Efecto del pH y la temperatura

Dr. José Luis Cárdenas LópezEnzimas de Productos Marinos

Semestre 2014-1

Cooperatividad y alosterismo

Alostería

Bajo [S] Alto [S]Cambio de conformación

Se presenta en enzimas multisubunidades los sitios activos se comunicanLas enzimas cambian de forma, cambian su reactividad

Alo (otro) Steria (forma)

Kd1Kd2

Kd1 > Kd2 S adicional favorece los cuadros, que se unen mejorpor lo que sera cooperatividad positiva

Kd1 < Kd2 S adicional favorece los cuadros, que se unen peorpor lo que será cooperatividad negativa

¿Como medirla?

max1.0_][

max9.0_][

VVaqueproduzcS

VVaqueproduzcSRs

===

Rs = Factor de cooperatividad

max1.0_][ VVaqueproduzcS =

Cooperatividad positiva Rs < 81Cooperatividad negativa Rs > 81Comportamiento MMenten Rs 81

Demostrar esto

Ejercicio:

Michaelis Menten

][

][9.0

max

max9.0

SKm

S

V

v

Vv

=++

==

=

][1.0][1.0

][

][1.0

max

max1.0

SKmS

SKm

S

V

v

Vv

=++

==

=

][9

][1.09.0

][9.0][9.0

SKm

SKm

SKmS

==

=+

][9

1

][9.01.0

][1.0][1.0

SKm

SKm

SKmS

=

==+

81

9

1

9 ==Km

KmRs

Efecto del pH

pepsina peroxidasa tripsina fosfatasa alcalina

pH

Vo

2 6 8 10

¿Porqué?

• ¿Porqué pH optimos diferentes?• ¿Porqué la forma de campana?• ¿Porqué a veces son asimétricos?• ¿Qué controla la anchura?• ¿Qué controla la anchura?Explicación:1. estabilidad de la enzima2. ionización del sustrato, cofactor, buffer, etc.3. Ionización de los grupos de la enzima que

alteran el Km o Vmax

Estabilidad

• Almacenar a condiciones experimentales (diferentes pH’s, diferentes tiempos), luego hacer el ensayo en condiciones óptimas (sirve para monitorear la óptimas (sirve para monitorear la desnaturalización)

• Duración del comportamiento lineal a [S]>>>Km

[S]>>>Km

Perdiendo producto

Desviación de lo lineal

Perdiendo

actividadproducto

tiempo

Posibles resultados

constante

decreciente

creciente

V residualVo

decrecientecampana

pH de almacenamiento

Vo

¿El pH óptimo dependiente del tiempo?

pH

vEnsayo corto

Ensayo largo

Ionizaciones

• Buffer• Sustrato• Cofactor• Enzima

HPO4-2 PO4

-3 + H+

SH2 SH- + H+

CoFH CoF- + H+• Enzima

El caso mas interesante, puede ser

o de la enzima libre o del complejo ES

Las proteinas tienen muchos grupos ionizables,

pero solo algunos pocos afectan la actividad,

los que se encuentran en el sitio activo

Ionizaciones de la enzima

1) Estos son los que se ionizan a pH neutro• Grupo pKa ∆H ionización (Kj)• Cys 8.33 6.5-7.0• Asp 3.86• Asp 3.86• Glu 4.25• Lys 10.53• Arg 12.48 12-13• His 6.0 6.9-7.5� α-carboxilo 2.1-2.3 0� α-amino 9.1-10.8 10-13

Los pKa se alteran por la polaridad del ambiente

• Ambiente hidrofóbico� forma no cargada

• Cadenas laterales cargadas vecinas �forma cargada�forma cargada

pKa2pKa1

pH

Vo

2 H+ removibles

S+EH2 EH2S EH2+P

- H+

Posible diagrama de equilibrio

S+EH- EH- S EH- +P

S+E-2 E-2 S E-2 +P

- H+

- H+

Primero ver catálisis

Vmax

ESH-

¿Cómo?Hacer un experimento a [S]>>>Km, la velocidad es igual a Vmax

ES-2ESH2

pH

Vmax

Luego ver la unión

Vmax/Km

EH-

Igual hacer un experimento con [S]<<<Km, la velocidad es igual a Vmax/Km

E-2EH2

pH

Vmax/Km

Regla: Una ionización tiene que ver o con catálisis o con unión, no con ambas

Resultado

S+EH2 EH2S EH2+P

- H+

S+EH- EH- S EH- +P

S+E-2 E-2 S E-2 +P

- H+

- H+

Efectos de la Temperatura

• Estabilidad de la enzima• Cambios en la solubilidad (sólidos más

solubles a >temp, gases menos solubles a >temp)>temp)

• Ionizaciones de los buffers (Tris varía cerca de 0.03 unidades de pK/oC)

• Efectos en el equilibrio• Efectos en el paso catalítico ES ����E+P

Dependencia de la temperatura• Aun a pH const y ausencia de

ionizaciones, la vel de la Rx depende de la Temperatura

¿Porqué?

Gráfica típica de Vo vs T

T optima

desnaturalizacion

Vo

T (oC)

La rx se aceleraAl incrementar T

Estimación de velocidades a otras temperaturas de las del

ensayo

Q10 = velocidad a (T +10)/ velocidad a T

Predice la velocidad de la reacción a 10, 20, 30 grados,

siempre y cuando no se pase del óptimosiempre y cuando no se pase del óptimo

Para intervalos diferentes de 10 se usa:

∆log velocidad = T/10 log Q10

Enzimas 1.4 <Q10<3.0

Interpretacion del Q10

T 2 3 4

0 1 1 1

10 2 3 410 2 3 4

20 4 9 16

30 8 27 64

40 16 81 256

Una rx química

Ea

Energia

Rx

Cambio neto de energia

Grafica de Arrhenius

-Ea/R

k=Ae -(Ea/RT)

1/T (1/ oK)

ln k

Catalizada por enzimas

Ed/R

-Ea/R

1/T

ln k

Magnitud de la velocidad de Rx

Ea(Kcal/mol)

catalizador Velocidad relativa(25oC)

18 ninguno 1

13.5 I- 2.07 x 103

6.4 catalasa 3.47 x 108

La Ea se relaciona un poco con el Q10

Ea(Kcal/mol)

Q10

6 ≈1.46 ≈1.4

12 2

18 3

Para determinar Ea• Usamos• Sacamos log de cada lado

k=Ae -(Ea/RT)

ln k= ln A - (Ea/RT)

• Por lo que una gráfica de ln k contra 1/T, nos dará una línea recta con pendiente –Ea/R

• La constante de los gases (R) está en energía/mol °, por lo que Ea/RT es sin unidades (Ea es energía/mol)

Uso

• la ecuación de Arrhenius predice las tasas de reacción a diferentes temperaturas y usa un parámetro para entender de manera intuitiva la dependencia de la manera intuitiva la dependencia de la reacción en la temperatura, pero no nos dice cómo…

Teoría de colisiones

• Donde P representa la probabilidad de que una colisión tenga la correcta orientación para producir una reacción y zes la energía cinética

k=Pz e -(Ea/RT)

es la energía cinética• No todas las colisiones son productivas• De donde viene la dependencia de la

temp?– La energía cinética es proporcional a la temp

absoluta– A 0°K la energía cinética es 0

Intermedio “la ecuación de Boltzman”

Es idéntica a la ecuación de Arrhenius, solo que la kB está en energía/molécula gradoEn lugar de energía /mol grado

Entonces, la constante k es proporcional a la población de moléculasque tienen cierta energía (Ea), por encima del estado basal

Esta energía proviene de las COLISIONES activadas por la temperatura

De donde viene la dependencia de la temperatura?

– La energía cinética es proporcional a la temp absoluta

– A 0°K la energía cinética es 0– Conforme se incrementa la temperatura se dá – Conforme se incrementa la temperatura se dá

un incremento fraccional – De 20°a 30° 10/293 cerca de 3% – (muy poco)

Que tal del exponente? Asumir Ea = 12 Kcal/mol

Un incremento del doble!!

Obviamente, la dependencia de la temperatura de debe al términoexponencial

Teoría de Eyring

K= (KBT/h)e(-∆G*/RT)

KB constante de Boltzmann= 1.38 x 10-16 erg/o

h constante de Planck = 6.624 x 10 –27 erg sR constante de los gases = 1.98 cal/mol o

∆G* es la energia libre de activacion

kBT/h tiene unidades de (erg/o)o / erg s = 1/s “por segundo”Unidades de frecuencia vibratoria o Hertz“La velocidad a la cual el estado de transicion desaparece yse convierte en producto”

¿Cómo calcular los parámetros termodinámicos?

-(∆H*/R)y ∆S* se calcula de

∆S*=(∆H*-∆G*)/T

∆G*= ∆H*-T ∆S*

1/T

ln k/T

∆S*=(∆H*-∆G*)/T

Breve paréntesis termodinámico

∆G°=-RT ln Keq∆G°= ∆H°-T ∆S°Por lo que:

∆ ∆-RT ln Keq= ∆H°-T ∆S°y ln Keq= (∆H°/ RT)- ( ∆S°/R), así que se

puede graficar ln Keq vs 1/T y la pendiente será -∆H°/ R

-(∆H*/R)

1/T

ln Keq