Post on 15-Oct-2020
Ensayos de restricción
Vector recombinante(Vector + inserto)
Vector
Enzimas de restricción
Son endonucleasas que reconocen
secuencias palíndromicas de 4-6 pb. El
nombre lo reciben por su función natural
en las bacterias: la defensa contra virus,
donde el corte de estas enzimas
“restringe” al DNA invasor.
Enzimas de restricción
Las enzimas de restricción se nombran de acuerdo al nombre del microorganismo del
que se aisló originalmente.
Son muy sensibles a los cambios de temperatura y deben mantenerse en hielo en todo
momento.
EcoRI
BamHI
HindIII
SacI
XhoI
MluI
Xantomonas holcicola
Escherichia coli
Micrococcus luteus
Bacillus amyloliquefaciens
Streptomyces achromogenes
Haemophilus influenzae
Sitios de reconocimiento
Las enzimas de restricción tipo II reconocen secuencias palíndromas específicas en el DNA y lo
escinden generando diferentes tipos de “extremos”.
LARUTANATURAL
Extremos romos o cohesivos
Extremos romos
(“blunt ends”)
Extremos cohesivos
(“sticky ends”)
Extremos cohesivos
(“sticky ends”)
Mapa de restricción
La representación de una molécula de
DNA donde se muestran los sitios
específicos para ciertas enzimas de
restricción se denomina mapa de
restricción.
Utilidad de los ensayos de restricción
Clonación
Pruebas clínicas
37 °C /
1.5 h
+ 1 uL de
BamH1
+ 0.5 uL de
RNasa
En la práctica1 uL de
Amortiguador
Tango 10X Plásmido
(10 uL)
1
2
100 °C/
5 minHielo /
5 min
1
2
+ 1 uL de
BamH1
+ 0.5 uL de
RNasa
+ 1 uL de
Nde1
Mantener
en hielo
Electroforesis
La electroforesis es un método de separación
de mezclas de moléculas biológicas que se
basa en la aplicación de un voltaje para que
las moléculas migren sobre una matriz
porosa.
Las moléculas con un menor peso molecular
migrarán más rápido.
En el caso del DNA y el RNA, la matriz
utilizada normalmente es agarosa en
concentraciones que van de 0.7 a 2 % (m/V).
Fundamento de la electroforesis de ácidos nucleicos
Las cargas de los fosfatos de los ácidos nucleicos, al encontrarse en una solución
alcalina, poseen una carga negativa lo que permitirá que migren hacia el electrodo con
carga positiva, el ánodo.
¡Migran siempre hacia el ánodo!
Matriz: Agarosa
Es un polímero obtenido de algas, forma una red
que permite el paso de moléculas pequeñas de
manera más rápida por sus poros. Mientras que las
moléculas de DNA más grandes son retenidas por
más tiempo.
Amortiguador de muestra
La muestra debe ser mezclada con un amortiguador de muestra que
le permitirá caer al fondo del pozo del gel y mantenerse ahí hasta que
se suministre la corriente, normalmente los componentes de éste
amortiguador son glicerol (para que la muestra alcance el fondo del
pozo) y una mezcla de colorantes para visualizar el progreso del
corrimiento electroforético.
Bromuro de etidio
Es un agente intercalante de DNA que nos permite
visualizar al DNA en los geles de agarosa,
simplemente al exponerlo a luz UV.
Es un compuesto mutágeno, por lo que debe ser
manipulado con equipo de protección.
Actualmente existen otros productos de menor
toxicidad que permiten visualizar las bandas en el
gel de agarosa como Gel Red® y Midori Green.
Preparación de un gel de agarosa
0.35 g de agarosa + 35 mL de TAE 1X
Ebullición
Se deja enfriar un poco y se añaden 2 uLde Bromuro de etidio
Se vierte en su molde y se colocan
los peines
Se deja enfriar hasta que polimerizecompletamente
Siempre usarguantes
El gel se coloca enla cámara deelectroforesis y seañade buffer TAE1X hasta que locubracompletamente
Se cargan lasmuestras en los pozosde acuerdo a la tabla.
Se aplica un voltajede 80-100 V por 45minutos
Se observa eneltransiluminador
Y se analizan
losresultados
En la práctica
NdeI
BamHI
MW – Marcador de peso molecular1 – Plásmido
2 – Plásmido + BamH13 – Plásmido + NdeI
4 – Plásmido + BamH1 + NdeI
Topoisómeros
Los topoisómeros son moléculas de DNA idénticas en su secuencia pero diferentes en su
topología, éste fenómeno afecta su avance en el corrimiento electroforético, siendo las de mayor
enrollamiento las que ocupan un menor volumen y por tanto migran una mayor distancia en el gel.
Lineal LinealLineal
Relajado
Superenrollado
Circular,
monocatenario