,0166 a D+P+0 0,0520 ± 0,0166 a
D+T+0,25 0,0373 ± 0,0143 a D+P+0,25 0,0803 ± 0,0320 a
D+T+0,5 0,0503 ± 0,0252 a D+P+0,5 0,0665 ± 0,0093 a
C+T+0 0,0425 ± 0,0342 a C+P+0 0,0453 ± 0,0056 a
C+T+0,25 0,0275 ± 0,0146 a C+P+0,25 0,0610 ± 0,0297 a
C+T+0,5 0,0283 ± 0,0143 a C+P+0,5 0,0441 ± 0,0169 a
Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la desviació estàndard. Les lletres que acompanyen a les mitjanes fan
referència a els nivells de significació, les mitjanes que comparteixen lletra no són significativament diferents. Utilitzant el
mètode de Tukey amb un nivell de significança del 5 % es comparen les mitjanes obtingudes del material vegetal desenvolupat
en tub d’assaig. En el cas del material cultivat en pot s’utilitza el mètode Games-Howell per a separar les mitjanes, amb un
nivell de significança del 5 %.
C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 45
b) Subcultiu B
Les dues proves de variància realitzades per a cada tipus de recipient de cultiu emprat, indiquen que
no es pot assumir igualtat de variàncies (valor p ≤ 0,05) (Taula A.37 i A.39).
L’anàlisi Welch-ANOVA determina que no hi ha diferències significatives (valor p ≥ 0,05) en la
biomassa seca obtinguda en els diferents tractaments realitzats en tub d’assaig (Taula A.38). No
obstant, s’observa que els tractaments que contenen Difco en presència de TDZ tendeixen a
desenvolupar una major biomassa seca que la resta de tractaments (Taula 24) (Figura 16).
En canvi, segons l’anàlisi Welch-ANOVA de les dades obtingudes a partir del material desenvolupat en
pots de cultiu, hi ha diferències significatives entre tractaments (valor p ≤ 0,05) (Taula A.40). S’obté
major biomassa seca en els tractaments que contenen agar Difco. No obstant, aquests tractaments
no es poden diferenciar amb els tractaments formulats amb agar Comercial en presència d’hormona
(Taula 25).
Figura 15 - Pes sec dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 46
Taula 24 - Pes sec (Subcultiu B, Tub) Taula 25 - Pes sec (Subcultiu B, Pot)
Tractament Tub Pes sec (g) Tractament Pot Pes sec (g)
D+T+0 0,0522 ± 0,0301 a D+P+0 0,0889 ± 0,0236 a
D+T+0,25 0,0683 ± 0,0348 a D+P+0,25 0,0876 ± 0,0293 a
D+T+0,5 0,0732 ± 0,0363 a D+P+0,5 0,0845± 0,0319 a
C+T+0 0,0488 ± 0,0187 a C+P+0 0,0499± 0,0191 b
C+T+0,25 0,0496 ± 0,0204 a C+P+0,25 0,0801 ± 0,0453 ab
C+T+0,5 0,0526 ± 0,0252 a C+P+0,5 0,0726 ± 0,0341 ab
Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la desviació estàndard. Les lletres que acompanyen a les mitjanes fan
referència a els nivells de significació, les mitjanes que comparteixen lletra no són significativament diferents. Utilitzant el
mètode Games-Howell amb un nivell de significança del 5 % es comparen les mitjanes obtingudes del material vegetal
desenvolupat en tub d’assaig. En el cas del material cultivat en pot s’utilitza el mateix mètode per a separar les mitjanes.
C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)
Figura 16 - Pes sec dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 47
4.1.6. Contingut hídric
a) Subcultiu A
El percentatge d’aigua és aparentment més elevat en els microbrots obtinguts en pots de cultiu que
en tub d’assaig. En el cas de cultivar en tubs d’assaig, els percentatges d’aigua han oscil·lat entre 88,6
% i 91,5 % (Taula 26). En el cas d’utilitzar pots com a recipient de cultiu en aquestes condicions de
cultiu, el contingut hídric oscil·la entre 90,7 % i 95,1 % (Taula 27) (Figura 17).
Taula 26 - Contingut hídric (Subcultiu A, Tub) Taula 27 - Contingut hídric (Subcultiu A, Pot)
Tractament Tub Contingut aigua (%) Tractament Pot Contingut aigua (%)
D+T+0 89,7 ± 3,3 D+P+0 91,1 ± 1,1
D+T+0,25 89,5 ± 2,6 D+P+0,25 91,7 ± 1,2
D+T+0,5 91,4 ± 0,9 D+P+0,5 92,6 ± 0,6
C+T+0 88,6 ± 2,2 C+P+0 90,7 ± 1,6
C+T+0,25 89,8 ± 3,1 C+P+0,25 95,1 ± 4,7
C+T+0,5 89,4 ± 0,8 C+P+0,5 91,6 ± 2,1
Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la desviació estàndard. Per aquesta variable s’ha considerat que no era
necessari comparar les mitjanes. C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron
(μM)
Figura 17 - Contingut hídric dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 48
b) Subcultiu B
En aquest subcultiu els percentatges d’aigua calculats en els microbrots desenvolupats en tub
d’assaig són molt similars entre tractaments i oscil·len entre el 88 % i el 91,6 % (Taula 28). En el
cas de cultivar en pot el rang és lleugerament més ample ja que el contingut hídric es situa entre
82,4 % i el 92,5 % (Taula 29).
En general, els percentatges més elevats s’han obtingut en tractaments formulats amb agar Difco
(Figura 18).
Taula 28 - Contingut hídric (Subcultiu B, Tub)
Taula 29 - Contingut hídric (Subcultiu B, Pot)
Tractament Tub Contingut aigua (%) Tractament Pot Contingut aigua (%)
D+T+0 89,2 ± 3,8 D+P+0 90,0 ± 1,0
D+T+0,25 90,7 ± 1,6 D+P+0,25 91,5 ± 0,7
D+T+0,5 91,6 ± 2,5 D+P+0,5 90,9 ± 1,4
C+T+0 89,5 ± 1,4 C+P+0 88,02 ± 1,4
C+T+0,25 88,0 ± 2,4 C+P+0,25 82,4 ± 9,2
C+T+0,5 88,4 ± 3,5 C+P+0,5 92,5 ± 6,2
Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la desviació estàndard. Per aquesta variable s’ha considerat que no era
necessari comparar les mitjanes. C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de
thidiazuron (μM)
Figura 18 - Contingut hídric dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 49
4.1.7. Presència de flors
a) Subcultiu A
En general, no és freqüent observar formació de flors durant la fase de multiplicació. No obstant en
aquest primer assaig, on el material ja portava quatre subcultius en condicions in vitro s’ha pogut
quantificar l’aparició de flors en tots els tractaments que no contenien citoquinina i també en els
microbrots desenvolupats en pot de cultiu i amb agar Difco (Taula 30).
Taula 30 - Percentatge de floració dels propàguls (A)
Subcultiu A
C+T+0 38,9 D+T+0 23,5
C+T+0,25 0,0 D+T+0,25 0,0
C+T+0,5 0,0 D+T+0,5 0,0
C+P+0 18,8 D+P+0 4,2
C+P+0,25 0,0 D+P+0,25 18,2
C+P+0,5 0,0 D+P+0,5 7,1
Els valors obtinguts representen el percentatge de presència de
propàguls florits contra l’absència d’aquests respecte el nombre
total de propàguls obtinguts a cada tractament. C: Agar Comercial
D: Agar Difco T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de
thidiazuron (μM)
b) Subcultiu B
Degut a la presència de flors en alguns microbrots obtinguts en el subcultiu A, es va procurar no
utilitzar-los com a propàguls per iniciar el subcultiu B. No obstant en aquest subcultiu s’ha
incrementat, respecte el subcultiu A, el percentatge de material florit en els tractaments realitzats
en tub d’assaig. En canvi, s’ha aconseguit reduir fins a no obtenir cap microbrot florit en els
tractaments formulats amb agar Difco i cultivats en pot (Taula 31).
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 50
Taula 31 - Percentatge de floració dels propàguls (B)
Subcultiu B
C+T+0 47,6 D+T+0 53,8
C+T+0,25 21,2 D+T+0,25 11,1
C+T+0,5 27,6 D+T+0,5 4,3
C+P+0 25,0 D+P+0 0,0
C+P+0,25 8,3 D+P+0,25 0,0
C+P+0,5 0,0 D+P+0,5 0,0
Els valors obtinguts representen el percentatge de presència de
propàguls florits contra l’absència d’aquests respecte el nombre
total de propàguls obtinguts a cada tractament. C: Agar Comercial
D: Agar Difco T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de
thidiazuron (μM)
4.1.8. Presència d’olor
a) Subcultiu A
En aquest primer assaig, en realitzar els controls dels paràmetres definits pel material vegetal obtingut
en el cultiu in vitro, quan s’obrien els tubs d’assaig i pots de cultiu es va olorar l’olor característic del
Cannabis sativa. Per tal de quantificar aquest paràmetre, es va realitzar un recompte dels propàguls
cultivats en tubs d’assaig i pot que feien olor. Es va obtenir el percentatge de propàguls que feien olor
respecte el total de propàguls obtinguts en el cultiu in vitro per a cada tractament aplicat. En general,
per aquest subcultiu i pels recipients vinculats amb agar Difco es quantifiquen més propàguls que fan
olor (Taula 32).
Per aquest paràmetre no es realitza una anàlisis estadística degut a que es quantifiquen el propàguls
que fan olor respecte el total de propàguls obtinguts, no es busca estudiar quin tractament fomenta
l’olor dels propàguls o quin grau de potencialitat té aquesta olor.
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 51
Taula 32 - Percentatge de presència d’olor (A)
Subcultiu A
C+T+0 11,1 D+T+0 29,4
C+T+0,25 0,0 D+T+0,25 5,0
C+T+0,5 5,3 D+T+0,5 12,5
C+P+0 31,3 D+P+0 29,2
C+P+0,25 10,0 D+P+0,25 27,3
C+P+0,5 8,3 D+P+0,5 85,7
Els valors obtinguts representen el percentatge de propàguls que
fan olor respecte el nombre total de propàguls obtinguts a cada
tractament. C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig P:
Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)
b) Subcultiu B
En aquest subcultiu, ha incrementat el nombre de propàguls que feien olor desenvolupats en tubs
d’assaig, mentre que per els pots de cultiu, el nombre de propàguls que feien olor s’ha reduït.
En el cultiu anterior, el tractament en pot amb agar Difco i 0,5 μM de TDZ presentava un 85,7 % de
propàguls que feien olor respecte el nombre total de propàguls obtinguts en el cultiu, a diferència
d’aquest subcultiu, pel mateix tractament el percentatge de nombre de propàguls que fan olor es del
16,7 % (Taula 33).
Taula 33 - Percentatge de presència d’olor (B)
Subcultiu B
C+T+0 61,9 D+T+0 76,9
C+T+0,25 45,5 D+T+0,25 72,2
C+T+0,5 44,8 D+T+0,5 73,9
C+P+0 12,5 D+P+0 23,8
C+P+0,25 4,2 D+P+0,25 43,8
C+P+0,5 0,0 D+P+0,5 16,7
Els valors obtinguts representen el percentatge de propàguls que
fan olor respecte el nombre total de propàguls obtinguts a cada
tractament. C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig P:
Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 52
4.1.9. Hiperhidricitat
a) Subcultiu A
La hiperhidricitat és una alteració morfològica força comuna quan es multiplica teixit vegetal in vitro.
Aquesta alteració fa que es produeixin certs desordres a nivell fisiològic. Normalment, està vinculada
a una acumulació excessiva d’aigua en el teixit (Gao et al., 2018; Liu et al., 2017; Van den Dries et al.,
2013).
En aquest primer assaig es va detectar presència de teixit vitrificat, és a dir, hiperhidratat, en tots els
tractaments. En general, s’observa un major percentatge de material vitrificat quan el recipient de
cultiu han estat pots (> 16 %), enfront del cultivat en tub d’assaig (>5,3 %) (Taula34).
Taula 34 - Percentatge d'hiperhidricitat (A)
Subcultiu A
C+T+0 16,7 D+T+0 58,8
C+T+0,25 5,3 D+T+0,25 20,0
C+T+0,5 10,5 D+T+0,5 8,3
C+P+0 68,8 D+P+0 25,0
C+P+0,25 35,0 D+P+0,25 54,5
C+P+0,5 16,7 D+P+0,5 85,7
Els valors obtinguts representen el percentatge de propàguls amb
teixit vitrificat respecte el nombre total de propàguls obtinguts a
cada tractament. C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig
P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)
b) Subcultiu B
En realitzar la repetició de l’assaig, es continua detectant presencia de teixit vitrificat en la majoria
dels tractaments.
Com s’ha observat per la variable d’aroma, el percentatge de material vegetal vitrificat augmenta quan
s’ha desenvolupat en tub d’assaig. En el cas dels microbrots desenvolupats en medis formulats sense
hormona, en el subcultiu A, presentaven uns percentatge de hiperhidricitat de 16,7 % per agar
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 53
Comercial i 58,8 % per agar Difco, en aquest subcultiu han incrementat fins 76,2 % per el gelificant
Comercial i 92,3 % per en Difco (Taula 35).
En general, pel material vegetal multiplicat en pots de cultiu s’ha reduït el percentatge de teixit
vitrificat.
Taula 35 - Percentatge d'hiperhidricitat (B)
Subcultiu B
C+T+0 76,2 D+T+0 92,3
C+T+0,25 48,5 D+T+0,25 50,0
C+T+0,5 27,6 D+T+0,5 52,2
C+P+0 0,0 D+P+0 71,4
C+P+0,25 0,0 D+P+0,25 50,0
C+P+0,5 4,2 D+P+0,5 27,8
Els valors obtinguts representen el percentatge de propàguls amb
teixit vitrificat respecte el nombre total de propàguls obtinguts a
cada tractament. C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig
P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)
4.1.10. Formació de cal·lus
a) Subcultiu A
La formació de cal·lus a la base del microbrot durant la fase de multiplicació depèn, principalment , de
l’espècie vegetal i de la relació fitohormonal. El tipus de cal·lus format en el nostre assaig corresponia
a un cal·lus molt poc aparent i que en cap cas va generar-se a partir d’ell microbrots adventicis ja que
tots els microbrots obtinguts en aquest assaig han estat axil·lars. La formació de cal·lus s’ha quantificat
a partir del recompte del nombre de propàguls amb cal·lus respecte el nombre total de propàguls
obtinguts en el cultiu in vitro per cada tractament emprat.
En general, quan els medis de cultiu han estat formulats sense presència de citoquinina, la formació
de cal·lus ha estat nul·la o reduïda (Taula 36).
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 54
Taula 36 - Percentatge de formació de cal·lus (A)
Subcultiu A
C+T+0 0,0 D+T+0 0,0
C+T+0,25 26,3 D+T+0,25 0,0
C+T+0,5 15,8 D+T+0,5 33,3
C+P+0 12,5 D+P+0 8,3
C+P+0,25 55,0 D+P+0,25 72,7
C+P+0,5 75,0 D+P+0,5 78,6
Els valors obtinguts representen el percentatge de propàguls amb
cal·lus respecte el nombre total de propàguls obtinguts en el cultiu
in vitro per cada tractament. C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub
d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)
b) Subcultiu B
Respecte a la formació de cal·lus, s’observa un augment en tots els tractaments, especialment en els
medis sense regulador de creixement on anteriorment la formació de cal·lus era pràcticament nul·la.
En canvi, en aquest subcultiu els percentatges determinats han superat el 17 % (Taula 37).
Taula 37 - Percentatge de formació de cal·lus (B)
Subcultiu B
C+T+0 19,0 D+T+0 38,5
C+T+0,25 45,5 D+T+0,25 38,9
C+T+0,5 17,2 D+T+0,5 26,1
C+P+0 43,8 D+P+0 100,0
C+P+0,25 87,5 D+P+0,25 100,0
C+P+0,5 100,0 D+P+0,5 100,0
Els valors obtinguts representen el percentatge de propàguls amb
cal·lus respecte el nombre total de propàguls obtinguts en el cultiu
in vitro per cada tractament. C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub
d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 55
A la Figura 19 es mostra el cultiu in vitro del material vegetal en els diferents tipus de recipients
emprats i a la cambra de incubació.
4.2. Assaig de multiplicació medi MS
El segon assaig realitzat consta de 6 tractaments que es caracteritzen per utilitzar només agar
comercial i medi MS. Únicament s’utilitza agar comercial en aquest segon assaig perquè es va
contaminar més de la meitat del material vegetal en realitzar el cultiu in vitro per a obtenir material
vegetal uniforme per a fer aquest segon assaig. En reduir-se el material vegetal disponible es va optar
per només emprar agar Comercial en la formulació del medi de cultiu.
El tractament estadístic de les dades d’aquest assaig s’ha realitzat de la mateixa manera que per
l’assaig de multiplicació de medi β, primer es dur a terme una prova de variància de les dades i segons
si es pot assumir o no igualtat de variància es passa a realitzar una anàlisi de la variància (ANOVA) o
una prova Welch-ANOVA per tal de identificar si hi ha diferències significatives (valor p ≤ 0,05) entre
els tractaments aplicats.
A diferència de l’assaig amb medi β, els cultius realitzats en medi MS només s’ha emprat el gelificant
Comercial, per tant, en el tractament estadístic s’ha substituït el factor del tipus d’agar utilitzat pel
tipus de recipient de cultiu emprat.
Figura 19 - Material vegetal cultivat en pot i en tub d'assaig
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 56
4.2.1. Longitud
La prova de variància corresponent a la variable longitud dels microbrots obtinguts en medi de cultiu
MS, permet assumir igualtat de variància per a les dades obtingudes durant l’assaig (valor p ≥ 0,05)
(Taula A.41).
Degut a que la prova de variància permet assumir igualtat de variàncies, es realitza una ANOVA de 2
factors (concentració de TDZ i tipus de recipient) obtenint diferències significatives entre els
microbrots desenvolupats en tub d’assaig i pot de cultiu (valor p ≤ 0,05) (Taula A.42).
Com es pot observar a la Taula 38, el material vegetal multiplicat en pot de cultiu, presenta propàguls
més allargats en comparació dels desenvolupats en tub d’assaig (Figura 20).
Taula 38 - Longitud (MS)
Tractament Longitud (cm)
C+T+0 1,2 ± 0,3 b
C+T+0,25 1,3 ± 0,5 b
C+T+0,5 1,5 ± 0,4 b
C+P+0 1,6 ± 0,4 a
C+P+0,25 1,4 ± 0,2 a
C+P+0,5 1,6 ± 0,3 a
Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la
desviació estàndard. Les lletres que acompanyen a les
mitjanes fan referència a els nivells de significació, que
comparteixen lletra no són significativament diferents.
S’ha utilitzat el mètode Tukey per a comparar les mitjanes,
amb un nivell de significança del 5 %. C: Agar Comercial T:
Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de
thidiazuron (μM)
Figura 20 - Longitud dels microbrots per a cada tractament (MS)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 57
4.2.2. Taxa total
En el cas de la variable taxa total dels microbrots, la seva corresponent prova de variància demostra
que les dades obtingudes presenten igualtat de variància (valor p ≥ 0,05) (Taula A.43). Es realitza una
ANOVA de dos factors (concentració de thidiazuron i tipus de recipient de cultiu) per tal d’observar si
cap dels dos factors influeix en la capacitat de generació de nous individus a partir del material vegetal
cultivat.
Com a resultat de l’ANOVA, es demostra que tan sòls hi ha diferències significatives relacionades amb
la concentració de citoquinina aplicada al medi de multiplicació (valor p ≤ 0,05) (Taula A.44).
S’observa que el material vegetal multiplicat en medis amb concentracions 0,25 μM i 0,5 μM de TDZ
conté una major capacitat de formació de nous individus (Taula 39).
Tot i que no hi presenten diferències significatives pel tipus de recipient de cultiu emprat(valor p ≥
0,05) (Taula A.44), en general, el material vegetal crescut en pot de cultiu en presencia de concentració
hormonal tendeix a formar més microbrots nous (Figura 21).
Taula 39 - Taxa total (MS)
Tractament Taxa total
C+T+0 2,2 ± 0,9 b
C+T+0,25 2,8 ± 1,4 a
C+T+0,5 2,7 ± 1,1 a
C+P+0 2,3 ± 0,8 b
C+P+0,25 3,1 ± 1,5 a
C+P+0,5 3,4 ± 1,6 a
Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la
desviació estàndard. Les lletres que acompanyen a les
mitjanes fan referència a els nivells de significació, que
comparteixen lletra no són significativament diferents.
S’ha utilitzat el mètode Tukey per a comparar les mitjanes,
amb un nivell de significança del 5 %. C: Agar Comercial T:
Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de
thidiazuron (μM)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 58
4.2.3. Taxa viable
En relació a la taxa viable, la prova de variància indica que es pot assumir igualtat de variància, (valor
p ≥ 0,05) (Taula A.45), alhora de continuar analitzant estadísticament els resultats obtinguts.
Segons l’ANOVA de 2 factors realitzada, s’observa un comportament similar als resultats de la variable
anterior. Només s’observen diferències significatives per la concentració de TDZ aplicada al medi de
cultiu (valor p ≤ 0,05) (Taula A.46), independentment del tipus de recipient utilitzat.
El material vegetal multiplicat en medis de cultiu formats per concentracions de 0,25 μM i 0,5 μM de
TDZ afavoreixen la formació de nous microbrots viables (Taula 40) (Figura22).
Figura 21 - Taxa total dels microbrots per a cada tractament (MS)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 59
Taula 40 - Taxa viable (MS)
Tractament Taxa viable
C+T+0 1,0 ± 1,0 b
C+T+0,25 1,7 ± 0,9 a
C+T+0,5 1,3 ± 1,2 a
C+P+0 0,6 ± 0,8 b
C+P+0,25 2,1 ± 2,0 a
C+P+0,5 1,7 ± 1,4 a
Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la
desviació estàndard. Les lletres que acompanyen a les
mitjanes fan referència a els nivells de significació, que
comparteixen lletra no són significativament diferents.
S’ha utilitzat el mètode Tukey per a comparar les mitjanes,
amb un nivell de significança del 5 %. C: Agar Comercial T:
Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de
thidiazuron (μM)
4.2.4. Pes fresc
La prova de variància corresponent a la biomassa fresca del material vegetal cultivat, permet assumir
igualtat de variància en les posteriors proves estadístiques (valor p ≥ 0,05) (Taula A.47).
Figura 22 - Taxa viable dels microbrots per a cada tractament (MS)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 60
L’ANOVA de 2 factors (concentració de TDZ i tipus de recipient de cultiu emprat) indica que hi ha
diferències significatives entre tractaments segons la concentració de regulador de creixement
aplicada en el medi de cultiu i el tipus de recipient de cultiu utilitzat (valor p ≤ 0,05) (Taula A.48). No
obstant, la interacció dels dos factors no afecta a la biomassa fresca que contenen els microbrots
obtinguts (valor p ≥ 0,05) (Taula A.48).
En el cas de la concentració hormonal aplicada, el material vegetal multiplicat en medis de cultiu amb
una dosi hormonal de 0,5 μM de TDZ presenten major biomassa fresca que els microbrots cultivats
amb dosi baixa de TDZ o sense (Taula 41).
Segons el tipus de recipient de cultiu utilitzat, aquells microbrots desenvolupats en pots de cultiu
tendeixen a contenir major biomassa fresca que els cultivats en tub d’assaig (Figura 23).
A la Taula 41, es mostra la separació de mitjanes per els dos factors, les lletres negres representen la
comparació de mitjanes entre el tipus de recipient de cultiu utilitzat. En canvi, les lletres de color blau
indiquen la separació de mitjanes en relació a la concentració de citoquinina aplicada en el medi de
cultiu.
Taula 41 - Pes fresc (MS)
Tractament Pes fresc (g)
C+T+0 0,3644 ± 0,1567 b b
C+T+0,25 0,3787 ± 0,2161 b ab
C+T+0,5 0,4380 ± 0,1964 b a
C+P+0 0,4295 ± 0,1266 a b
C+P+0,25 0,5762 ± 0,1988 a ab
C+P+0,5 0,6027 ± 0,1872 a a
Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la
desviació estàndard. Les lletres que acompanyen a les
mitjanes fan referència a els nivells de significació, que
comparteixen lletra no són significativament diferents.
S’ha utilitzat el mètode Tukey per a comparar les mitjanes,
amb un nivell de significança del 5 %. C: Agar Comercial
T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de
thidiazuron (μM)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 61
4.2.5. Pes sec Al igual que la variable anterior, la prova de variància per a la biomassa seca del material vegetal,
permet assumir igualtat de variància (valor p ≥ 0,05) (Taula A.49). Al realitzar l’ANOVA de 2 factors
(concentració de TDZ i tipus de recipient) per aquesta variable, s’observa un comportament similar a
l’obtingut per la biomassa fresca, cal remarcar que només hi ha diferències significatives pel tipus de
recipient de cultiu utilitzat (valor p ≤ 0,05) (Taula A.50). El material vegetal multiplicat en pots de
cultiu presenta de nou un major pes sec respecte els microbrots desenvolupats en tub d’assaig (Taula
42) (Figura24).
Taula 42 - Pes sec (MS)
Tractament Pes sec (g)
C+T+0 0,0310 ± 0,0110 b
C+T+0,25 0,0341 ± 0,0163 b
C+T+0,5 0,0353 ± 0,0123 b
C+P+0 0,0374 ± 0,0128 a
C+P+0,25 0,0430 ± 0,0133 a
C+P+0,5 0,0447 ± 0,0138 a
Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la
desviació estàndard. Les lletres que acompanyen a les
mitjanes fan referència a els nivells de significació, que
comparteixen lletra no són significativament diferents.
S’ha utilitzat el mètode Tukey per a comparar les mitjanes,
amb un nivell de significança del 5 %. C: Agar Comercial T:
Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de
thidiazuron (μM)
Figura 23 - Pes fresc dels microbrots per a cada tractament (MS)
b
ab
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 62
4.2.6. Contingut hídric
Els percentatge d’aigua obtinguts son molt similars en els dos tipus de recipient de cultiu utilitzat. En
el cas dels microbrots desenvolupats en tubs d’assaig, el contingut d’aigua oscil·la entre 90,5 % i el
91,6 %, mentre que en pots de cultiu, s’obté un rang de contingut hídric entre 91,2 % i el 92,5 % (Taula
43) (Figura 25).
Taula 43 - Contingut hídric (MS)
Tractament Contingut aigua (%)
C+T+0 91,6 ± 1,0
C+T+0,25 90,5 ± 2,4
C+T+0,5 91,6 ± 0,9
C+P+0 91,2 ± 2,2
C+P+0,25 92,5 ± 0,6
C+P+0,5 92,5 ± 0,4
Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la
desviació estàndard. Per aquesta variable s’ha considerat
que no era necessari comparar les mitjanes. C: Agar
Comercial T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5:
dosi de thidiazuron (μM)
Figura 24 - Pes sec dels microbrots per a cada tractament (MS)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 63
4.2.7. Presència de flors
A diferència de l’assaig amb medi β, el material vegetal multiplicat en medi MS no presenta floració
per a cap dels tractaments aplicats.
4.2.8. Presència d’olor
Al igual que l’assaig en medi β i per els subcultius A i B, s’ha quantificat el nombre de propàguls que
feien olor desenvolupats en tubs d’assaig i pots de cultiu respecte el nombre total de propàguls
obtinguts per cada tractament.
En aquest assaig, es va quantificar un major percentatge de propàguls que feien olor respecte
l’obtingut al subcultiu A multiplicat en medi β, però inferior al nombre de propàguls que feien olor en
el subcultiu B.
Els percentatges de nombre de propàguls que feien olor cultivats en tubs d’assaig oscil·len entre el 5,0
% i el 47,1 %, mentre que en pot de cultiu els percentatges de propàguls que feien olor van ser de
l’ordre de 0,0 % fins 21,4 % (Taula 45).
Figura 25 - Contingut hídric dels microbrots per a cada tractament (MS)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 64
Taula 44 - Percentatge de presència d’olor
MS
C+T+0 47,1
C+T+0,25 35,0
C+T+0,5 5,0
C+P+0 0,0
C+P+0,25 14,3
C+P+0,5 21,4
Els valors obtinguts representen el percentatge de
propàguls que fan olor respecte el nombre total de
propàguls obtinguts a cada tractament. C: Agar Comercial
T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de
thidiazuron (μM)
4.2.9. Hiperhidricitat
El material vegetal multiplicat en medi MS també presenta teixit vitrificat en tots els tractaments
aplicats. S’observa una tendència a que el material vegetal cultivat en pot presenti més microbrots
vitrificats que en tub d’assaig. En el cas dels tractaments sense hormona, es detecta el major
percentatge de teixit vitrificat en el material vegetal cultivat en pot (76,9 %) (Taula 46).
Taula 45 - Percentatge d'hiperhidricitat
MS
C+T+0 52,9
C+T+0,25 35,0
C+T+0,5 55,0
C+P+0 76,9
C+P+0,25 42,9
C+P+0,5 35,7
Els valors obtinguts representen el percentatge de
propàguls amb teixit vitrificat respecte el nombre total de
propàguls obtinguts a cada tractament. C: Agar Comercial
T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de
thidiazuron (μM)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 65
4.2.10. Formació de cal·lus
La formació de cal·lus va ser major en el material vegetal multiplicat en medis de cultiu formulats amb
dosis de 0,25 μM i 0,5 μM de TDZ, sobretot en els microbrots desenvolupats en tub d’assaig.
En el cas dels propàguls obtinguts en pots de cultiu, només es va formar cal·lus (64,3 %) quan la
concentració hormonal era elevada ( 0,5 μM TDZ) (Taula 47).
Taula 46 - Percentatge de formació de cal·lus
MS
C+T+0 17,6
C+T+0,25 30,0
C+T+0,5 20,0
C+P+0 0,0
C+P+0,25 0,0
C+P+0,5 64,3
Els valors obtinguts representen el percentatge de
propàguls amb cal·lus respecte el nombre total de
propàguls obtinguts en el cultiu in vitro per cada
tractament. C: Agar Comercial T: Tub d’assaig P: Pot de
cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 66
5. Discussió dels resultats
Els assajos de multiplicació avaluats en aquest TFG es van realitzar a partir de material vegetal que
portava un cert temps cultivat en condicions de in vitro. Se sap que per a algunes espècies l’efecte
subcultiu, és a dir, a quants repicats ha estat sotmès el cultiu té incidència en el desenvolupament dels
nous microbrots (Rodrigues et al., 1998; Ibáñez et al., 2003; Ghareeb & Taha, 2018; Mangas, 2021).
Els assajos realitzats en aquest TFG són la continuació dels iniciats per Mangas (2021). Els seus assajos
corresponien a la iniciació del cultiu i als repicats segon i tercer, mentre que els duts a terme en els
nostres assajos corresponen al quart i cinquè subcultiu.
Cannabis sativa és una espècie vegetal amb una forta dominància apical (Smýkalová et al., 2019), que
fa que les taxes de multiplicació no siguin molt elevades. Les longituds obtingudes en el nostre assaig
en tub de cultiu (quart i cinquè subcultiu) són més similars a les obtingudes per Mangas (2021) en el
tercer subcultiu que en el segon subcultiu. Segurament, aquesta similitud ens indicaria que a partir
del tercer subcultiu les longituds dels microbrots tendeixen a estabilitzar-se i que podrien permetre
afavorir lleugerament les taxes de multiplicació.
La presència de citoquinines, en general promou la formació de brots i inhibeix l’elongació de la tija
(Huetteman & Preece, 1993). En diversos articles sobre la micropropagació de Cannabis sativa,
s’indica aquest comportament (Lata et al., 2009 a, 2009 b, 2016) i Mangas (2021) coincideixen al
afirmar que una de les millors hormones per micropropagar aquesta espècie és el TDZ i que no és
convenient utilitzar concentracions que superin el 0,5 μM de TDZ. No obstant, Wang et al. (2009)
indiquen bones taxes de micropropagació a una dosi de 0,9 μM de TDZ. Segurament, la concentració
d’hormona a utilitzar depèn entre d’altres factors del genotip utilitzat (Monthony et al., 2020; Galán-
Ávila et al., 2021). En el nostre estudi les taxes viables obtingudes, que refereixen al número de nous
propàguls amb els que es pot iniciar el següent subcultiu, no han estat relativament elevades. Els
nostres resultats no difereixen gaire dels obtinguts per Mangas (2021) en el tercer subcultiu, on va
obtenir valors propers a 2 per a les mateixes concentracions hormonals que les emprades en el nostre
estudi (0, 0,25 i 0,5 μM de TDZ). En el nostre assaig la taxa viable va ascendir fins a 3 en el tractament
que contenia 0,5 μM de TDZ. En el cas de la taxa total, taxa que representa la potencialitat del
propàgul, però que sovint degut a la mesura dels nous microbrots aquests no es poden individualitzar
fàcilment per obtenir nous propàguls, va ser superior a les obtingudes per Mangas (2021) en el tercer
subcultiu, ja que cap dels tractaments assajats en el seu cas va superar una taxa total de 3,5 enfront a
unes taxes de 4 i 4,5 obtingudes en el quart i cinquè subcultiu en medis de cultiu formulats amb 0,5
μM de TDZ.
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 67
En el quart subcultiu en el medi β les taxes més altes obtingudes van ser en torn a 3. En el cinquè
subcultiu, en el cas de cultivar en pot, van incrementar fins a 4,5. En canvi, per els tractaments
formulats en MS (quart subcultiu) les taxes van ser més baixes. Altres autors que han utilitzat altres
varietats en medis que contenien sals MS, com és el cas de l’equip de Lata et al. (2009) van obtenir
taxes molt superiors a les nostres, mentre que les obtingudes pel grup de Mestinšek-Mubi et al.
(2020), es situaren en valors en torn a 1,7, més similars als obtinguts en el nostre assaig formulat amb
aquest tipus de sals minerals.
En general, s’ha observat un major pes sec dels microbrots obtinguts en pot que en tub. Aquest fet cal
vincular-lo a unes majors taxes viables obtingudes en aquest tipus de recipient. En el nostre cas, un
major pes no pot ser atribuït a una major longitud de microbrots, ja que pel que respecta a aquest
paràmetre no es van donar diferències significatives entre tractaments. El fet de cultivar en tub,
segurament implica que el material vegetal no pugui desenvolupar-se en el seu màxim potencial, a
més a més, el contacte dels brots amb les parets del tub pot provocar variacions morfològiques
(Kodym & Leeb, 2019; Murphy & Adelberg, 2021).
A diferència de Mangas (2021) vam detectar presència d’olor en tots els tractaments assajats, mentre
que l’esmentada autora pel segon subcultiu no va detectar aquest aroma en medis formulats amb TDZ
ni amb medis formulats a partir de sals de Murashigue i Skoog, però si que va detectar certa presència
d’olor en el tercer subcultiu. La comparació dels dos assajos sembla indicar que a mesura que
augmenten els successius repicats es detecta més presència d’olor. La manifestació d’olor en el cas de
C.sativa es deguda a la síntesi de diferents terpens en els tricomes. Sembla ser que les citoquinines
poden estimular la formació de tricomes i que Cannabis sativa és una espècie que de per sí,
superficialment ja desenvolupa una gran quantitat de pèls o tricomes. Wang et al. (2019) per
Arabidopsis van descriure que un dels factors que afectava al desenvolupament de tricomes eren les
citoquinines.
En relació a la floració, aquesta ha augmentat entre els dos subcultius realitzats en el primer assaig
d’aquest TFG, ja que s’ha detectat major presència floral en el quart subcultiu que en el cinquè.
Observació similar ha estat feta per Mangas (2021) entre el segon i tercer subcultiu, quan els medis
de cultiu contenien BAP o KIN, però no en presència de TDZ. Tant els nostres resultats com el obtinguts
per Mangas (2021), respecte a la incidència de floració en relació al contingut mineral dels medis de
cultiu, semblen indicar que els medis MS presenten nul·la o baixa incidència de floració. El fet en que
en el nostre estudi, el TDZ hagi comportat formació de flors, segurament ho podem relacionar amb
un major nombre de subcultius sofert pel material vegetal. Està referenciat que la presència de certes
citoquinines, com per exemple el TDZ, afavoreixen en condicions in vitro la floració (Montero-Carmona
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 68
& Jiménez, 2009). Quan es micropropaga plantes, el fet de que apareixen flors ha de considerar-se un
aspecte negatiu, ja que segons Cuba-Díaz et al. (2014), per l’espècie Colobanthus quitensis, aquest fet
comportà una disminució de la formació de nous microbrots.
Quan s’utilitzen tècniques de micropropagació per a multiplicar material vegetal, és aconsellable
avaluar diferents subcultius, ja que sovint s’observen diferències entre ells. En el cas de Cannabis
sativa, Page et al. (2020) indiquen que al llarg dels subcultius es produeix una disminució de la taxa
viable de multiplicació, augmenta la hiperhidricitat i la formació de cal·lus.
Una de les problemàtiques més observades quan es multiplica material vegetal in vitro és l’aparició
de problemes de hiperhidricitat. Aquesta problemàtica cal relacionar-la amb una alteració dels teixits
vegetals que fa que aquests esdevinguin translúcids, suculents i/o vitris (Earle & Langhans, 1975;
Debergh, 1983; Ziv et al., 1983). Aquesta anomalia afecta no sols a la morfologia de la planta sinó
també a la seva fisiologia i fa que esdevingui un material no viable. Aquest material ha de ser descartat
i no es apte per seguir obtenint nous microbrots a partir d’ell (Debergh et al., 1981).
Sovint la hiperhidricitat es relaciona en un alt contingut d’humitat relativa en el recipient de cultiu (Ziv
et al., 1987; Ivanova & van Staden, 2010). En el nostre estudi es va manifestar una major hiperhidricitat
quan l’agent gelificant era agar Difco. En la manipulació del medi de cultiu, després de la seva
gelificació, vàrem observar que els solidificats amb agar Difco presentaven una menor consistència.
Aquest fet segurament va contribuir a que es produís una major evaporació de l’aigua continguda en
els medis, augmentant així la humitat relativa dins dels recipients de cultiu. La utilització de pots de
vidre amb tapa i protegits amb film plàstic, per evitar la seva obertura, ocasiona sovint major
condensació d’aigua en relació a la baixa condensació que sovint s’observa quan es cultiva en tubs
d’assaig, ja que aquests es tapen amb uns taps especials que faciliten l’intercanvi gasos entre el tub i
la cambra de cultiu, però alhora evitant possibles entrades d’organismes infecciosos. En el quart
subcultiu es va observar major vitrificació en cultiu en pot que en cultiu en tub d’assaig. Aquest
comportament no es va observar en el cinquè subcultiu. Tot hi aquests fenòmens de vitrificació, en
general, els resultats obtinguts en la taxa de multiplicació indiquen que es més interesant, sobretot a
partir del cinquè subcultiu, emprar pots de cultiu.
En relació a la formació de cal·lus, en el nostre assaig hem detectat major presència en el cinquè
subcultiu que en el quart. Aquest fet també va ser observat per Mangas (2021), que va observar la
formació de cal·lus en el tercer subcultiu.
Un factor que podria intervenir en els canvis observats entre el quart i cinquè subcultiu, podria
relacionar-se amb el contingut hormonal endogen del material vegetal. Normalment, aquest
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 69
contingut hormonal no és analitzat pels grups de recerca que treballen en micropropagació, ja que les
concentracions són molt inferiors a les que s’addicionen en els medis de cultiu de forma exògena. El
grup de Smýkalová et al. (2019) van realitzar un estudi analitzant continguts hormonals endògens. al
llarg de diferents subcultius, i van veure que es les concentracions variaven i que no s’establia cap
pauta generalitzada en el conjunt de les varietats assajades de C. sativa.
6. Conclusions
Les principals conclusions obtingudes al finalitzar el treball son les següents:
- No s’ha pogut establir un medi de multiplicació que permetés obtenir taxes viables de
multiplicació elevades.
- La utilització de pots com a recipient de cultiu permet, generalment, que el material vegetal
desenvolupi una millor taxa de multiplicació i un major pes sec.
- Els percentatges d’olor, de floració i formació de cal·lus augmenten a mesura que es realitzen
els successius repicats i formulats amb medi β en presència de TDZ.
- La floració dels microbrots en medi MS és baixa o pràcticament nul·la.
- L’aparició d’hiperhidricitat augmenta amb els subcultius successius provocant una
intensificació de microbrots no viables i propàguls amb teixit vegetal vitrificat.
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 70
Bibliografia
Ángeles, G. E., Brindis, F., Niizawa, S. C.; & Ventura, R. (2014). Cannabis sativa L., una planta singular.
Revista mexicana de ciencias farmacéuticas, 1-6.
http://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=S1870-01952014000400004&script=sci_arttext
Azcón-Bieto, J.; & Talón, M. (2000). Fundamentos de fisiología vegetal. McGrawHill Interamericana,
Madrid, 651 pp.
https://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/FundamentosdeFisiologiaVegetal2008Az
con..pdf
Caplan, D., Stemeroff, J., Dixon, M., & Zheng, Y. (2018). Vegetative propagation of Cannabis by stem
cuttings: effects of leaf number, cutting position, rooting hormone and leaf tip removal.
Canadian Journal of Plant Science, 98(5). DOI: 10.1139/cjps-2018-0038
Chandra, S., Lata, H., & ElSohly, M. A. (2017). Cannabis sativa L. Botany and Biotechnology. Springer
Verlag, Cham, Suïssa, 474 pp. DOI:10.1007/978-3-319-54564-6
Comissió Europea (2020). Common catalogue of varieties of agricultural plant species.
https://ec.europa.eu/food/system/files/2021-02/plant-variety-catalogues_agricultural-
plant-species.pdf
Cuba-Díaz, M., Acuña, D., Cordero, C. M., & Klagges, M. (2014). Optimización de parámetros para la
propagación in vitro de Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl. Gayana Botánica, 71(1), 58-67.
DOI:https://dx.doi.org/10.4067/S0717-66432014000100009
Debergh, P. C. (1983). Effects of agar brand and concentration on the tissue culture medium.
Physiologia Plantarum, 59(2), 270-276. DOI: 10.1111/j.1399-3054.1983.tb00770.x
Debergh, P., Harbaoui, Y., & Lemeur, R. (1981). Mass propagation of globe artichoke (Cynara
scolymus): Evaluation of different hypotheses to overcome vitrification with special
reference to water potential. Physiology Plantarum, 53(2), 181-187.
Debergh, P. C. and L. J. Maene. 1981. A scheme for commercial propagation of ornamental plants by
tissue culture. Science Horticulturae, 14, 335–345.
Departament d'Acció Climàtica, Agricultura i Desenvolupament Rural (2021). Cultiu del Cànem.
http://agricultura.gencat.cat/ca/ambits/agricultura/cultiu-canem/
Earle, E. D., & Langhans, R. W. (1975). Carnation propagation from shoot tips cultured in liquid
medium. HortScience, 10, 608-610.
Elsohly, M. A., Mehmedic, Z., Foster, S., Gon, C., Chandra, S., & Church, J. C. (2016). Changes in
Cannabis Potency Over the Last 2 Decades (1995-2014): Analysis of Current Data in the
United States. Biological Psychiatry, 79(7), 613-619. DOI:10.1016/j.biopsych.2016.01.004
ElSohly, M. A., Radwan, M. M., Gul, W., Chandra, S., & Galal, A. (2017). Phytochemistry of Cannabis
sativa L. Progress in the Chemistry organic products, 103, 1-36. DOI:10.1007/978-3-319-
45541-9_1
Fernández, Y. (2021). Efecto de la composición del medio de cultivo en la micropropagación de tres
variedades de Cannabis sativa L. (Trabajo de fin de grado). Universitat Politècnica de
Catalunya. https://upcommons.upc.edu/handle/2117/348971
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 71
Ferrer, C. (2005). La biblia del Cannabis. Ed: Carena editors, València, 156 pp.
Flores-Sanchez, I., & Verpoorte, R. (2008). Secondary metabolism in Cannabis. Phytochemistry
Reviews, 7, 615-639. DOI:10.1007/s11101-008-9094-4
Galán-Ávila, A., Gramazio, P., Ron, M., & Herraiz, F. J. (2021). A novel and rapid method for
Agrobacterium-mediated production of stably transformed Cannabis sativa L. plants.
Industrial Crops and Products, 170. DOI: 10.1016/j.indcrop.2021.113691
Gao, H., Li, J., Ji, H., An, L., & Xia, X. (2018). Hyperhydricity-induced ultrastructural and physiological
changes in blueberry (Vaccinium spp.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 133, 65-76.
DOI:10.1007/s11240-017-1361-x
George, E. F., Hall, M. A., & Klerk, G. D. (2008). Plant Growth Regulators II: Cytokinins, their
analogues and antagonists. Plant Propagation by Tissue Culture. Ed: Springer, Dordrecht,
Basingstoke, Regne Unit, 502 pp. DOI: 10.1007/978-1-4020-5005-3_6
Ghareeb, Z. F., & Taha, L. S. (2018). Micropropagation protocol for Antigonon leptopus an important.
Journal og Genetic Engineering and Biotechnology, 16(2), 669-675.
DOI:10.1016/j.jgeb.2018.03.008
Huetteman, C. A., & Preece, J. E. (1993). Thidiazuron: a potent cytokinin for woody plant tissue
culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 33, 105-119. DOI: 10.1007/BF01983223
Ibáñez, A., Valero, M., & Morte, A. (2003). Influence of cytokinins and subculturing on proliferation.
Anales de Biología, 25, 81-90. https://www.um.es/analesdebiologia/numeros/25/PDF/09-
INFLUENCE.pdf
Ivanova, M., & van Staden, J. (2010). Natural ventilation effectively reduces hyperhydricity in shoot
cultures of Aloe polyphylla Schönland ex Pillans. Plant Growth Regulation, 60(2), 143-150.
DOI: 10.1007/s10725-009-9430-8
Kodym, A., & Leeb, C. J. (2019). Back to the roots: protocol for the photoautotrophic
micropropagation of medicinal Cannabis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 138, 399-402.
DOI: 10.1007/s11240-019-01635-1
Lata, H., Chandra, S., Khan, I. A., & ElSohly, M. A. (2009). Propagation through alginate encapsulation
of axillary buds of Cannabis sativa L. — an important medicinal plant. Physiology and
Molecular Biology of Plants, 15, 79-86. DOI: 10.1007/s12298-009-0008-8
Lata, H., Chandra, S., Khan, I., & ELSohly, M. A. (2009). Thidiazuron-induced high-frequency direct
shoot organogenesis of Cannabis sativa L. In vitro cellular & developmental biology-Plant, 45,
12-19. DOI: 10.1007/s11627-008-9167-5
Lata, H., Chandra, S., Khan, I., & ElSohly, M. A. (2010). High frequency plant regeneration from leaf
derived callus of high Δ9-tetrahydrocannabinol yielding Cannabis sativa L. Planta Medica,
76(14), 1629-1633. DOI:10.1055/s-0030-1249773
Lata, H., Chandra, S., Techen, N., Khan, I., & ElSohly, M. A. (2016). In vitro mass propagation of
Cannabis sativa L.: A protocol refinement using novel aromatic cytokinin meta-topolin and
the assessment of eco-physiological, biochemical and genetic fidelity of micropropagated
plants. Journal of Applied Research on Medicinal and Aromatic Plants, 3, 18-26. DOI:
10.1016/j.jarmap.2015.12.001
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 72
Liu, M., Jiang, F., Kong, X., Tian, J., Wu, Z., & Wu, Z. (2017). Effects of multiple factors on
hyperhydricity of Allium sativum L. Scientia Horticulturae, 217, 285-296.
DOI:10.1016/j.scienta.2017.02.010
Lu, C. (1993). The use of thidiazuron in tissue culture. In vitro cellular & developmental biology-plant,
29, 92-96. DOI: 10.1007/BF02632259
Mangas, S. (2021). Estudio del efecto de diferentes citoquininas para la propagación in vitro de
Cannabis sativa L. variedad carmagnola ( Trabajo de Fin de Grado). Universitat Politècnica de
Catalunya. https://upcommons.upc.edu/handle/2117/349218
Marzocchi, S., & Caboni, M. F. (2020). Effect of harvesting time on hemp (Cannabis sativa L.) seed oil
lipid composition. Italian Journal of Food Science, 32(4), 1018-1029. DOI: 10.14674/IJFS.1898
Mestinšek-Mubi , S., Svetik , S., Flajšman, M., & Murovec , J. (2020). In vitro tissue culture and
genetic analysis of two high-CBD medical cannabis (Cannabis sativa L.) breeding lines.
Genetika, 52, 925-941. DOI: 10.2298/GENSR2003925M
Montero-Carmona, W., & Jiménez, V. M. (2009). Floración in vitro - revisión de literatura ,
Biotecnología Vegetal, 9(1), 3-18.
https://revista.ibp.co.cu/index.php/BV/article/view/302/html
Monthony, A., Kyne, S., Grainger, C., & Jones, A. (2020). Recalcitrance of Cannabis sativa to de novo
regeneration; a multi-genotype replication study. PLoS ONE 16(8): e0235525. DOI:
10.1371/journal.pone.0235525
Murashige, T. (1974). Plant propagation through tissue cultures. Anual review plant Physiology,
25,135-166. DOI: 10.1146/annurev.pp.25.060174.001031
Murashige, T., & Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bio assays with Tobacco
tissue cultures. Physiologia Plantarum, 3(15), 473-497. DOI: 10.1111/j.1399-
3054.1962.tb08052.x
Murphy, R., & Adelberg, J. (2021). Physical factors increased quantity and quality of
micropropagated shoots of Cannabis sativa L. in a repeated harvest system with ex vitro
rooting. In vitro cellular & developmental biology-plant. DOI: 10.1007/s11627-021-10166-4
Page, S., Monthony, A., & Jones, A. (2020). DKW basal salts improve micropropagation and
callogenesis compared to MS basal salts in multiple commercial cultivars of Cannabis sativa.
Biorxiv. DOI: 10.1101/2020.02.07.939181
Richez-Dumanois, C., Braut-Boucher, F., Cosson, L., & Paris, M. (1986). Multiplication végétative in
vitro du chanvre (Cannabis sativa L.) Agronomie, EDP Sciences, 6(5), 487- 495.
https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-00884901/document
Rodrigues, P., Tulmann Neto, A., Cassieri Neto, P., & Mendes, B. (1998). Influence of the number of
subcultures on somaclonal variation in micropropagated Nanicão (Mussa spp., AAA GROUP).
Acta Horticulture, 490, 469-474. DOI:10.17660/ActaHortic.1998.490.49
Russo, E. B. (2007). History of Cannabis and its preparations in saga, science, and sobriquet.
Chemistry & biodiversity, 4(8), 1614-1648. DOI: 10.1002/cbdv.200790144
Smýkalová, I., Vrbová, M., Cvečková, M., Plačková, L., Žukauskaitė, A., Zatloukal, M., Hrdlička J.,
Plíhalová L., Doležal K., Griga, M. (2019). The effects of novel synthetic cytokinin derivatives
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 73
and endogenous cytokinins on the in vitro growth responses of hemp (Cannabis sativa L.)
explants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 139, 381-394. DOI: 10.1007/s11240-019-
01693-5
Tarkowská, D., Doležal, K., Tarkowski, P., Åstot, C., Holub, J., Fuksová, Schmülling T., Sandberg G.,
Strnad M. (2003). Identification of new aromatic cytokinins in Arabidopsis thaliana and
Populus × canadensis leaves by LC-(+)ESI-MS and capillary liquid chromatography/frit–
fast atom bombardment mass spectrometry. Physiologia Plantarum, 117(4), 579-590.
DOI:10.1034/j.1399-3054.2003.00071.x
van den Dries, N., Gianni, S., Czerednik, A., Krend, F. A., & de Klerk, G. M. (2013). Flooding of the
apoplast is a key factor in the development. Journal of Exprimental Botany, 64(16), 5221-
5230. DOI:10.1093/jxb/ert315
Waldo, A. (2006). History of Cannabis as a medicine: a review. Brazilian Journal of Psychiatry, 28(2),
153-157. DOI: 10.1590/S1516-44462006000200015
Wang, R., He, L., Xia, B., & Tong, J. (2009). A micropropagation system for cloning of hemp (Cannabis
sativa L.) by shoot tip culture. Pakistan Journal of Botany, 41(2), 603-608.
Wang, Z., Yang, Z., & Li, F. (2019). Updates on molecular mechanisms in the development of
branched trichome in Arabidopsis and nonbranched in cotton. Plant Biotechnology Journal,
17, 1706-1722. DOI: 10.1111/pbi.13167
Wróbel, T., Dreger, M., Wielgus, K., & Slomski, R. (2020). Modified nodal cuttings and shoot tips
protocol for rapid regeneration of Cannabis sativa L. Journal of Natural Fibers. DOI:
10.1080/15440478.2020.1748160
Ziv, M., Meir, G., & Halevy, A. H. (1983). Factors influencing the production of hardened glaucous
carnation plantlets in vitro. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2, 55-60.
Ziv, M., Schwartz, A., & Fleminger, D. (1987). Malfunctioning stomata in vitreous leaves of carnation
(Dianthus caryophyllus) plants propagated in vitro; Implications for hardening. Plant Science,
52, 127-134. DOI: 10.1016/0168-9452(87)90114-2
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 74
Índex taules annex
Taula A. 1- Prova de variància Longitud (Subcultiu A, Tub d'assaig) .................................................... 76
Taula A. 2 - ANOVA de 2 factors Longitud (Subcultiu A, Tub d'assaig) ................................................. 76
Taula A. 3 - Prova de variància Longitud (Subcultiu A, Pot) .................................................................. 76
Taula A. 4 - ANOVA de 2 factors Longitud (Subcultiu A, Pot) ............................................................... 76
Taula A. 5 - Prova de variància Taxa total (Subcultiu A, Tub d'assaig) .................................................. 76
Taula A. 6 - Prova Welch-ANOVA Taxa total (Subcultiu A, Tub d'assaig) .............................................. 76
Taula A. 7 - Prova de variància Taxa total (Subcultiu A, Pot) ................................................................ 77
Taula A. 8 - Prova Welch-ANOVA Taxa total (Subcultiu A, Pot) ............................................................ 77
Taula A. 9 - Prova de variància Taxa viable (Subcultiu A, Tub d'assaig) ................................................ 77
Taula A. 10 - ANOVA de 2 factors Taxa viable (Subcultiu A, Tub d'assaig) ........................................... 77
Taula A. 11 - Prova de variància Taxa viable (Subcultiu A, Pot) ............................................................ 77
Taula A. 12 - ANOVA de 2 factors Taxa viable (Subcultiu A, Pot).......................................................... 77
Taula A. 13 - Prova de variància Pes fresc (Subcultiu A, Tub d'assaig) ................................................. 78
Taula A. 14 - Prova Welch-ANOVA Pes fresc (Subcultiu A, Tub d'assaig) ............................................. 78
Taula A. 15 - Prova de variància Pes fresc (Subcultiu A, Pot) ................................................................ 78
Taula A. 16 - Prova Welch-ANOVA Pes fresc (Subcultiu A, Pot) ............................................................ 78
Taula A. 17 - Prova de variància Pes sec (Subcultiu A, Tub d'assaig) .................................................... 78
Taula A. 18 - ANOVA de 2 factors Pes sec (Subcultiu A, Tub d'assaig) .................................................. 78
Taula A. 19 - Prova de variància Pes sec (Subcultiu A, Pot) .................................................................. 78
Taula A. 20 - Prova Welch-ANOVA Pes sec (Subcultiu A, Pot) .............................................................. 79
Taula A. 21 - Prova de variància Longitud (Subcultiu B, Tub d'assaig) .................................................. 79
Taula A. 22 - Prova Welch-ANOVA Longitud (Subcultiu B, Tub d'assaig) .............................................. 79
Taula A. 23 - Prova de variància Longitud (Subcultiu B, Pot) ................................................................ 79
Taula A. 24 - ANOVA de 2 factors Longitud (Subcultiu B, Pot) ............................................................. 79
Taula A. 25 - Prova de variància Taxa total (Subcultiu B, Tub d'assaig) ................................................ 79
Taula A. 26 - Prova Welch-ANOVA Taxa total (Subcultiu B, Tub d'assaig) ............................................ 79
Taula A. 27 - Prova de variància Taxa total (Subcultiu B, Pot) .............................................................. 80
Taula A. 28 - Prova Welch-ANOVA Taxa total (Subcultiu B, Pot) .......................................................... 80
Taula A. 29 - Prova de variància Taxa viable (Subcultiu B, Tub d'assaig) .............................................. 80
Taula A. 30 - Prova Welch-ANOVA Taxa viable (Subcultiu B, Tub d'assaig) .......................................... 80
Taula A. 31 - Prova de variància Taxa viable (Subcultiu B, Pot) ............................................................ 80
Taula A. 32 - Prova Welch-ANOVA Taxa viable (Subcultiu B, Pot) ........................................................ 80
Taula A. 33 - Prova de variància Pes fresc (Subcultiu B, Tub d'assaig).................................................. 80
Taula A. 34 - Prova Welch-ANOVA Pes fresc (Subcultiu B, Tub d'assaig) ............................................. 81
Taula A. 35 - Prova de variància Pes fresc (Subcultiu B, Pot) ................................................................ 81
Taula A. 36 - Prova Welch-ANOVA Pes fresc (Subcultiu B, Pot) ............................................................ 81
Taula A. 37 - Prova de variància Pes sec (Subcultiu B, Tub d'assaig) .................................................... 81
Taula A. 38 - Prova Welch-ANOVA Pes sec (Subcultiu B, Tub d'assaig) ................................................ 81
Taula A. 39 - Prova de variància Pes sec (Subcultiu B, Pot) .................................................................. 81
Taula A. 40 - Prova Welch-ANOVA Pes sec (Subcultiu B, Pot) .............................................................. 81
Taula A. 41 - Prova de variància Longitud (MS) .................................................................................... 82
Taula A. 42 - ANOVA de 2 factors Longitud (MS) .................................................................................. 82
Taula A. 43 - Prova de variància Taxa total (MS) .................................................................................. 82
Taula A. 44 - ANOVA de 2 factors Taxa total (MS) ................................................................................ 82
Taula A. 45 - Prova de variància Taxa viable (MS) ................................................................................ 82
Taula A. 46 - ANOVA de 2 factors Taxa viable (MS) .............................................................................. 82
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 75
Taula A. 47 - Prova de variància Pes fresc (MS) .................................................................................... 83
Taula A. 48 - ANOVA de 2 factors Pes fresc (MS) .................................................................................. 83
Taula A. 49 - Prova variància Pes sec (MS) ............................................................................................ 83
Taula A. 50 - ANOVA de 2 factors Pes sec (MS) .................................................................................... 83
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 76
Annex estadístic
Assaig de multiplicació medi β
Subcultiu A
Taula A. 1- Prova de variància Longitud (Subcultiu A, Tub d'assaig)
Taula A. 2 - ANOVA de 2 factors Longitud (Subcultiu A, Tub d'assaig)
Taula A. 3 - Prova de variància Longitud (Subcultiu A, Pot)
Taula A. 4 - ANOVA de 2 factors Longitud (Subcultiu A, Pot)
Taula A. 5 - Prova de variància Taxa total (Subcultiu A, Tub d'assaig)
Taula A. 6 - Prova Welch-ANOVA Taxa total (Subcultiu A, Tub d'assaig)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 77
Taula A. 7 - Prova de variància Taxa total (Subcultiu A, Pot)
Taula A. 8 - Prova Welch-ANOVA Taxa total (Subcultiu A, Pot)
Taula A. 9 - Prova de variància Taxa viable (Subcultiu A, Tub d'assaig)
Taula A. 10 - ANOVA de 2 factors Taxa viable (Subcultiu A, Tub d'assaig)
Taula A. 11 - Prova de variància Taxa viable (Subcultiu A, Pot)
Taula A. 12 - ANOVA de 2 factors Taxa viable (Subcultiu A, Pot)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 78
Taula A. 13 - Prova de variància Pes fresc (Subcultiu A, Tub d'assaig)
Taula A. 14 - Prova Welch-ANOVA Pes fresc (Subcultiu A, Tub d'assaig)
Taula A. 15 - Prova de variància Pes fresc (Subcultiu A, Pot)
Taula A. 16 - Prova Welch-ANOVA Pes fresc (Subcultiu A, Pot)
Taula A. 17 - Prova de variància Pes sec (Subcultiu A, Tub d'assaig)
Taula A. 18 - ANOVA de 2 factors Pes sec (Subcultiu A, Tub d'assaig)
Taula A. 19 - Prova de variància Pes sec (Subcultiu A, Pot)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 79
Taula A. 20 - Prova Welch-ANOVA Pes sec (Subcultiu A, Pot)
Subcultiu B
Taula A. 21 - Prova de variància Longitud (Subcultiu B, Tub d'assaig)
Taula A. 22 - Prova Welch-ANOVA Longitud (Subcultiu B, Tub d'assaig)
Taula A. 23 - Prova de variància Longitud (Subcultiu B, Pot)
Taula A. 24 - ANOVA de 2 factors Longitud (Subcultiu B, Pot)
Taula A. 25 - Prova de variància Taxa total (Subcultiu B, Tub d'assaig)
Taula A. 26 - Prova Welch-ANOVA Taxa total (Subcultiu B, Tub d'assaig)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 80
Taula A. 27 - Prova de variància Taxa total (Subcultiu B, Pot)
Taula A. 28 - Prova Welch-ANOVA Taxa total (Subcultiu B, Pot)
Taula A. 29 - Prova de variància Taxa viable (Subcultiu B, Tub d'assaig)
Taula A. 30 - Prova Welch-ANOVA Taxa viable (Subcultiu B, Tub d'assaig)
Taula A. 31 - Prova de variància Taxa viable (Subcultiu B, Pot)
Taula A. 32 - Prova Welch-ANOVA Taxa viable (Subcultiu B, Pot)
Taula A. 33 - Prova de variància Pes fresc (Subcultiu B, Tub d'assaig)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 81
Taula A. 34 - Prova Welch-ANOVA Pes fresc (Subcultiu B, Tub d'assaig)
Taula A. 35 - Prova de variància Pes fresc (Subcultiu B, Pot)
Taula A. 36 - Prova Welch-ANOVA Pes fresc (Subcultiu B, Pot)
Taula A. 37 - Prova de variància Pes sec (Subcultiu B, Tub d'assaig)
Taula A. 38 - Prova Welch-ANOVA Pes sec (Subcultiu B, Tub d'assaig)
Taula A. 39 - Prova de variància Pes sec (Subcultiu B, Pot)
Taula A. 40 - Prova Welch-ANOVA Pes sec (Subcultiu B, Pot)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 82
Assaig de multiplicació medi MS
Taula A. 41 - Prova de variància Longitud (MS)
Taula A. 42 - ANOVA de 2 factors Longitud (MS)
Taula A. 43 - Prova de variància Taxa total (MS)
Taula A. 44 - ANOVA de 2 factors Taxa total (MS)
Taula A. 45 - Prova de variància Taxa viable (MS)
Taula A. 46 - ANOVA de 2 factors Taxa viable (MS)
Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 83
Taula A. 47 - Prova de variància Pes fresc (MS)
Taula A. 48 - ANOVA de 2 factors Pes fresc (MS)
Taula A. 49 - Prova variància Pes sec (MS)
Taula A. 50 - ANOVA de 2 factors Pes sec (MS)