Enfermedad de Gaucher: Diagnóstico y avances en el tratamiento

Dr. Miguel PocovíCatedrático de Bioquímica y Biología MolecularUniversidad de Zaragoza

Barcelona 22 Septiembre 2013

Phillip-Charles-Ernest Gaucher

Enfermedad de Gaucher– una EDL

• La enfermedad lisosomal mas frecuente.

• Autosómica recesiva.

• 1:15 judíos Ashkenazi son portadores y

1: 850 la padecen.1: 850 la padecen.

• Otras poblaciones 1:40.000 -1:100.000.

• Dispone de varios tipos de tratamiento.

• Deficiencia de Glucocerobrosidasa lisosomal.

Macrófagos tisulares

InfiltracionesFibrosis intersticial

Ocupación de los alveolos

Manifestaciones clínicas

Células Kupffer

Matraz de ErlenmeyerOsteonecrosis

Osteoesclerosis

Osteoclastos

Médula ósea

Anemia, trombocitopenia

Células de Gaucher

Otros órganosCorazón

Nódulos linfáticos

Sistema nervioso central

Riñones

Manifestaciones oculares

Manifestaciones cutáneas

Fenotipo Continuo

Tipo 1

Tipo 2

Tipo 3

Hidropsfetalis

EpilepsiaMioclonia

AfectaciónBulbar

Movimientossacádicos

Asintomaticos Hepatoespleno-megalia

Sidransky et al 2004

DiagnósticoDiagnóstico

¿Qué pretendemos con el diagnóstico?

• Hacer un diagnóstico precoz, antes que aparezca patología irreversible en:

• Recién nacidos• Niños• Niños• Adolescentes• Familiares• Población seleccionada, por ejemplo….

Estrategias de búsqueda de pacientes con EG

• Trombocitopenia de origen no filiado o atribuida a hiperesplenismo, sin marcadores de hepatopatía crónica de origen cirrótico o trombocitopenia de origen inmune

• Esplenomegalia de origen no filiado asociada o no a cirrosis hepática. Pacientes esplenectomizados sin diagnóstico hepática. Pacientes esplenectomizados sin diagnóstico concreto

• Fractura espontánea de cadera no justificada. Osteomielitis “aséptica”

• Fosfatasa ácida + esplenomegalia u otros?

Mistry PK et al. Am J Hematol 2011

Mistry PK et al. Am J Hematol 2011

Aspirado de médula ósea:Células

Células de Gaucher

No aconsejable si es primera opción:Existen metodos menos invasivos para diagnostico.Presencia de celulas pseudo-Gaucher: mieloma múltiple, SMD, LMC….

Glucosilceramida Ceramida + Glucosaglucocerebrosidasa

Como se diagnostica la EG? (I)

Leucocitos/fibroblastos

pH 5

Como se diagnostica la EG? (II)

Taurocholato

37ºC, 2h

4-metilumbeliferil-β-D-glucopiranósido(Sigma) β-D-glucopiranosa 4-metilumbeliferona

4MUλexcitación = 366 nmλemisión = 446 nm

Actividad enzimática (nmol/mgp.h)

16

18

20

22

24

26

28

30

¿Qué nos aporta el análisis enzimático?

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Pacientes Portadores Sanos

En leucocitos o fibroblastos

:CostosoNecesidad de controles. ValoresestándaresSolapamiento

Casos especiales : Gota de sangre sobrepapel de filtro (FTA)

DNAActividadenzimática

β-glucocerebrosidasaAnálisis gen

GBA

Importancia de que las gotas de sangre sean homogéneas

1 gota 2 gotas 3 gotas

GΒΑ actividad X 2X 3X

Debe depositarse idéntica cantidad que en controles

Diagnóstico genético

Herencia: Autosómica recesiva

Defecto genético: Mutaciones en el gen de GBA (>300)(1)

Gen de GBACromosoma 1

Región q21

Enfermedad de GaucherSujeto sano

Sujeto portador

Sujeto enfermo

Región q217 Kb

11 exones

GBA I II III V VI VII VIII IX X XIIV

Ψ-GBA

Del 55 pb

I II III V VI VII VIII IX X XI

Alu(313 pb)

Alu(626pb)

Alu(320 b)

Alu(277pb)

IV

(1) www.tau.ac.il/~racheli/genedis/gaucher /gaucher.htmlAlfonso P. Tesis Doctoral

MissenseV15MG113ER120WM123T

Mutaciones en GBAencontradas en España

N396TV398I

D409HL444PR463C

H311RW312RY313HG325WL336P

SplicingIVS4-2a>gIVS5+1g>t

Deletionslarge deletionc.42-65del24

c.225-227delTACc.708delCc.953delT

M123TR131CT134PP182LN188S

G195WR257QP266LE326KG202R

N = 66

R463CR463HR496H

Stop mut .W(-4)XR47XR163XR257XR359X

L336PR359QS364NS364RN370SG377SD380NP391LV391IR395C

Other mutationsc.(-203)A>G

RecombinationsRec all gene

Great rec ex5-...10RecTL

RecNciI

c.953delTc.1214-1215delGCc.1263-1317del55c.1439-1445del7

c.1451-1452delACc.1510-1512delTCT

Insertionsc. 84insGc.500insT

Giraldo P et al Orphanet J Rare Dis. 2012 Mar 19;7

PacienteDNA

AnálisisGenético

Familiares

FEETEG

Solicitante

Diagrama de flujo para el diagnóstico genético

N370SL444PG377SD409Hdel55bp

AnálisisGenético

FEETEGRegistro

SiPCR larga 7,3 KbPCR anidadaSecuenciación Re-secuenciaciónNo

Biomarcadores para EG

• Fosfatasa ácida• Lisozima� ββββ-hexosaminidasa (A/B)• NeopterinaNeopterina• Adenosin desaminasa (ADA)• Enzima convertidora de angiotensina (ECA)• Quitotriosidasa• CCL18-PARK9

QUITOTRIOSIDASA

- Presente en plasma humano:

Determinación de actividad

Función: DesconocidaAntifúngico: Candida, Aspergillus ?Nematodos filiformes: Filarias

Sustrato artificial: 4-metilumbelliferil −β−β−β−β-D-N, N´, N”-

Determinación de actividad

Hollak C et al. J Clin Invest. 1994; 93: 1288–1292.

Actividad quitotriosidasa(nmol/mL.h)

Pacientes Gaucher Portadores No-portadores Niños

n=109 n=121 n=89 n=37n=109 n=121 n=89 n=3713.991 ± 12.647 71 ±55 45 ±39 37 ±25

300 veces

Giraldo P, et al. Haematologica 2001;86:977

¿Para qué sirve la quitotriosidasa ?

40.000Paciente # 5001

QT.nmol/ml.hr

10.000

Inicial 12 24 36 48

20.000

meses

Inicial 12 24 36 48 60

6.000

2.000Paciente # 716

72

Actividad quitotriosidasa en pacientes con EG vs genotipo

Gen quito. N actividad quito. (nmol/mL.h)

Nor / Nor 74 17.387 ± 12.800Nor / Nor 74 17.387 ± 12.800

Dup / Nor 41 11.870 ± 10.430*

Dup / Dup 3 0

*p < 0.01

INCONVENIENTE

Genotipo del gen QUITOTRIOSIDASA

E2E1 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E11 E12E10

375 pb399 pb

ChsPCR

+/+ +/- -/-

24 pb

Chas

24 pb

Chs

Chas

24 pb

Alelo mayor

Alelo menor ( nulo )

Biomarcador CCL18/PARC

948 ng/mL (rango 237-2285 ng/mL)

33 ng/mL (rango 10-72 ng/mL)

Boot RG et al. Blood 2004; 103:33-39

X 29

paciente 1

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

0 6 15 24 36

meses de tratamiento

CC

L18

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Act

ivid

ad d

e Q

T

CCL18

QT

paciente 3

800,00

1000,00

10000

12000

Act

ivid

ad d

e Q

T

Relación entre el descenso de los nivelesplasmáticos de CCL18 y actividad de QT

según nuestra experiencia

paciente 2

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

3 13 29 42 52 65 77

meses de tratamiento

CC

L18

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Act

ivid

ad d

e Q

T

CCL18

QT

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

0 39 51 60 72 83 99 105

meses de tratamiento

CC

L18

0

2000

4000

6000

8000

10000

Act

ivid

ad d

e Q

T

CCL18

QT

Resumen• Análisis enzimático de Glucocerebrosidasa

– Diagnóstico• Análisis genético Glucocerebrosidasa

– Estudio familiares (portadores / no portadores)– Consejo genético– Consejo genético– Pronóstico

• Biomarcadores: quitotriosidasa y/o CCL18/PARC– Valoración– Respuesta a tratamientos– Seguimiento

Posible caso(Sospecha)(Sospecha)(Hospital)

Lab (FEETEG)

Courier

Separaciónespecimenes

leucocitosDNA

FEETEGDiagnostico

**

leucocitosPlasma

ββββ-GlucocerOtras lisoso.

Biomarcadores:Activ Quitotrios,CCL18 y MIP1ββββ

Diagnostico genético:Glucocerebrosidasa mutaciones +Quitotriosidasa genotipoSMPD1, AGAL NPC1, NPC2 mutaciones

+

REGISTRO FEETEG

SOLICITANTE

*

Seguimiento depacientes

Muestra(sangre o plasma

(Hospital)

Courier

Laboratorio *(FEETEG)

Separaciónalicuotado*

Análisis

Plasma

Biomarcadores:quitotriosidasa

actividad yCCL18

REGISTRO FEETEG

SOLICITANTE

*

*

Tratamientos

Palmitoil-CoA + serina

UDP-glucosa

GangliósidosCeramida:glucosil-

transferasa

Formación y degradación de la glucosilceramida

Ceramida Glucosilceramida

(glucocerebrósido) Globósidos

Lactósidos

Ceramida + Glucosa

ββββ-Glucocerebrosidasa

Formación = Degradación

Síntesis + catabolismo Globosidos, Gangliósidos..

Formación

Condiciones normales: Equilibrio

No hay depósito de glucosilceramida

Degradación

GlucocerebrosidasaGLUCOSILCERAMIDA

(SUBSTRATO)

Enfermedad de Gaucher:Desequilibrio entre entrada y salida

Formación > Degradación(normal) (disminuida)

Síntesis + catabolismo Globosidos, Gangliósidos..

Formación

Degradación

GlucocerebrosidasaGLUCOSILCERAMIDA

(SUBSTRATO)

Se deposita glucosilceramida

OPCIONES TERAPÉUTICASTERAPÉUTICAS

Opciones terapéuticas : TES

Síntesis + catabolismo Globos., Gangli..

FormaciónImiglucerasa

Degradación

ImiglucerasaVelaglucerasaTaliglucerasa

TES

GlucocerebrosidasaGlucocerebrosidasa

GLUCOSILCERAMIDA(SUSTRATO)

1978Descubrimiento de los receptores de manosa 6-

fosfatoCélula

Lisosoma

ReceptorManosa-6-P

Enzima P

P

P

P

P

Lisosoma

Lisosoma

LisosomaEnzima

P

P

PP

P

P

1990

Barton, Brady, Grabonski inician los primeros

tratamientos con enzima betaglucosidasa obtenida de placenta

Alglucerasa. Ceredasa. Genzyme Corp

1996Se comercializa la primera

enzima recombinante en CHO

QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit

Strategene

Imiglucerase. Cerezyme. Genzyme-Sanofi

Glicoformas (decoración) típica que se producen en mamíferos

Asn Asn Asn Asn

Mannosidase I

Asn

ER

Asn

Golgi

Glucose

AsnAsn

N-acetylglucosamine Mannose Galactose Sialic acid Fucose

Asn

Enzymatic

degradation

Como se Como se consigueconsigue queque la la ImiglucerasaImiglucerasatengatenga la la glicosilaciónglicosilación adecuadaadecuada

((decoracióndecoración ))• Se permite que la síntesis en células CHO se comple te • Se realiza una digestión con neuraminidasa, beta-ga lactosidasa

y beta-N-acetilglucosaminidasa para eliminar los azu cares terminales.

• De esta forma se dejan expuestos - 3 restos de manosa .manosa .

Asn Asn Asn Asn

Mannosidase I

Asn

ER

Asn

Golgi

Glucose

AsnAsn

N-acetylglucosamine Mannose Galactose Sialic acid Fucose

Asn

Enzymatic

degradation

Exposed Mannose

Velaglucerasa VPRIV (Shire ). Recombinante expresada en células humanas

(comercializada marzo 2011)

Fibroblastos humanos

QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit

Strategene

La La glicosilaciónglicosilación ((decoracióndecoración ) ) adecuadaadecuadade la de la VelaglucerasaVelaglucerasa se se consigueconsigue con con

KifunensineKifunensine

• Se impide que la cadena de oligosacarido se modifiqueen el Golgi

•• ImpideImpide queque quedenqueden enmascaradasenmascaradas laslas manosasmanosas

Asn Asn Asn Asn

Mannosidase I

Asn

ER

Asn

Golgi

Glucose

AsnAsn

N-acetylglucosamine Mannose Galactose Sialic acid Fucose

Asn

Enzymatic

degradation

Exposed Mannose

Taliglucerase . Uplyso (Protalix )/(Pfizer). Producida en células de zanahoria

(Aprobada por FDA pero no por EMA)

Sintesis de laTaliglucerase

Endoquitinasabasicabasica

Arabidopsisthaliana

Quitinasa ATabaco

E F D L L V D T M

RE

Vacuola

Asn

nucleous

Distribución de N-Gliproteinasencélulas vegetales

RE

Golgi

Asn

Asn

Extracellularspace

Señales deReconocimiento

Glicosilación “Decoración” de lasEnzimas recombinantes

P

P

P

P

P

Enzima

N-acetil-glucosamina

Manosa

P

P

P

P

P

Tekoah Y et al Biosci Rep. 2013 Aug 28. [Epub ahead of print]

Captación de las enzimas recombiantes

Taliglucerasa

Imiglucerasa

Velaglucerasa

Tekoah Y et al Biosci Rep. 2013 Aug 28. [Epub ahead of print]

Opciones terapéuticas en la EG: Terapia Reducción Sustrato (TRS)

Síntesis + catabolismo Globos, Gangli..

Formación

NB-DNJ, miglustat(Zavesca ®)TRS

Ceramida:glucosiltransferasa

Degradación

Glucocerebrosidasa

GLUCOSILCERAMIDA(SUSTRATO)

Palmitoil-CoA + serina

UDP-glucosa

GangliósidosCeramida:glucosil-

transferasa

Ceramida Glucosilceramida

(glucocerebrósido) Globósidos

Lactósidos

Ceramida + Glucosa

ββββ-Glucocerebrosidasa

Miglustat(Iminoazucar)

ObtenidoObtenidode la corteza de la raízde la moreraMorus alba

Bacteria streptomyces

TRS

�N-butil-deoxynojirimicin MiglustatZavesca ®Actelion

�Genz-112638. Eliglustat (Pendiente aprobación) Genzyme -Sanofi

Similitud estructural Iminoazucares : Miglustat vs glucosilceramida

OH

OH

OHHO

OH

OHHO

Glucose Ceramida

Glucosylceramide

O

HN

OH

C13H27

O

C17H35

O

OH

Miglustat

NOH

CH3

Similitud estructural:Eliglustat vs Glucosilceramida

OH

OH

OHHO

Glucosa Ceramida

ß-Glu-Cer Glucosilceramida

O

HN

OH

C13H27

O

C17H35

O

OH

Eliglustat(pendiente aprobación)

1-(4´-Hydroxy)phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1-propanol

Otras opciones terapéuticas: ChaperonasChaperonas

5´3333´ mRNA

Lumen REProteina

ProteinaNormal

Chaperonasmoleculares

¿Qué misión tienen las chaperonas?

Proteinamutada

Chaperonessintéticas

Golgi Golgi

LisosomasPH = 5

Degradación

Como funcionan las chaperonas en las Enfermedades de Depósito Lisosomal

Chaperona

farmacológica

Proteína mal plegadaProteina-Chaperona Complejo

farmacológica

Reduce el estresCelular e inflamación

Reduce el sustratoacumulado

Sustrato acumulado

Reticuloendoplásmico

Aparato de

Golgi

Lisosoma

Facilita el tráfico

Opciones terapéuticas en EGRecuperar actividad de enzima mutada

del propio paciente

Síntesis + catabolismo Globos., Gangli..

FormaciónChaperonas

Degradación

FarmacológicasChaperonas

GlucocerebrosidasaGlucocerebrosidasa

GLUCOSILCERAMIDA(SUSTRATO)

Tratamientos aprobados o en desarrollo . • TES1,2

– Imiglucerasa (Cerezyme®)– Velaglucerasa (VPRIV™)– Taliglucerasa (FDA si, EMA no)

• TRS2-4

– Miglustat (Zavesca®)– Eliglustat/Genz-112638

(pendiente)

• Trasplante de médula ósea(TMO)7

– Solo Neuronopáticos– TMO en algunos casos ha

solucionado sintomas– No aconsejable en mayoría

casos

• Terapia génica 8(pendiente)

• Chaperonas o enzyme enhancement therapy 5,6

– Afegostat tartrate/AT2101 (Plicera™; desarrollointerrumpido)

1. The Pharma Letter Web site. Available at: http://www.thepharmaletter.com/file/96654/protalix-gets-temporary-approval-for-gaucher-drug-taliglucerase-in-france.html. 2. Sidransky E. Gaucher disease. Medscape Web site. Available at: http://emedicine.medscape.com/article/944157-print. 3. The Medical News Web site. Available at: http://www.news-medical.net/news/20100212/Genzyme-announces-2-year-data-from-eliglustat-tartrate-Phase-2-trial-for-Gaucher-disease.aspx. 4. Actelion Web site. http://www1.actelion.com/en/scientists/development-pipeline/phase-4/miglustat-zavesca.page. 5. Cigna Web site. Available at: http://www.cigna.com/customer_care/healthcare_professional/coverage_positions/pharmacy/ph_1011_coveragepositioncriteria _zavesca.pdf. 6. Reuters Web site. Available at: http://www.reuters.com/article/idUKN0250346520091002. 7. Pastores GM et al. In: Pagon RA et al. GeneReviews [Internet]. 1993-2000. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=gene&part=gaucher. 8. Grabowski GA. Lancet. 2008;372:1263-1271.

•– Investigación