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Evaluación de la actividad antibacteriana de cuatro extractos etanólicos de briófitos y de
jugos de diez frutas de interés comercial en Colombia contra cuatro bacterias patógenas
JUANITA CAROLINA RODRÍGUEZ RODRÍGUEZ
Grupo de Investigación en Fitoquímica (GIFUJ)
Grupo de Terapia Celular y molecular
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al título de
BIÓLOGA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGIA
Bogotá D.C.
Diciembre 21 de 2011
Evaluación de la actividad antibacteriana de cuatro extractos etanólicos de briófitos y de
jugos de diez frutas de interés comercial en Colombia contra cuatro bacterias patógenas
JUANITA CAROLINA RODRÍGUEZ RODRÍGUEZ
APROBADO
INGRID SCHULLER Ph. D. ANDREA FORERO
DECANA ACADEMICA DIRECTORA DE CARRERA
Evaluación de la actividad antibacteriana de cuatro extractos etanólicos de briófitos y de
jugos de diez frutas de interés comercial en Colombia contra cuatro bacterias patógenas
JUANITA CAROLINA RODRÍGUEZ RODRÍGUEZ
APROBADO
LUIS GONZALO SEQUEDA MSc. ALBA NOEMÍ TÉLLEZ Ph. D.
DIRECTOR JURADO
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y
porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea
en ella el anhelo de buscar la verdad y la justicia.”
Artículo 23 de la Resuloción No. 13 de Julio de 1846
TABLA DE CONTENIDO
1. RESUMEN 1
2. INTRODUCCIÓN 2
3. PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN 3
4. JUSTIFICACIÓN 4
5. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 5
6. OBJETIVOS 6
6.1. General 6
6.2. Específicos 6
7. MARCO TEÓRICO 6
7.1. Marco conceptual 6
7.1.1. Interacción Patógeno-Hospedero 6
7.1.2. Fitoquímica 7
7.1.3. Especies Vegetales 7
7.1.3.1. Briófitos 8
7.1.3.2. Angiospermas 9
7.2 Antecedentes de las especies evaluadas 11
7.2.1. Microorganismos patógenos 11
7.2.2. Briófitos 12
7.2.3. Angiospermas 15
8. MATERIALES Y MÉTODOS 16
8.1 Obtención y preparación de muestras y extractos 16
8.1.2. Briófitos 16
8.1.3. Frutas 17
8.2. Evaluación antibacteriana 18
8.2.1. Preparación de materiales y cepas 18
8.2.2. Bioensayo 19
8.2.3. Identificación preliminar de metabolitos secundarios 20
9. RESULTADOS 21
9.1. Especies evaluadas 21
9.2. Bioensayo 21
9.3 Pruebas Químicas Preliminares 25
10. DISCUSIÓN 26
10.1. Briófitos 26
10.2. Frutas 32
10.3. Aspectos generales en discusión 33
11. CONCLUSIONES 36
12. RECOMENDACIONES Y PERSPECTIVAS FUTURAS 37
13. AGRADECIMIENTOS 38
14. BIBLIOGRAFÍA 39
15. ANEXOS 47
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
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Evaluación de la actividad antibacteriana de cuatro extractos etanólicos de briófitos y de
jugos de diez frutas de interés comercial en Colombia contra cuatro bacterias patógenas
1. RESUMEN
Plantas, humanos y otros animales están constantemente expuestos a variedad de
microorganismos patógenos que traspasan los mecanismos de defensa causando enfermedades
graves en todo el mundo. Varios antibióticos o productos sintéticos contra patógenos pueden
tener efectos secundarios negativos en los organismos y en el medio ambiente y por esto es de
gran importancia buscar mejores alternativas, como el desarrollo de productos naturales
provenientes de plantas. Este estudio evaluó la actividad antibacteriana (Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus, Pseudomonas auriginosa y Escherichia coli) de los jugos puros filtrados
de frutas comerciales, que son plantas vasculares ya utilizadas como alimento (piña, mora
silvestre, arándano, pera rosada, ají dulce, corozo, carambolo, níspero, uva Isabela y agraz), y de
extractos etanólicos de briófitos, dos musgos (Sphagnum sp. y Hypnum sp.) y dos hepáticas
(Metzgeria sp. y Trichocolea sp.), a concentraciones de 1, 10 y 100 mg/ml), que son plantas no
vasculares casi inexploradas en el país y con gran potencial económico; todas las muestras están
en proceso de clasificación taxonómica por el Herbario de la Pontificia Universidad Javeriana.
Comparando con los antibióticos ampicilina y clindamicina por el método de difusión en agar
(50μl por pozo), los resultados indican que los jugos de frutos rojos (mora silvestre, arándano,
uva Isabella y agraz) presentaron actividad contra todas las bacterias evaluadas, a excepción del
arándano que solo fue activo para S. aureus y destacándose cualitativamente la actividad del jugo
de mora silvestre. Todos los extractos etanólicos de briófitos presentaron actividad contra todas
las bacterias evaluadas en al menos una concentración (10 y/o 100 mg/ml). Este estudio es el
primer reporte de actividad antibacteriana de briófitos de Colombia, comprueba la actividad
antibacteriana de frutas comúnmente consumidas en el país y muestra su potencial como fuente
de compuestos antibacteriales, abriendo las puertas al uso de la flora colombiana para el futuro
desarrollo de productos con fines terapéuticos contra bacterias patógenas.
PALABRAS CLAVE
Frutas colombianas, musgos, hepáticas, microorganismos, antibacterial, metabolitos secundarios.
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
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2. INTRODUCCIÓN
La interacción entre patógenos y los organismos que coloniza (hospederos) es un juego de
fuerzas de acción-reacción en la que ambos se atacan entre sí, tratando de causar el máximo daño
posible y al mismo tiempo reaccionan con diferentes mecanismos de defensa para evitar verse
perjudicados gravemente en dicha interacción. El éxito de los patógenos radica en sus grandes
ventajas evolutivas (alto recambio generacional, adquisición de genes de resistencia y presión
selectiva) (Trenover 2006) que les permite crear resistencias a los antibióticos, causando fuertes
efectos negativos en su salud de los hospederos (plantas, animales y seres humanos). Por esta
razón es importante desarrollar alternativas de defensa, nuevos productos que combatan
patógenos, no causen efectos secundarios en la salud de los hospederos ni contaminación en el
medio ambiente, y se constituyan como productos naturales con más de un beneficio para los
consumidores, especialmente en la prevención de enfermedades. Esta valiosa alternativa busca la
acción sinérgica y el balance natural de los compuestos para que actúe en defensa contra el
ataque de microorganismos patógenos, afectando su crecimiento y evitando su propagación.
Colombia posee gran diversidad de especies vegetales que contienen una amplia variedad de
moléculas con potencial acción biológica (Pérez 1996). Las frutas, plantas ya comercializadas,
han sido ampliamente estudiadas obteniendo actividad para bacterias y hongos, así como
antioxidantes, sobre células tumorales, entre otros (Paupponen-Pimiä et al. 2005a; Arabshahi-
Delouee & Urooj 2007; Ayachi et al. 2009). Colombia presenta diferentes especies y
cultivariedades, que están expuestas a condiciones ambientales especiales y a gran variedad de
patógenos, lo cual les ha conferido ciertas adaptaciones y resistencias; ofreciendo un potencial de
actividad biológica. Así mismo, dentro de la variedad de flora se encuentra el segundo grupo más
grande de plantas (después de las angiospermas) que son los briófitos. Los briófitos están
compuestos por tres categorías, los musgos, hepáticas y antoceros; son plantas ancestrales, no
vasculares con reproducción sexual por esporas, que han logrado colonizar todos los ambientes,
desde bosques húmedos, selvas tropicales y páramos (donde proliferan en mayor medida) hasta
desiertos y zonas árticas. Los briófitos han sido estudiados en la fitoquímica comprobando su
actividad biológica como antimicrobianos, antioxidantes, antitumorales, antidotales, antipiréticos,
diuréticos y antisépticos, para el tratamiento de quemaduras y heridas, entre otras (Asakawa
2007, 2008), que están ligadas a los sistemas de defensa desarrollados a lo largo de millones de
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
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años de evolución y selección natural. Los briófitos presentan características especiales como la
ausencia de sistemas vasculares y cutícula (que protegería ante ataques patógenos), gran
capacidad de absorción, descomposición reducida, textura esponjosa (permite la aireación y
desarrollo de raíces de otras plantas), tolerancias a la desecación y al congelamiento y exhiben
variedad de compuestos químicos (terpenoides, flavonoides, bibenzilos, benzenoides,
fenipropanoides, derivados de ácidos grasos y compuestos con S y N) que evitan el ataque de
fitopatógenos e insectos (Goffinet & Shaw 2009; Vanderpoorten & Goffinet 2009; Xie & Lou
2009).
Teniendo en cuenta estos dos grupos de plantas (angiospermas y briófitos), éste estudio evaluó la
actividad antibacteriana de los jugos procesados de diez frutas (piña, mora silvestre, arándano,
pera rosada, ají dulce, corozo, carambolo, níspero, uva y agraz) y cuatro extractos etanólicos de
especies de briófitos, dos musgos (Sphangum sp. y Hypnum sp.) y dos hepáticas (Trichocolea sp.
y Metzgeria sp.) sobre cuatro bacterias indicadoras de actividad biológica (Bacillus sutilis,
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli) generando un
conocimiento base para la bioprospección de este grupo de plantas.
3. PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
Existe una amplia variedad de especies de microorganismos patógenos para las personas,
animales y plantas que tienen fuertes repercusiones en la salud y el bienestar de los individuos
afectados, causando la muerte de millones de personas en el mundo y afectando la economía de
sectores agroindustriales, aumentando costos, y reduciendo su producción y calidad (Billing
1987; Merrell1 & Falkow 2004). Se han desarrollado numerosos productos químicos sintéticos
(antibióticos y plaguicidas) para el control de microorganismos patógenos, pero éstos pueden
tener efectos negativos en la salud de los individuos (por su uso o exposición) y en el medio
ambiente; así mismo los microorganismos, por su rápido y constante ciclo de vida, tienen gran
capacidad de adaptación a las condiciones ambientales y sustancias nocivas (antibióticos) y por
ello en poco tiempo desarrollan resistencias a los productos comúnmente utilizados, ocasionando
dificultades en el control y exterminación de plagas, aumentando el número de enfermedades
patógenas difíciles de tratar (Haeker 2002; Rawani et al. 2011).
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
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Consecuentemente, es importante el desarrollo de nuevos productos que controlen o inhiban el
crecimiento de los microorganismos (Tenover 2006). Los productos 100% naturales
desarrollados a partir de especies de plantas, son una buena alternativa para el control de
patógenos dado que son amigables con el medio ambiente, no tienen efectos secundarios sobre la
salud de las personas y presentan una mayor gama de compuestos que actúan balanceada y
sinérgicamente como sucede normalmente en la naturaleza (Liu 2004). Por lo tanto, es necesario
realizar estudios de la actividad biológica de especies de plantas con potencial actividad
antimicrobiana, explorando dentro de la amplia gama de posibilidades que brinda la diversidad de
especies vegetales de Colombia.
4. JUSTIFICACIÓN
Diversas enfermedades infecciosas causan la muerte de las personas así como de otros seres
vivos y a pesar de desarrollar productos que combatan éstos patógenos, se crean variedades
resistentes a los fármacos utilizados volviéndose menos susceptibles a ellos, ocasionando
dificultades en su control y exterminación y aumentando el número de enfermedades patógenas
difíciles de tratar (Haeker 2002). La Organización Mundial de la Salud (OMS) reconoce la
importancia que tiene la medicina tradicional a partir de plantas, así como el uso y aplicación de
tecnologías para la búsqueda de productos naturales que contribuyan a la lucha contra
enfermedades infecciosas (Shrikumar & Ravi 2007) y en este aspecto, los estudios fitoquímicos
pueden revelar especies de plantas con potencial actividad antimicrobiana. Consecuentemente, el
desarrollo de productos naturales a partir de la gran biodiversidad colombiana brinda un
sinnúmero de posibilidades para el hallazgo y desarrollo de nuevos compuestos y productos
bioactivos.
Los productos naturales presentan ventajas frente a compuestos sintéticos dado que no contienen
ingredientes sintéticos que pueden afectar el organismo, pueden actuar en el organismo de forma
preventiva y/o curativa para más de una afección; así mismo pueden ser productidos de manera
sostenible mediante el desarrollo de técnicas biotecnológicas, disminuyen los procesos de
contaminación por la utilización pesticidas artificiales que afectan negativamente el medio
ambiente, y sus compuestos químicos o metabolitos secundarios presentan la actividad sinérgica
natural, es decir, actúan en conjunto como realmente sucede en la naturaleza y se encuentran en
la combinación balanceada para tener efectos en los patógenos sin causar daño al organismo (Liu
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
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2004; Serrano et al. 2006; Walton & Brown 1999); por esto, la evaluación de las fracciones
totales y jugos puros de las especies, puede representar de mejor manera su potencial de
actividad, realizándose en menor tiempo y de manera más sencilla.
Fitoquímicamente en nuestro planeta solo se ha estudiado una pequeña porción de la flora y otros
pocos han sido estudiados en su actividad biológica; así mismo, una sola planta puede presentar
miles de metabolitos secundarios diferentes que pueden ser de gran importancia para el desarrollo
de productos naturales que combatan muchas enfermedades en el mundo (Hostettmann et al.
2008) y, teniendo en cuenta que Colombia es un país megadiverso en especies de plantas, tanto
vasculares como no vasculares, se exhibe una amplia gama de estructuras y sustancias novedosas
que se constituyen como un gran potencial a estudiar, en especial porque el país presenta
condiciones ambientales diferentes y cambiantes en las diferentes regiones, lo cual puede
significar una mayor variedad de compuestos con potencial actividad biológica; por consiguiente,
es importante evaluar las especies vegetales del país en cuanto a su composición química y
actividad biológica (Hostettmann et al. 2008).
De esta manera, entre toda la riqueza de especies vegetales, encontramos especies de interés
económico como las frutas que son ya utilizadas como productos alimenticios, así como
presentamos a los briofitos (musgos y hepáticas) que es un grupo de plantas no vasculares
prácticamente inexploradas a nivel fitoquímico en el país y que presentan gran potencial
económico y aplicación en diversos usos industriales como en farmacología y medicina (Glime
2007). Por ello, éste trabajo busca evaluar la actividad antibacteriana de especies de frutas y
briófitos sobre microorganismos patógenos e indicadores de actividad biológica para un futuro
desarrollo de productos naturales que combatan la acción de los patógenos y evite o disminuya el
efecto que tienen en la salud de los individuos afectados.
5. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN
¿Cuál es la actividad antibacteriana de los extractos etanólicos de cuatro especies de briófitos y
de los jugos de diez frutas?
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
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6. OBJETIVOS
6.1. GENERAL
Evaluar la actividad antibacteriana de cuatro extractos etanólicos de briófitos (musgos y
hepáticas) y de diez jugos de frutas comerciales contra cuatro bacterias patógenas.
6.2. ESPECÍFICOS
- Evaluar la actividad antibacterial de los extractos etanólicos de dos musgos (Sphagnum sp. y
Hypnum sp.) y dos hepáticas (Metzgeria sp. y Trichocolea sp.) sobre el crecimiento de
B.subtilis, S. aureus, P. aeruginosa y E. coli.
- Evaluar la actividad antibacterial de los jugos de diez frutas (piña, mora silvestre, arándano,
pera rosada, ají, corozo, carambolo, níspero, agraz y uva) de interés comercial sobre el
crecimiento de B.subtilis, S. aureus, P. aeruginosa y E. coli.
- Identificar preliminarmente las familias de metabolitos secundarios presentes en las
sustancias o extractos con actividad antibacteriana.
7. MARCO TEÓRICO
7.1. Marco conceptual
7.1.1. Interacción Patógeno-Hospedero
Los organismos están expuestos a factores abióticos (i.e. luz, temperatura, humedad) que generan
condiciones de estrés y a factores bióticos como microorganismos patógenos (bacterias, hongos,
virus) que ocasionan enfermedades infecciosas a plantas, animales y seres humanos (hospederos)
(Martínez et al. 2000). Las enfermedades infecciosas en las plantas causan alteraciones en su
desarrollo normal dado que afectan sus funciones vitales, generando necrosis, atrofiamientos,
malformaciones y otras afecciones que pueden dar lugar a la muerte de toda la planta (Martínez
et al. 2000). Así mismo, los animales y seres humanos pueden verse gravemente afectados por
enfermedades dadas por microorganismos, afectando la función normal de los tejidos, órganos o
en general del organismo al que ataque, causando la muerte de muchas personas en el mundo
(Botero & Resterpo 2003; Mandell et al. 2006). Patógenos y hospederos están en constante
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interacción, en un juego de acción-reacción donde cada uno busca su propio beneficio,
manteniendo y creando nuevas estrategias para defenderse y atacar al oponente.
La interacción comienza con el ataque del patógeno al hospedero (de manera sutil causando
enfermedades crónicas, o de forma agresiva y frontal usando toxinas o proteínas efectoras)
(Merrell & Faikow 2004). Los microorganismos poseen estrategias para disminuir o suprimir los
mecanismos de defensa de los hospederos (factores de virulencia, adhesinas en la superficie de
las células, secreción de toxinas) logrando parasitarlo (Abramovitch & Martin 2004; Peschel
2002). Por su parte, los hospederos se defienden por medio de su sistema inmune innato y
adaptativo y, por la acción de factores de reconocimiento de cuerpos extraños potencialmente
dañinos (i.e. proteínas de unión, péptidos, defensinas, células T) (Hoffmann et al. 1999), así
como complementando la defensa con la acción de antibióticos o productos químicos sintéticos,
que pueden ser incluso perjudiciales para sí mismos (Liu 2004).
Los patógenos reaccionan ante este ataque gracias a sus grandes ventajas evolutivas (alto
recambio generacional, adquisición de genes de resistencia y presión selectiva) (Trenover 2006),
evitando la respuesta inmune de los hospederos (i.e. por inducción o inhibición de la apoptosis o
citotoxicidad, inhibición de la producción de citoquininas o su sobreproducción, evasión de
anticuerpos, inhibición de la preservación del antígeno o de la fagocitosis) (Merrell & Faikow
2004) y creando resistencias a los antibióticos, ya sea con factores anatómicos como la formación
de biopelículas (Stewart & Costerton 2001) o por mecanismos bioquímicos (inactivación
enzimática del agente animicrobiano, modificación de su sitio de unión reduciendo su afinidad o
alteración de la permeabilidad de las barreras y canales de proteínas de la célula) (Tenover 2006;
Chanda et al 2010), volviendo a atacar a los hospederos y llegando a causar fuertes efectos
negativos en su salud.
Por esto, los seres humanos requieren desarrollar nuevos productos que combatan patógenos; la
exploración de nuevos compuestos de origen vegetal puede contribuir al desarrollo de productos
naturales, de manera que no presenten efectos secundarios perjudiciales para los organismos y sí
inhiban el crecimiento y desarrollo de microorganismos patógenos. Así mismo, pueden
desarrollarse a partir de los diferentes órganos y estructuras de las plantas (hojas, tallos, frutos y
semillas), productos como alimentos funcionales brindando propiedades curativas de
enfermedades infecciosas, ofreciendo un valor nutricional y proporcionando otro tipo de efectos
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
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en el cuerpo como antioxidantes o anticancerígenos, actuando benéficamente y potencializándose
en los organismos que las consumen (Serrano et al. 2006).
7.1.2. Fitoquímica
Para el desarrollo de productos con actividad biológica, la fitoquímica es el área encargada de
estudiar los metabolitos secundarios (MS) extraídos de plantas. Los MS son compuestos
químicos producto del metabolismo secundario de las plantas que varía entre categorías
taxonómicas brindado singularidad a cada especie y, aunque no tienen una función esencial en la
planta, están relacionados con aspectos como sistemas de defensa y reproducción de las especies
(Asakawa 2007; Sanabria 1983).
Los estudios en fitoquímica son extensos dado que es un proceso compuesto por varios pasos
(extracción, fraccionamiento, identificación, dilucidación molecular de los compuestos activos,
pruebas biológicas, clínicas y de toxicidad) que permiten obtener un producto desarrollado y
certificado para la actividad estudiada. Por ello es importante realizar pruebas preliminares y un
screening de varias especies, de manera que este tipo de estudios sirvan como base para la
selección de las especies más prometedoras y dilucidar su potencial de actividad y desarrollarla
posteriormente hasta finalmente ofrecer un producto certificado, habiendo comprobado
científicamente su actividad y realizando ensayos clínicos que permitan tener la certeza de la
confiabilidad, rendimiento y eficacia del producto.
7.1.3. Especies vegetales
La diversidad de especies vegetales en el mundo ofrece una amplia gama de compuestos con
actividad biológica a partir de los cuales se pueden generar productos naturales de uso terapéutico
contra enfermedades. Dichos compuestos son producto de millones de años de selección natural y
por ello naturalmente están perfectamente balanceados de manera que ha resultado ser la
combinación más exitosa evolutivamente, utilizada contra el estrés abiótico y biótico (como
sistema de defensa contra patógenos), así como pueden presentar una acción sinérgica en la que
participan varios compuestos en conjunto, en una o varias actividades (Liu 2004; Xie & Lou
2009).
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
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Entre la diversidad de plantas en el mundo, se encuentran los dos grupos más grandes: las
angiospermas (25.000 a 35.000 especies) (Craine et al. 2000; Stevens 2001) y los briófitos (de
14000 a 15000 especies) que se clasifican musgos (8000 especies), hepáticas (6000 especies) y
antoceros (200-300 especies) (Hallingbäck & Hodgetts 2000; Asakawa 2011). Las angiospermas
son plantas vasculares, con flores y frutos, utilizadas comúnmente como alimenticias y
extensamente conocidas en todo el mundo, encontrando gran diversidad de especies en los
trópicos (Pérez 1996). Los briófitos, son plantas no vasculares, poseen esporas como forma de
reproducción sexual y son escasamente conocidas en pocos países respecto a su potencial de unos
económicos. Se observa frecuentemente que animales, insectos y microorganismos patógenos
como las bacterias afectan más a ciertos grupos de angiospermas que a los briófitos quienes rara
vez presentan este tipo de afecciones (Chun & Hong 2009; Sabovljević et al. 2011; Asakawa
2007), a pesar de no poseer barreras anatómicas de defensa como cutícula o espinas (presentes en
angiospermas) (Hallingbäck & Hodgetts 2000; Schaefer & Zrÿd 2001). Por esto se piensa que los
briófitos a lo largo de su evolución han alcanzado un metabolismo químico complejo especial
como fuerte sistema de defensa ante patógenos (Xie & Lou 2009).
7.1.3.1. Briófitos
Los briófitos son un grupo ancestral y cosmopolita (habitan desde zonas boscosas y húmedas,
hasta desiertos y zonas árticas) (Hallingbäck & Hodgetts 2000; Schaefer & Zrÿd 2001), de gran
importancia a nivel ecológico dado que cumplen roles fundamentales en los ecosistemas como
por ejemplo en la regulación del ciclo hídrico, del carbono y de los nutrientes, generan
microclimas, evitan procesos de erosión, participan en la renovación del dosel y en la sucesión,
son sustrato de epífitas y variedad de organismos y son bioindicadoras del estado del medio
ambiente y contaminación (Cornelissen et al. 2007; Goffinet & Shaw 2009; Vanderpoorten &
Goffinet 2009).
Así mismo, los briófitos presentan características especiales como gran capacidad de absorción
(especies que absorben hasta tres veces su peso en agua), descomposición reducida, textura
esponjosa (permite la aireación y desarrollo de raíces de otras plantas), tolerancias a la desecación
y al congelamiento y exhiben variedad de compuestos químicos (terpenoides, flavonoides,
bibenzilos, benzenoides, fenipropanoides, derivados de ácidos grasos y compuestos con S y N)
que evitan el ataque de fitopatógenos e insectos (Goffinet & Shaw 2009; Vanderpoorten &
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Goffinet 2009; Xie and Lou 2009). Existen diferencias de compuestos entre grupos de briófitos;
por ejemplo, los musgos presentan mono y biflavonoides (Veljić et al. 2009) mientras que las
hepáticas presentan principalmente aceites o cuerpos aceitosos como mono, sesqui y
diterpenoirdes lipofílicos, compuestos aromáticos (bibenziles, bis-bibenziles, benzoatos,
cinamatos, fenoles de cadena larga, naftalenos, fatalidos e isocumaricas) y acetogeninas,
responsables de diferentes actividades biológicas y propiedades medicinales (Douglas 2010; Zhu
et al. 2006; Asakawa 2007), todos ellos relacionados con actividades biológicas.
7.1.3.2. Angiospermas
Las angiospermas o plantas vasculares presentan estructuras especiales para la reproducción
sexual como flores y frutos con semillas al interior que generan nuevos organismos al encontrar
las condiciones adecuadas para germinar. Las plantas contienen metabolitos secundarios que
varían en composición y cantidad en los diferentes órganos de la planta (Martínez et al. 2000) y
así mismo presentan diferentes compuestos de interés alimenticio como vitaminas, minerales y
fibras necesarias e importantes en la nutrición, que en conjunto brindan efectos benéficos para los
organismos que las consumen; y por esto la FAO recomienda altas dosis de frutas en la dieta
diaria de las personas, participando en la prevención de enfermedades del corazón, diabetes o
cáncer (Matthews 2006). Por su parte, una de las formas de consumir las frutas es en jugos los
cuales presentan vitaminas, minerales y otros componentes nutritivos; la forma de preparación de
los jugos es a partir de plantas frescas y se procesan triturando el fruto y filtrándolo con una tela o
lienzo (Fonnegra & Jiménez 2006) y de esta manera es posible obtener la totalidad de los
nutrientes presentes en las diferentes frutas.
Entre las diferentes frutas evaluadas se encuentran las bayas (mora, arándano, uva y agraz), las
cuales presentan coloraciones de rojos a violetas, morados y azules oscuros, dados por las
antocianinas (glicósidos de antocianinas), que son el grupo de flavonoides más predominante en
las bayas y tienen la función de absorber en gran medida la luz visible protegiendo al interior del
fruto de radiaciones lumínicas fuertes y evitar su oxidación; a demás de las antocianinas, las
bayas presentan flavonoles, que al ser producto del estímulo lumínico, se acumulan comúnmente
en las superficies externas como la piel (Puupponen-Pimiä et al. 2005b) y por ello varios estudios
muestran que las pieles de bayas poseen alta actividad antimicrobiana (Burdulis et al. 2009;
Puupponen-Pimiä et al. 2005a).
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
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Otros compuestos típicamente presentes en las bayas y que están relacionados con la defensa
contra patógenos en la naturaleza son algunos como el complejo de polímeros fenólicos, ácidos
fenólicos, taninos (como las proantocianinas que confieren su sabor amargo) u otros polímeros de
fenoles como los elagitaninos, que pueden actuar como nuevos tipos de antimicrobianos sobre un
amplio rango de microorganismos y superar las resistencias que presenten (Puupponen-Pimiä et
al. 2001, 2005a, 2005b; Nohynek et al. 2006). De esta manera, conociendo la gran variedad de
compuestos químicos presentes en las bayas, los efectos inhibitorios de estas frutas pueden ser
producto de un efecto sinérgico de varios compuestos, en especial del grupo de fenoles, ya sean
solos o combinados con otros compuestos activos (Puupponen-Pimiä et al. 2001) y por ello, la
evaluación de la actividad de jugos evidencia una fuerte actividad con un método más sencillo y
de bajo costo, que puede tener aplicaciones más directas y asequibles para las personas.
7.2. Antecedentes
7.2.1. Microorganismos patógenos
El efecto del los microorganismos patógenos sobre las personas es una problemática importante
dado que afecta su salud produciendo diversas enfermedades infecciosas, así como afecta
fuertemente la economía porque ocasiona pérdidas significativas en cultivos de plantas utilizadas
para el consumo, que deben estar en óptimas condiciones para su comercialización.
No obstante, una parte de los microorganismos son inofensivos e incluso pueden presentar
relaciones benéficas con sus hospederos (i.e. flora intestinal) mientras que en la otra parte de
existe gran variedad de microorganismos que y que al tener la capacidad de dispersarse en el
medio ambiente alcanzan a colonizar los organismos, generando enfermedades epidémicas
(Collins & Lyne 2006) y por ello, el desarrollo de productos contra enfermedades infecciosas es
de gran importancia y son requeridos compuestos con amplio rango de acción sobre la variedad
de microorganismos.
En la naturaleza se encuentran gran cantidad de compuestos químicos generados por el
metabolismo secundario de las plantas, que están relacionados con la defensa ante dichos
patógenos; por ello las plantas brindan potenciales actividades antimicrobianas que pueden
utilizarse para el desarrollo de productos que contribuyan a contrarestar la acción de los
patógenos o a eliminarlos evitando su establecimiento y efectos negativos en los hospederos. Para
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
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encontrar especies promisorias para estos fines, la bioprospección de plantas es de gran
importancia y permite seleccionar especies con potencial de actividad.
Teniendo en cuenta que la bioprospección de las plantas y el estudio fitoquímico completo de los
MS y de actividades biológicas, pueden significar años de arduo trabajo para obtener un producto
desarrollado y certificado para la actividad estudiada mediante su uso sostenible, es importante
seleccionar muy bien las especies de interés realizando pruebas preliminares que permitan
obtener una aproximación al conocimiento de la especie, brindando los argumentos necesarios
para estudiarla y comenzar todo un proceso investigativo sobre ella. Así mismo, en el caso
particular de los briófitos, estudiando y dando a conocer el potencial de aplicación y utilidad
económica de musgos y hepáticas, se fortalece su importancia ya no solo ecológica sino también
económica, confiriéndoles mayor interés en planes de conservación de las especies y en
investigación para su exploración biotecnológica para el desarrollo de técnicas de propagación ex
situ y para uso sostenible.
7.2.2. Briófitos
Basándose en la observación de la naturaleza y de los eventos que ocurren en ella, se puede
obtener información clave para el planteamiento de hipótesis y selección de especies a evaluar.
Observaciones constantes en campo muestran que los briófitos rara vez son atacados por
microorganismos patógenos a pesar de que anatómicamente carecen de cutícula (estructura que
protege a las plantas vasculares contra la acción de agentes externos), así como tampoco son
afectados por insectos, caracoles, babosas y otros animales pequeños (Sabovljević et al. 2011;
Asakawa 2007). A partir de esto podría pensarse que los briófitos poseen otros sistemas de
defensa como un metabolismo químico complejo con sustancias tóxicas y metabolitos
secundarios que les permite evitar el ataque de patógenos y animales pequeños (Xie & Lou
2009).
Efectivamente, estudios demuestran que los musgos y hepáticas son una fuente rica de
metabolitos secundarios (MS) (Xie & Lou 2009), que están ligadas a los sistemas de defensa
desarrollados a lo largo de millones de años de evolución y selección natural, presentando
actividad sinérgica entre sus componentes químicos, con un balance natural (Liu 2004). Se han
realizado diversos estudios del metabolismo químico de los briófitos y sus compuestos,
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
13
encontrando fenoles, terpenoides, alcaloides y otras toxinas importantes en la defensa contra
patógenos (Asakawa 2001; Zinsmeister et al. 1991); musgos y hepáticas poseen gran variedad de
compuestos químicos con actividad biológica, como bencenoides, derivados de ácidos grasos,
flavonoides y terpenoides, que son los principales con actividad antimicrobiana, así como se han
encontrado nuevos compuestos para la ciencia, especialmente en las hepáticas (Xiaowei 2007;
Asakawa 2007; Sabovljević & Sabovljević 2008; Sabovljević et al. 2011). Por esto, es importante
realizar una exploración de varias especies para encontrar compuestos potentes, no tóxicos y de
amplio espectro como fuente de antibióticos, así como nuevos compuestos aún no descritos
(Sabovlević & Sabovlević 2008).
En la medicina tradicional de varios países, los briófitos han sido utilizados en el tratamiento de
enfermedades del hígado, corazón, para problemas digestivos, enfermedades pulmonares,
problemas de piel, inflamación y fiebre, así como también durante las guerras como vendajes y
manera de gasas y algodón, dadas sus características (capacidad de absorción y acción
antimicrobiana), por lo que aún hay actividades biológicas y aplicaciones no comprobadas
científicamente (Glime 2007; Asakawa 2008). Se han estudiado algunas especies, comprobando
su actividad biológica como antimicrobianos, antioxidantes, antitumorales, antidotales,
antipiréticos, diuréticos y antisépticos, para el tratamiento de quemaduras y heridas, entre otros
(Asakawa 2007, 2008). Actualmente, el estudio de los musgos hepáticas y antoceros sigue siendo
un campo de estudio prometedor, en especial en la medicina hacia la búsqueda de compuestos
activos para el desarrollo de fármacos, así como de nuevos compuestos para la ciencia, como
especialmente se han descubierto en las hepáticas (Sabovljević & Sabovljević 2008; Sabovljević
et al. 2011).
A pesar de su gran potencial, la investigación básica en fitoquímica y aplicación biotecnológica
de los briófitos no ha sido tan desarrollada como en las angiospermas (de las cuales se tiene un
amplio conocimiento de la composición química y actividad de varias especies) dado que son
organismos considerados difíciles de estudiar e identificar (por su tamaño y estructuras) y de
limitada obtención en cantidades considerables, dado que presentan baja tasa de crecimiento y su
colecta masiva podría crear problemas de conservación para estas especies tan importantes a
nivel ecológico (Glime 2007; Sabovljević et al.2011; Savaroglu et al. 2011). No obstante, hace
varios años se han desarrollado estudios en varios países; particularmente en Alemania, donde se
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
14
han utilizado técnicas biotecnológicas para la producción de briófitos en condiciones artificiales o
Briotecnología (como es llamado) y para ello se han desarrollado centros internacionales de
producción masiva de briófitos como The International Moss Stock Center (http://www.moss-
stock-center.org) y Greenovation (http://www.greenovation.com) donde enfocan sus
investigaciones principalmente en Physcomitrella patens. Este musgo es productor de insulina y
es utilizado como modelo biológico, principalmente en estudios moleculares dado que su genoma
completo ha sido secuenciado (Beike et al. 2010). Esto no solo demuestra el gran potencial de los
briófitos sino también que es posible su producción a escala industrial, por medio de cultivos in
vitro y en bioreactores alcanzando una producción masiva con alta eficiencia y en condiciones
asépticas, necesarias en la obtención de proteínas humanas (Decker & Reski 2004; Hohe & Reski
2005).
Particularmente en Colombia, el estudio de los briófitos se ha enfocado más hacia su taxonomía y
ecología, que a su utilización económica aunque existen unos pocos estudios de actividad
biológica. Morantes et al. (2007) evaluaron la actividad de Politrichum juniperinum para Bacillus
subtilis, Micrococus luteus, Escherichia coli, Salmonela sp y Candida albicans, pero esta especie
no presentó actividad para ninguno de los microorganismos, aunque sí se obtuvieron resultados
positivos para las actividades citotóxica y de acción sobre el SNC (mediante el test de Irwin).
Adicionalmente, López et al. (2007) observó actividad antioxidante para Sphagnum sp.,
Leptodontium luteum y Dicranum frigidum, destacándose la actividad de Sphagnum sp. por los
tres métodos evaluados (DPPH, ABTS y FRAP) y por último, Pereañez et al. 2010 encontró
actividad contra el veneno de cobra para la mayoría de las especies evaluadas (Breutelia chysea,
Dicranum frigidum, Leptodontium luteum, Sphagnum recurvum, Sphagnum sp. y Thuidium
peruvianum).
A demás de estos estudios, no se encontraron más investigaciones en fitoquímica de briófitos en
Colombia. Es importante investigar este tipo de plantas en el país, así como de otros grupos como
los líquenes y las algas (que han sido un poco más estudiadas), en especial con las especies de
Colombia dado que se encuentra gran variedad de ambientes, algunos con condiciones
ambientales cambiantes como los ecosistemas de páramo, donde los organismos están adaptados
a estrés biótico y abiótico, y han logrando colonizar, establecerse y proliferar en él exitosamente.
De igual forma, tanto en Colombia como en otros países, el conocimiento de los musgos y
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
15
hepáticas y sus posibles actividades biológicas sigue siendo insuficiente y, dado que son el
segundo grupo más grande de plantas y presentan una amplia gama de compuestos químicos
producto de la evolución contra factores de estrés biótico y abiótico, queda un gran camino por
recorrer en la búsqueda de compuestos activos y nuevos para la ciencia en este grupo de plantas
(Veljić et al. 2009).
Así mismo, es importante estudiar otro tipo de actividades dado que en diferentes especies de
hepáticas se ha obtenido resultados muy prometedores con características como olores
característicos, sabores (picante y amargo) y en actividades como dermatitis alérgica de contacto,
citotóxica, anti-VIH, inhibidor de la polimerasa del ADN, antifúngica, antialimentaria de
insectos, nematicida, antioxidante, neurotrófica, inhibidora del crecimiento de plantas, como
relajante muscular, contra la obesidad, así como pueden presentar sustancias alelopáticas que
inhiben el establecimiento y crecimiento de otras plantas, entre otros (Asakawa 2011; Michel et
al. 2011).
7.2.3. Angiospermas
Especies de angiospermas en todo el mundo son comúnmente conocidas como alimenticias, en
especial sus frutos y semillas, así como también han sido utilizadas como plantas medicinales
para el tratamiento o prevención de enfermedades (Martínez et al. 2000). Las angiospermas de
Colombia tradicionalmente se han usado como ornamentales, medicinales, alimenticias, para la
elaboración de artesanías por sus fibras y colorantes, entre otros (Pérez 1996; Linares et al.
2008). En la medicina tradicional, las plantas son procesadas de manera sencilla utilizando por
ejemplo infusiones, compresas, ungüentos, macerados, en polvo, jugos y jarabes, entre otros
(Fonnegra & Jiménez 2007), para obtener determinado efecto sobre la enfermedad padecida; no
obstante, es importante comprobar y validar el uso de las plantas, para que sea estable y seguro,
corroborando la ausencia de efectos tóxicos en los organismos que las consumen (Martínez et al.
2000).
Las plantas vasculares son de los grupos más estudiados en fitoquímica encontrando una amplia
variedad de compuestos (i.e. alcaloides, almidones y derivados, compuestos analgésicos,
compuestos aromáticos, saponinas, flavonoides) con actividades biológicas contra plagas de
microorganismos, insectos y malezas, contra enfermedades humanas desarrollándose fármacos o
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
16
productos naturales en medicina naturista y homeopática, que han sido de gran utilidad para el
mundo (Pérez 1996; Gupta 2008). No obstante, varias especies no han sido estudiadas y
presentan un alto potencial de uso terapéutico y aún más teniendo en cuenta la variedad de
ambientes de Colombia, varias especies de angiospermas, cuyos frutos son utilizados como
alimento tradicionalmente en ciertas comunidades y regiones, estudiando otras aplicaciones
económicas y actividades biológicas, se puede ofrecer un valor agregado a las frutas,
presentándose por ejemplo como alimentos funcionales.
La actividad biológica de las plantas puede no ser dado por un solo compuesto sino por la acción
conjunta de varios de ellos; los cuales varían en calidad y cantidad dependiendo del órgano que
se analice (fruto, semilla, hoja, rallo, raíz), de su estado fenológico y del ambiente en el que se
desarrolle (Martínez et al. 2000; Liu 2004). Por ello, varias especies de frutas de Colombia,
aunque no sean nativas, pueden presentar variaciones en sus componentes y actividades
biológicas dado que son cultivadas en las condiciones ambientales del país siento especies
domesticadas y convirtiéndose en variedades criollas o especies muy adaptadas a dichos
ambientes (Martínez et al. 2000).
Dentro de las especies de frutas evaluadas, particularmente, las bayas han sido ampliamente
estudiadas encontrando actividad mutagénica, antitrombótica, antioxidante, antiinflamatoria y en
la prevención del cáncer; así mismo, han sido exploradas en su composición química dado que
presentan un especial interés como fuente de compuestos antimicrobianos observando actividad
para infecciones bacterianas resistentes a antibióticos, en el control de patógenos humanos y en la
antiadhesión en el proceso de enfermedades microbianas (Puupponen-Pimiä et al. 2005b).
8. MATERIALES Y MÉTODOS
8.1. Obtención y preparación de muestras y extractos
8.1.2. Briófitos
Los briófitos (Ver Tabla 8 en anexos) fueron seleccionados por los criterios de abundancia y por
observaciones en campo, dado que estas plantas no se observan con infecciones producidas por
patógenos por lo que puede indicar un metabolismo químico complejo con metabolitos
secundarios relacionados con la defensa y protección contra microorganismos y por ello pueden
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
17
ser fuente de compuestos antimicrobianos (Glime 2007). Así mismo, en una revisión más
detallada de estudios realizados con especies relacionadas filogenéticamente indica que pueden
tener mayor potencial de actividad biológica, como criterio quimiotaxonómico (Hostettmann et
al. 2008).
Las muestras fueron colectadas en el municipio de La Calera, específicamente en la vereda
Buenos Aires Alto, finca La Huerta a una altitud de 2585msnm. El lugar de colecta presenta un
ecosistema de subpáramo con características ambientales favorables (humedad y temperatura)
para una alta diversidad de briófitos. Se tomaron los datos de colecta (lugar, fecha, sustrato) en la
libreta de campo para su posterior identificación, las muestras se secaron durante cuatro días a
temperatura ambiente (para eliminar el contenido de humedad) y bajo luz moderada (para evitar
la degradación de metabolitos termolábiles). Se tomaron pequeñas muestras de cada especie para
tomar los pesos frescos y secos (Tabla 4) y para la identificación taxonómica y almacenamiento
en el Herbario de la Pontificia Universidad Javeriana (HPUJ).
Los briófitos fueron limpiados, eliminando los excesos de tierra y de otras plantas y se trituraron
manualmente. Para la extracción total de los compuestos químicos presentes, los briófitos fueron
puestos en maceración en etanol al 96% durante dos semanas; posteriormente, se retiró el
solvente en un rotaevaporador BÜCHI a 175mbar/hPa de presión y a una temperatura de 40°C
para evitar la pérdida de compuestos termolábiles y se concentró hasta el punto de viscosidad de
jarabe o la tercera parte de su volumen inicial, en una campana de vacío y finalmente se pesaron
los extractos para calcular el porcentaje de rendimiento de extracción de cada muestra (Tabla 4)
(Bilbao 1997).
8.1.2. Frutas
Las frutas fueron obtenidas de diferentes regiones de Colombia (Ver Tabla 8 en anexos), de
lugares o fincas productoras de frutas dado que se evaluaron especies comerciales, a excepción de
la mora silvestre, la cual fue colectada en el mismo lugar que los briófitos. Todas las muestras se
encuentran en proceso de identificación por especialistas del HPUJ (Herbario de la Pontificia
Universidad Javeriana).
Las muestras fueron almacenadas en un congelador a -70°C hasta su procesamiento; cada fruta
fue triturada con un triturador de astas y posteriormente fue filtrada con tela de algodón y con
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
18
filtros de papel y luego centrifugada por 10 min a 3000 rpm para obtener el jugo puro y filtrado
de cada fruta.
Por otra parte, con el fin de estimar la concentración evaluada de los jugos se calcularon los
sólidos totales. La metodología del cálculo de sólidos fue realizada en base a los métodos
oficiales de AOAC 922.10, para frutas y productos de frutas, el cual consistió en agregar
aproximadamente 1g de cada jugo a un crisol vacío y previamente secado en una cámara de
vacío, luego dejarlo secar en el horno durante cuatro horas a 95°C, se deja enfriar en el desecador
y luego se pesó el crisol con el jugo seco, obteniendo así los valores del peso del jugo, peso del
jugo seco (sin el contenido de humedad) que corresponde a los sólidos totales, el porcentaje de
humedad y m/m (cantidad de líquido y de solutos respectivamente, en relación con la cantidad de
jugo inicial); así mismo, para cada jugo se determinó su densidad por medio de un picnómetro de
5ml y posteriormente, con estos resultados se estimó la concentración evaluada en los pozos para
cada fruta, teniendo en cuenta que a cada pozo se le agregaron 50μl (0.05ml) (Cunniff 1998) (Ver
Tabla 9 en anexos).
8.2. Evaluación antibacteriana
8.2.1. Preparación de materiales y cepas
Las bacterias utilizadas como modelo para evaluar la actividad antibacteriana (Tabla 1) se
obtuvieron del Cepario de Microorganismos de la Pontificia Universidad Javeriana (CMPUJ) y
fueron escogidas en base al boletín de información técnica de los estándares globales de las
farmacopeas estadounidense, japonesa y europea para productos tropicales, en donde especifica
las bacterias utilizadas como indicadores de la actividad antimicrobiana (BioScreen Testing
2007). Se evaluaron a Bacillus subtilis (se recomienda de manera opcional), Staphylococcus
aureus, Pseudomonas auriginosa y Escherichia coli, cada una con sus códigos del cepario de
procedencia y sus ATCC (American Type Culture Collection).
Tabla 1. Bacterias evaluadas
Bacteria ATCC CMPUJ Tinción Infecciones Hospederos
Bacillus subtilis 6633 75 Gram-
positiva
Alimenticios Plantas
Staphylococcus
aureus
6538 80 Gram-
positiva
Cutáneas, mucosas y de riesgo
vital
Animales
Pseudomonas 9721 55 Gram- Tracto pulmonar, urinario, Plantas,
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
19
aeruginosa negativa tejidos, heridas animales
Escherichia coli 8739 76 Gram-
negativa
Intestinales y
gastrointestinales
Animales
Los extractos etanólicos de briófitos fueron diluidos en DMSO (Dimetil sulfóxido) puro (dado
que no fueron solubles en agua) ajustándolos a concentraciones de 1, 10 y 100 mg/ml mientras
que, dado que se evaluaron los jugos puros filtrados y centrifugados, , en estado acuoso, se utilizó
como control negativo el agua. Cada muestra a evaluar (briófitos y frutas) fue introducida en
tubos Ependorf (uno para cada bacteria) y se prepararon los materiales por separado para cada
bacteria para evitar contaminación.
8.2.2. Bioensayo
Se evaluaron jugos puros filtrados de frutas y extractos totales de briófitos a diferentes
concentraciones poniendo a prueba su actividad contra cuatro bacterias patógenas (Figura 1). En
tubos de vidrio estériles se agregó 5ml de caldo nutritivo, se sembró en cada uno y por separado
las cuatro bacterias y se dejaron crecer en una incubadora a 35°C durante 24 horas; luego se
realizó otro repique en otro tubo con caldo nutritivo, se puso a incubar en las mismas condiciones
durante 6 horas con el fin de alcanzar su fase exponencial (Cona 2002) y luego se realizó la
prueba de turbidez o de Mc Farland, ajustando con solución salina, cada caldo con bacteria al
patrón de 0.5 de Mcfarland que equivale a 3x108 UFC/ml (McFarland 1907).
Se utilizó la metodología de difusión en pozo para la cual se hicieron pozos de 0.5cm de diámetro
con la ayuda de pipetas pasteur de vidrio estériles. Se utilizó Agar Müller-Hinton agregando 25ml
de medio a cada caja de petri y 0.5ml de caldo nutritivo con bacteria a la concentración de 0.5 de
Mc Farland, anteriormente preparado. Se dejaron solidificar los medios y luego se hicieron los
pozos en cada caja de petri en los cuales se agregaron 50μl de cada extracto, del control positivo
(DMSO para briófitos y agua destilada desionizada para frutas) y del control negativo (ampicilina
a 200 mg/ml y clindamicina a 150 mg/ml). Se realizaron mediciones cada 12 horas hasta las 48h
obteniendo los diámetros de los halos de inhibición de los extractos y controles, y se llevó un
registro fotográfico de cada uno.
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
20
Figura 1. Diseño experimental de la Prueba Antibacteriana
Se realizaron tres bioensayos como se muestra en la Figura 2. En cada uno se evaluaron varias
especies con el fin de hacer un tamizaje evaluando su capacidad antibacteriana y seleccionando
las especies activas, volviendo a probarlas en el siguiente bioensayo, hasta finalmente realizar de
nuevo un experimento en el que se evaluaron todas las especies que presentaron actividad en
todas las pruebas.
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
21
Figura 2. Evaluación de la actividad antibacteriana de las especies haciendo un tamizaje de los
jugos de frutas con actividad (Especies activas aparecen en negrilla).
8.2.3. Identificación preliminar de metabolitos secundarios
Se realizaron pruebas químicas preliminares (Tablas 2 y 3) por el método de Wall y
colaboradores (1952) y basándose en Bilbao 1997, a los extractos y jugos que presentaron
actividad antibacteriana, para la obtención preliminar de las principales familias de metabolitos
secundarios.
Tabla 2. Pruebas químicas preliminares para compuestos disueltos en solvente de baja polaridad.
Prueba Compuestos Reacción
Lieberman Buchard Esteroides y esteroles Cambio de color (Rosa, violeta, azúl, verde)
Salkowski Terpenos Cambio de color (Amarillo-rojo)
Baljet Terpenos y esteroles Cambio de color (Amarillo)
Hidroxamato férrico Sesquiterpenolactonas Cambio de color (Café o violeta)
Tabla 3. Pruebas químicas preliminares para compuestos disueltos en solvente de alta polaridad.
Prueba Compuestos Reacción
Shinoda Flavonoides y fenoles Desprendimiento de un gas y cambio de color (naranja-
rojizo)
Cloruro férrico
FeCl3 Flavonoides y fenoles Cambio de color (verde intenso)
Antrona Glicósidos de
flavonoides Formación de anillo
Dragendorff Alcaloides Formación de un precipitado naranja
Espuma Saponinas Formación de espuma por más de 15´
9. RESULTADOS
9.1. Especies evaluadas
Durante la extracción de los compuestos químicos de los briófitos se tuvo en cuenta los pesos,
húmedo y seco, para saber el porcentaje de solutos presentes en relación con la cantidad de agua
inicial que contenía cada muestra; así mismo, se tuvo en cuenta los pesos iniciales de la totalidad
del material vegetal triturado que se maceró y luego el peso del extracto obtenido de él para
calcular el rendimiento de extracción de cada especie, consignando los resultados en la Tabla 4,
en donde se puede observar que Trichocolea sp. e Hypnum sp. son las dos especies que
presentaron un mayor porcentaje de rendimiento de extracción.
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
22
Por su parte, para las frutas se calcularon los sólidos totales y la densidad de cada jugo lo cual
permitió obtener la concentración a la que fueron evaluados en cada pozo (Ver Tabla 9 en
anexos), a excepción del ají dado que la cantidad de material no era suficiente para calcular la
densidad del jugo, por el método seleccionado.
Tabla 4. Procesamiento de muestras y proceso de extracción etanólica de los compuestos de los
briófitos.
Briófito
Peso húmedo
Peso seco
m/m Peso seco para
maceración Volumen
Etanol Peso Extracto Concentrado
Rendimiento
(g) (g) % (g) (ml) (g) %
Sphagnum sp. 10,15 1,13 11,11 129,90 6900 3,94 3,03
Metzgeria sp. 10,03 1,30 12,97 31,80 1500 1,21 3,80
Trichocolea sp. 10,05 1,14 11,39 28,20 700 1,84 6,52
Hypnum sp. 10,10 1,87 18,53 100,80 3370 5,74 5,70
9.2. Bioensayo
La actividad antibacteriana de extractos etanólicos de briófitos, dos musgos (Sphangum sp. y
Hypnum sp.) y dos hepáticas (Trichocolea sp. y Metzgeria sp.), a las concentraciones de 1, 10 y
100 mg/ml, y de jugos puros de frutas (piña, mora, arándano, pera rosada, ají dulce, corozo,
carambolo, níspero, uva y agraz), fueron evaluados por el método de difusión en pozos de agar,
contra cuatro bacterias indicadoras de actividad biológica (Bacillus subtilis, Staphylococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli). Los resultados de la actividad
antibacteriana de los extractos de briófitos se muestran en la Tabla 5 y de las frutas en la Tabla 6
(destacando en negrilla los de mayor actividad entre las especies evaluadas), observando que las
cuatro especies de briófitos, así como los jugos de mora, arándano, uva y agraz presentaron
actividad contra al menos una de las bacterias, contrario a los jugos de piña, pera rosada, ají,
corozo, carambolo y níspero que no mostraron actividad.
Tabla 5. Actividad antibacteriana de los extractos etanólicos de cuatro especies de briófitos a
diferentes concentraciones, sobre las cuatro bacterias evaluadas
Zona de Inhibición (mm)
Bacterias
Sustancia Concentración
(mg/ml) B. subtilis S. auerus P. aeruginosa E. coli
Bri
ófi
tos Sphagnum sp. 1 0.0 0.0 0.0 0.0
10 0.0 0.0 0.0 9.0 ± 1.7
100 9.4 ± 0.5 0.0 6.3 ± 4.6 9.3 ± 1.2
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
23
Metzgeria sp. 1 0.0 0.0 0.0 0.0
10 0.0 0.0 0.0 9.9 ± 0.2
100 9.0 ± 0.0 0.0 7.7 ± 0.6 0.0
Trichocolea sp. 1 0.0 0.0 0.0 0.0
10 9.9 ± 0.2 9.8 ± 0.4 13.0 ± 1.0 0.0
30 10.2 ± 0.2 10.7 ± 1.2 14.3 ± 0.6 0.0
Hypnum sp. 1 0.0 0.0 0.0 0.0
10 13.6 ± 3.4 0.0 3.9 ± 5.3 9.0 ± 1.7
100 16.3 ± 1.2 8.3 ± 0.6 15.7 ± 5.3 11.3 ± 1.5
Anti
bió
tico
Ampicilina 200 36.2 ± 1.0 42.2 ± 0.8 12.5 ± 0.7 23.3 ± 1.4
Clindamicina 150 22.7 ± 0.5 24.6 ± 0.3 0.0 12.2 ± 2.3
Los valores significan ± SD (Desviación Estándar). n = 3 en cada grupo. La actividad antibacteriana fue probada por
el método de difusión en agar con pozos de 5mm y cada pozo con 50μl de la sustancia.
Como controles negativos fueron usados H2Od (para frutas) y DMSO (para briófitos); ninguno de ellos mostró
actividad.
Tabla 6. Actividad antibacteriana de los jugos de diez frutas contra las cuatro bacterias evaluadas
Bacterias
Zona de Inhibición (mm)
Sustancia B. subtilis S. auerus P. aeruginosa E. coli
Fru
tas
Pi 0.0 0.0 0.0 0.0
Mo 11.9 ± 0.5 13.8 ± 1.1 14.3 ± 0.9 15.9 ± 1.8
Ar 0.0 12.0 ± 0.6 0.0 22.0 ± 1.5
Pr 0.0 0.0 0.0 0.0
Aj 0.0 0.0 0.0 0.0
Co 0.0 0.0 0.0 0.0
Cm 0.0 0.0 0.0 0.0
Np 0.0 0.0 0.0 0.0
Uv 9.9 ± 0.2 13.3 ± 1.2 12.4 ± 2.9 10.9 ± 0.9
Ag 10.0 ± 1.0 13.3 ± 1.2 10.3 ± 0.4 12.3 ± 0.7
Anti
bió
tico
Amp 36.2 ± 1.0 42.2 ± 0.8 12.5 ± 0.7 23.3 ± 1.4
Cli 23.2 ± 0.5 24.5 ± 0.2 0.0 13.2 ± 2.3
Los valores significan ± SD (Desviación Estándar). n = 3 en cada grupo. La actividad antibacteriana fue probada por
el método de difusión en agar con pozos de 5mm y cada pozo con 50μl de la sustancia.
Pi – Piña; Mo – Mora; Ar – Arándano; Pr – Pera rosada; Aj – Ají dulce; Co – Corozo; Cm – Carambolo; Np –
Níspero; Uv – Uva; Ag – Agraz.
Controles positivos: Ampicilina (200mg/ml) y Clindamicina (150mg/ml).
Controles negativos: H2Od para las frutas y DMSO puro para los briófitos (ninguno de ellos mostró actividad).
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
24
Proporcionalmente al número de especies evaluadas, los briófitos fueron más activos que las
frutas dado que el 100% de los briófitos presentaron actividad para al menos una de las bacterias
en mínimo una concentración, mientras que de las diez frutas evaluadas, solo cuatro tuvieron
actividad, para al menos una de las bacterias.
El extracto de briófito que presentó la mayor actividad antibacteriana a las concentraciones
evaluadas fue el de Hypnum sp. para todas las bacterias, donde la menor actividad fue para S.
aureus. Los otros tres extractos de briófitos fueron activos para solo tres de las bacterias. El
extracto de Trichocolea sp. fue el segundo en presentar la mejor actividad y aunque no inhibió el
crecimiento de E. coli, tuvo el halo de inhibición más grande para S. aureus, que parece ser una
cepa muy resistente, dado que ni el extracto de Sphagnum sp. ni el de Metzgeria sp. tuvieron
actividad para esta cepa, aunque sí presentaron, y de forma muy similar, actividad para las otras
tres bacterias, mostrando una fuerte similitud de actividad en ambas especies de briófitos.
En cuanto a las concentraciones de extractos analizadas, ningún extracto de briófito inhibió el
crecimiento bacteriano a concentración de 1 mg/ml, mientras que, a medida que aumentaba la
concentración el halo de inhibición fue mayor, alcanzando la mejor actividad a 100 mg/ml para
todas las especies, a excepción del extracto de Metzgeria sp. el cual presenta actividad a 10
mg/ml, pero no a 100 mg/ml, contradiciendo lo observado.
Así mismo cabe señalar que no hubo diferencias de actividad entre los dos grupos de briófitos,
musgos (Sphagnum sp.e Hypnum sp.) y hepáticas (Metzgeria sp. y Trichocolea sp.) dado que las
dos especies más activas fueron un musgo (Hypnum sp.) y una hepática (Trichocolea sp.).
Para el caso de los jugos de frutas, los que presentaron actividad fueron los de mora silvestre,
arándano, uva y agraz, destacándose notablemente la actividad de la mora silvestre en su
actividad antibacteriana para todas las bacterias evaluadas, no solo en el diámetro del halo sino
también cualitativamente dado que los halos fueron los más transparentes, claros y definidos, de
todas las especies evaluadas (Anexos, Figura 6). Los extractos de briófitos, aunque presentaron
halos cualitativamente similares o iguales a la mora silvestre, sus diámetros fueron menores para
varias bacterias (Anexos, Figura 5).
Hay que tener en cuenta que solo fueron medidos y tomados como positivos, los halos que se
observaban claramente, transparentes y con límites bien definidos de manera que se pudieran
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
25
realizar las tres mediciones para cada pozo y sacar el promedio para cada repetición, así como
cabe aclarar que se hicieron repeticiones en tres diferentes cajas de petri y obteniendo los
promedios que son los resultados consignados en las Tablas 5 y 6.
El jugo de mora silvestre fue el de mayor actividad entre las diez frutas evaluadas mostrando el
mayor efecto en E. coli y el menor halo de inhibición para B. subtilis. Los jugos de uva y agraz
también fueron activos para las cuatro bacterias, ambas mostrando el mayor efecto para S. aureus
y el menor para B. subtilis. Por su parte, el jugo de arándano solo presentó actividad para S.
aureus, con un halo de inhibición similar al de las otras frutas con actividad.
No es posible señalar una sola bacteria, así como un solo tipo de bacteria (Grampositivas o
gramnegativas) que haya sido la más sensible a los extractos evaluados, dado que los resultados
dependen más de la especie de planta evaluada que de la bacteria, observando un amplio rango de
acción de los extractos y jugos, para los diferentes tipos de bacterias.
Por último, los controles negativos fueron agua para las frutas y DMSO puro para los briófitos,
dado que en este solvente fueron diluidos hasta alcanzar las concentraciones evaluadas. Ni el
agua, ni el DMSO (a pesar de utilizarlo puro) inhibieron el crecimiento de las bacterias.
Los controles positivos, ampicilina y clindamicina, de forma similar coincidieron en los efectos
sobre cada bacteria, aunque no en el diámetro de inhibición; estos presentaron el mayor efecto en
S. aureus, seguido por S. subtilis, E. coli y por último P. aeruginosa, para la cual el halo de
inhibición fue el más pequeño en ampicilina mientras que la clindamicina no tuvo ni siquiera
actividad, mostrando a P. aeruginosa como la cepa bacteriana más resistente entre todas y
mostrando también el efecto de los extractos de briófitos, mora, uva y agraz, quienes inhibieron
su crecimiento en un diámetro considerable para una cepa tan resistente, la mayoría sobrepasando
el diámetro obtenido para la ampicilina.
9.3. Pruebas químicas preliminares
Tabla 7. Pruebas químicas preliminares de los extractos activos
Prueba Compuestos Mo Ar Uv Ag Sp Hy Me Tr
Lieberman Buchard Esteroides y esteroles - - + + + + + +
Salkowski Terpenos - + + - - - - -
Baljet Terpenos y esteroles + + + - + + - +
Hidroxamato férrico Sesquiterpenolactonas + + + + + + + +
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
26
Shinoda Flavonoides y fenoles - - - - - - + -
Cloruro férrico FeCl3 Flavonoides y fenoles + + - - - + + +
Antrona Glicósidos + + + + + + + +
Dragendorff Alcaloides - + + + + + - -
Espuma Saponinas - - - - - - - - Positivo (+) y Negativo (-), para la presencia de los compuestos. Mo – Mora; Ar – Arándano; Uv – Uva; Ag – Agraz;
Sph – Sphagnum sp.; Hyp – Hypnum sp.; Met – Metzgeria sp.; Tri – Trichocolea sp.
Las pruebas químicas preliminares indican que los compuestos que se presentan en común para
las sustancias activas son las sesquiterpenlactonas y los glicósidos de flavonoides, así como los
esteroides, esteroles, terpenos, fenoles, flavonoides y alcaloides, presentes en varias de las
sustancias. Por su parte, en ninguna muestra se encontraron saponinas.
10. DISCUSIÓN
La actividad contra las bacterias grampositivas (Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus) y
gramnegativas (Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli) fue evaluada mediante el método
de difusión en pozos de agar, obteniendo resultados positivos para los extractos etanólicos de
musgos (Sphangum sp. y Hypnum sp.), hepáticas (Trichocolea sp. y Metzgeria sp.) (Tabla 5) y
cuatro de los jugos de fruta evaluados (mora, arándano, uva y agraz), contrario a los jugos de las
demás frutas evaluadas (piña, pera rosada, ají dulce, corozo y carambolo) que no presentaron
actividad (Tabla 6).
En este estudio se comprueba que los briófitos tienen alto potencial para el desarrollo de
productos antibacteriales. A pesar de que el estudio fitoquímico de los briófitos ha sido relegado
y se ha prestado más atención a plantas vasculares, los resultados evidencian que los briófitos
pueden tener incluso un mayor potencial que la diversidad de frutas, dado que de las diez
especies de frutas evaluadas, solo los jugos de cuatro especies fueron activas mientras que el
100% de los briófitos presentaron actividad en al menos una concentración.
10.1. Briófitos
Todas las especies de briófitos presentaron actividad contra al menos una de las bacterias,
grampositivas y gramnegativas, en alguna concentración indicando la presencia de agentes
antimicrobianos que brindan un amplio espectro de acción. Las concentraciones activas fueron de
10 y 100 mg/ml (o 30mg/ml para el caso de Trichocolea sp.) mientras que a concentración de
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
27
1mg/ml ninguna especie inhibió el crecimiento de las bacterias. Los extractos etanólicos que
presentaron mayor actividad fueron los de Hypnum sp. y Trichocolea sp. y así mismo fueron los
que presentaron un mayor rendimiento en la extracción, lo cual es prometedor para la futura
utilización de estas especies.
Este estudio es el primer reporte de actividad antibacteriana de briófitos colombianos. Morantes y
colaboradores en el 2007 evaluaron la actividad Politrichum juniperinum contra Bacillus subtilis,
Micrococus luteus, Escherichia coli, Salmonela sp y Candida albicans, pero éste musgo no
presentó actividad antibacteriana para ningún microorganismo. Por esto, este primer reporte de
actividad de las especies de musgos y hepáticas colombianas brinda las bases para despertar el
interés en estudiar más estas especies, así como de invertir en ellas puesto que se convierten en
especies con gran potencial económico y con su indudable importancia ecológica en los
ecosistemas. Por medio de este tipo de estudios, se puede potencializar la conservación de los
briófitos, brindándoles una mayor importancia de la que ya presentan naturalmente, y motivando
la realización de estudios en técnicas de propagación ex situ, para su producción a mayor escala y
su conservación fuera de su ambiente natural. Para ello, es necesario implementar técnicas y
nuevas herramientas biotecnológicas que permitan la propagación a gran escala de los briófitos,
haciendo uso sostenible de la biodiversidad, aprovechando nuestros recursos sin afectar
negativamente los ecosistemas y promoviendo su conservación.
El estudio de la actividad antibacteriana, así como en general de la fitoquímica de briófitos en
Colombia, es prácticamente nulo, pese al gran potencial que poseen estas especies evidenciado en
este trabajo, así como en estudios realizados en otros países. Por esto es de gran importancia
investigar sobre estas especies, en especial porque en el país cuenta con una gran cantidad de
ambientes como los ecosistemas de páramo, donde las especies están adaptadas a condiciones de
estrés (tanto de patógenos como de temperatura y luminosidad), logrando no solo establecerse en
estos ambientes, sino también colonizando y proliferando exitosamente en gran parte de él
(Martínez et al. 2000).
Comparando los resultados entre briófitos, no se observa una tendencia en la actividad con
respecto al tipo de briófito, es decir, las hepáticas con respecto a los musgos no presentaron
mayor o menor actividad. En varios estudios, como por ejemplo en el de Russell (2010), se
observa que las hepáticas son mucho más activas que los musgos, dado que 88% de las hepáticas
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
28
evaluadas mostraron actividad (evidenciando una mejor zona de inhibición) contra solo el 33%
de los musgos activos. No obstante, la tendencia de mayor actividad para especies de hepáticas
no se observó en los resultados obtenidos dado que las especies de mejor actividad fueron el
musgo Hypnum sp. y la hepática Trichocolea sp., mostrando halos de inhibición mucho más
grandes para la mayoría de bacterias evaluadas por lo que para las cuatro especies de briófitos, la
actividad depende más de la especie y de los compuestos que posee, que del tipo de briófito al
que pertenece.
La actividad antimicrobiana de las hepáticas está relacionada con la presencia de cuerpos
aceitosos (no presentes en musgos y antoceros) que contienen terpenoides lipofílicos, compuestos
aromáticos y acetogeninas que son los responsables de diferentes actividades biológicas y
propiedades medicinales (Douglas 2010; Zhu et al. 2006). Principalmente se encuentran
presentes mono, sesqui y diterpenoides lipofílicos, acetogeninas y compuestos aromáticos
(benzoatos, cinamatos, fenoles de cadena larga, naftalenos, isocumarinas, entre otros),
responsables de diferentes actividades biológicas y propiedades medicinales (Douglas 2010; Zhu
et al. 2006; Asakawa 2007). Especialmente en los grupos con la morfología de hepáticas talosas
como Lunularia sp. o Marchantia polymorpha (que ha sido ampliamente estudiada en actividades
biológicas), se destaca la presencia de dichos compuestos aceitosos, así como otras familias como
Pelliaceae y Riccardiaceae, pertenecientes al orden Metzgeriales, que contienen compuestos
aromáticos (bibenzil y bis-bibenciles) (Asakawa 2008; Douglas 2010). Es posible que Metzgeria
sp., que es una hepática talosa del orden Metzgeriales, así como la hepática foliosa evaluada,
Trichocolea sp., posean estos compuestos aceitosos y que estos sean algunos de los causantes de
la actividad biológica observada.
Metzgeria sp. aunque no presentó actividad a las concentraciones de 1 y 10mg/ml (a excepción
con E. coli a concentración de 10mg/ml), en la máxima concentración evaluada (100mg/ml) fue
activa para B. subtilis y E. coli. En esto se observa que el aumento en la concentración del
extracto influye de manera importante y puede ser un factor determinante en la actividad contra
diferentes tipos de bacterias. Esto puede deberse a que los componentes activos de las muestras
están representados en un menor porcentaje y aumentando la concentración de la muestra, así
mismo aumentan dichos compuestos activos, mostrando una mayor inhibición del crecimiento
bacteriano. No obstante, para E. coli, se observa actividad a 10mg/ml pero no a mayor
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
29
concentración; según lo observado, se formaba un precipitado en el pozo por lo que puede ser
importante tener precaución en filtrar bien las muestras de manera que sea totalmente líquida
lográndose difundir en el medio y actuar sobre las bacterias.
El estudio de las especies de Metzgeria es limitado; no obstante han encontrado actividad
antifúngica para la fracción de CH3Cl de la extracción metanólica (Mishra & Verna 2011),
actividad anitimicrobiana para Metzgeria furcata y, estudios donde muestra que es causante de
alergia al contacto dérmico (aunque sus alérgenos no han sido aislados aún) (Asakawa 2008). Por
ello, el desarrollo de productos a partir de esta hepática debe complementarse con estudios
toxicológicos y clínicos, determinando su dosis y comprobando su actividad.
Por su parte, del género Trichocolea, que es una hepática foliosa, se han investigado algunas
especies (T. hatcheri, T. tomentella y T. mollissima), encontrando compuestos como tomentelina
y dimetiltomentelina las cuales presentan actividad antifúngica y citotóxica, y otros compuestos
como fenileteres y tricocoleina (también con actividad antifúngica) (Perry et al. 1996; Nagashima
et al. 2003; Asakawa 2011; Ludwiczuk & Asakawa 2010). En el estudio de Kwag et al. (2003),
T. hatcheri se evaluó contra B. subtilis, dermatofitos, virus y células leucémicas, encontrando
actividad para todos los organismos evaluados, presentando un halo de inhibición de 1mm para
B. subtilis usando 150mg/disco, lo cual concuerda con los resultados obtenidos, aunque
encontrando en este estudio un mayor halo de inhibición a menor concentración, para la cepa
evaluada (B. subtilis). De igual manera, cabe resaltar que según la literatura varias especies de
Trichocolea presentan compuestos químicos con actividades biológicas y esto es corroborado en
este trabajo, dado que la el extracto de la especie evaluada de Trichocolea presentó actividad para
tres de las bacterias evaluadas (B. subtilis, S. aureus y P. aeruginosa), siendo el segundo mejor
extracto entre las cuatro especies evaluadas
T. hatcheri también fue evaluada por Baek et al. (2004) encontrando un compuesto con actividad
antitumoral, antioxidante y antimicrobiana (contra S. epidermidis MIC 1000μg/ml). Por ello, con
relación a las bacterias evaluadas, se observa que el género Trichocolea presenta actividad contra
especies de Staphylococcus, mostrando la mayor actividad entre las especies de briófitos
evaluadas a ambas concentraciones (10 y 30 mg/ml), seguido por Hypnum sp., mientras que las
otras dos especies de briófitos no fueron activas para S. aureus. Con respecto a P. aeruginosa se
observó que Trichocolea sp. presentó la segunda mejor actividad (después de Hypnum sp.) a las
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
30
mismas concentraciones que para S. aureus. No obstante, el extracto de ésta hepática foliosa no
fue activo contra E. coli y tampoco se encontraron estudios donde sí se observara inhibición para
esta bacteria.
Por su parte, las especies de musgos, ricas en flavonoides poseen gran actividad antimicrobiana y
los musgos en general se caracterizan por presentar biflavoides (a diferencia de las hepáticas) y
monoflavonoides (Veljić et al. 2009). De los extractos de musgos evaluados (Sphagnum sp. y
Hypnum sp.), aunque ambos fueron activos para al menos una de las bacterias, Hypnum sp. fue el
que presentó mayor actividad entre todos los briófitos evaluados lo cual contradice lo esperado.
Se esperaba no solo que las hepáticas fueran las de mayor actividad, sino también que, entre los
dos musgos evaluados, Sphagnum sp. fuera el que tuviera mayor actividad, dado que este musgo
es de los géneros más estudiados y utilizados a nivel económico (Glime 2007) y varios artículos
presentan a las especies de Sphagnum como potenciales fuentes de compuestos de actividad
biológica por su demostrada actividad antimicrobiana para varias de sus especies (Asakawa 2011;
Mellegård et al. 2009). Esto muestra la importancia de hacer este tipo de estudios base, para
varias especies y confirmar o rebatir los supuestos establecidos anteriormente. No obstante, se
sugiere evaluar la concentración y fraccionamiento del extracto con el fin de observar si hay un
aumento en la actividad, así como variaciones en el tiempo de exposición (medición del halo de
inhibición a diferentes horas) de manera que permita observar un aumento de dicha actividad.
Por último, y siendo el más importante, el musgo Hypnum sp. se presenta como el briófito más
activo entre todas las especies evaluadas, dado que no solo inhibió el crecimiento de todas las
bacterias sino también mostró las zonas de inhibición en promedio más grandes (en especial a
concentración de 100mg/ml), comparadas con las otras especies (a excepción de S. aureus para la
cual tuvo mayor actividad Trichocolea sp.). Las especies de Hpnum han mostrado actividad
antibacterial y antifúngica para diferentes modelos bacterianos (Glime 2007). En el estudio de
Veljić et al. (2009) la actividad de Hypnum cupressiforme contra B. subtilis y S. epidermitis
mostró sactividad antibacterial a concentración de 20 mg/ml; esto es confirmado por este estudio
para Hypnum sp., a una menor concentración de 10mg/ml. En el estudio de Veljić et al. (2009)
también cabe resaltar que con la evaluación de H. cupressiforme se observó una diferencia en
actividad respecto al tipo de bacteria, mostrando mayor actividad contra gramnegativas que
contra grampositivas; no obstante, en el presente trabajo, Hypnum sp. presentó actividad para
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
31
todas las bacterias (sin diferencia entre grampositivas y gramnegativas) a concentraciones de 10 y
100m/ml (a excepción de S. auerus donde solo fue activa para la concentración de 100mg/ml).
Así mismo, Savaroglu et al. 2011 evaluó a H. cupressiforme e H. impones en actividad
antibacteriana, obteniendo resultados positivos especialmente para B. subtilis y P. aeruginosa en
diferentes solventes (metanol, éter de petróleo, metanol-agua, coloroformo y acetona). Se han
descrito compuestos como biflavonoides en H. cupressiforme (hypnofenoles e
hypnumbiflavonas) (Xiaowie 2007), antraquinonas, terpenoides, flavonoides y alcaloides en H.
cupressiforme y H. imponens (Savaroglu et al. 2011), que pueden participar en la actividad
biológica observada en éste género.
Por último, se observó que P. aeruginosa es una cepa muy resistente ya que la actividad de los
antibióticos utilizados fue baja (12.5mm para Ampicilina) o nula (para Clindamicina); a pesar de
que en otros estudios como en Sabovljević et al. (2010) la ampicilina tubo actividad de 21 mm
para P. aeruginosa a concentración de 0.1 – 2 mg/ml y en Elibol et al. (2011) a una
concentración de 0.01μg/ml, ambos por el método de difusión en disco. Esto indica que la cepa
de P. aeruginosa evaluada era resistente a los antibióticos evaluados, en especial a la
clindamicina y por ello, este estudio muestra que las especies de briófitos tienen gran actividad
antibacteriana, aún en cepas como P. aeruginosa, ya que todas las especies de briófitos fueron
activas contra esta bacteria en al menos una concentración (destacándose Hypnum sp. a 100
mg/ml).
Este estudio, siendo el primer reporte de actividad antibacteriana de briófitos colombianos, brinda
las bases que demuestran la actividad antibacteriana de musgos y hepáticas de Colombia y su
gran potencial en otro tipo de actividades. Por ello, la elección de implementar nuevas
herramientas biotecnológicas para la producción a mayor escala de especies de briófitos, puede
ser fuente de resultados prometedores logrando hacer uso sostenible de la biodiversidad del país.
El desarrollo en técnicas y estrategias de su producción artificial o in vitro, por ejemplo por
medio de bioreactores que permiten una producción masiva (Beike et al. 2010), pueden ser una
herramienta muy útil para el aprovechamiento de estas plantas, sin afectar negativamente los
ecosistemas.
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
32
10.2. Frutas
Dentro de las frutas evaluadas, se observa una clara tendencia de actividad antibacteriana por
parte de los jugos provenientes de frutos rojos o bayas (como son agrupados en varios estudios),
cuyas coloraciones, relacionadas con antocianinas (glicósidos de antocianinas), que son el grupo
de flavonoides más predominante en las bayas (Puupponen-Pimiä et al. 2005b) y pueden indicar
actividad antioxidante que puede ser aprovechada para la prevención del cáncer (Stoner et al.
2008), así como también pueden estar relacionadas con un sistema de defensa externo ante
enfermedades infecciosas (Heinonen 2007), en especial en la piel, que es la que debe resisitir en
mayor medida a la radiación lumínica y al ataque de patógenos. A excepción del corozo, que
también presenta coloraciones rojizas, todos los jugos de bayas presentaron actividad, lo cual está
ampliamente documentado para varias especies de bayas, de las cuales se han estudiado sus
compuestos fenólicos a los que se les atribuyen varias actividades biológicas (Häkkinen 2000;
Nohynek et al. 2006; Puupponen-Pimia et al. 2001, 2005a, 2005b).
Algunos compuestos presentes en las bayas son algunos como flavonoles (producto de estímulos
lumínicos originándose principalmente en las superficies del fruto), ácidos fenólicos, taninos
(como las proantocianinas que confieren su sabor amargo), polímeros de fenoles (elagitaninos),
que pueden ser los causantes de la actividad antibacteriana observada en el experimento,
actuando sobre un amplio rango de microorganismos y superando las resistencias que presenten
(Puupponen-Pimiä et al. 2001, 2005a, 2005b; Nohynek et al. 2006).
Cabe resaltar que la actividad sobre las bacterias puede no estar solo determinada por la anatomía
de las bacterias sino por otros factores que podrían estar dados por los extractos y jugos
evaluados, más que por el tipo de bacterias. Puupponen-Pimiä et al. (2005a) muestran que el pH
puede ser un factor influyente en la inhibición del crecimiento bacteriano dado que uno de los
parámetros que determinan el crecimiento de microorganismos en los alimentos es precisamente
su pH; no obstante, el efecto del pH en la muestra varía según la especie de bacteria y los
compuestos fenólicos presentes y, dado que las bayas presentan un pH bajo (2.4-3.5), podría
haber influenciado en la actividad antibacteriana.
Las bayas han sido ampliamente estudiadas encontrando actividad mutagénica, antitrombótica,
antioxidante, antiinflamatoria y en la prevención del cáncer; así mismo, han sido exploradas en su
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
33
composición química dado que presentan un especial interés como fuente de compuestos
antimicrobianos observando actividad para infecciones bacterianas resistentes a antibióticos, en el
control de patógenos humanos y en la antiadhesión en el proceso de enfermedades microbianas
(Puupponen-Pimiä et al. 2005b). Los resultados de este estudio corroboran la fuerte actividad de
las bayas, frente a otros tipos de frutas, lo cual puede ser sustentado en que las bayas contienen
más flavonoides que muchos otros vegetales y frutas, en especial antocianinas y flavonoles que se
producen como respuesta a los estímulos lumínicos del ambiente (Puupponen-Pimiä et al. 2005ª,
2005b).
Así mismo, los efectos de las bayas sobre las bacterias pueden ser producto de un efecto sinérgico
de varios compuestos, en especial del grupo de fenoles, ya sean solos o combinados con otros
compuestos activos (Puupponen-Pimiä et al. 2001; Nohynek et al. 2006) y por ello, la evaluación
de la actividad de jugos evidencia una fuerte actividad con un método más sencillo y de bajo
costo (dado que no requiere de solventes ni procesos de extracción de compuestos y
concentración de extractos), y puede tener aplicaciones más directas y asequibles para las
personas que requieran su uso.
Los resultados indican que la inhibición del crecimiento de las bacterias fue muy similar entre los
jugos de bayas con actividad, no obstante, el jugo de mora se destacó cualitativamente para todas
las bacterias, entre las demás bayas, dado que mostró halos de inhibición muy bien definidos,
claros y transparentes, en especial para E. coli. Así mismo, aunque la mora tuvo la menor
actividad para B. subtilis (comparada con las otras bacterias), fue la actividad más alta entre las
demás bayas. La mora, perteneciente al género Rubus de la familia Rosaceae, son ricas en
elagitaninos que le confieren actividad biológica sobre bacterias patógenas (Häkkinen 2000;
Mullen et al. 2002; Rauha et al. 2000).
De igual forma que para los briófitos, las frutas que presentaron actividad tuvieron halos de
inhibición mucho mayores en P. aeruginosa que los mismos antibióticos, demostrando la gran
capacidad antibacteriana de estas especies de bayas.
10.3. Aspectos generales en discusión
Los compuestos químicos de las plantas han sufrido procesos de selección natural a lo largo de
millones de años que les ha permitido sobrevivir en los diferentes ambientes y ante condiciones
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
34
hostiles; por esto, las plantas presentan un conjunto de compuestos químicos de manera que han
resultado ser la combinación más exitosa evolutivamente y por ello están perfectamente
balanceados (en cuanto a la cantidad de cada compuesto presente en la muestra) y presentan una
acción sinérgica como sistema de defensa contra diversidad de patógenos a los que están
expuestos en su ambiente natural, así como contra condiciones de estrés abiótico (radiación
lumínica y temperatura) (Liu 2004; Xie & Lou 2009). Por esto, con el propósito de mantener esa
acción sinérgica entre los compuestos y su balance natural conservando la totalidad o la mayor
cantidad de compuestos presentes en las muestras, de realizar una evaluación preliminar de la
actividad antibacteriana de las especies y mediante una metodología sencilla y de bajo costo, este
estudio evaluó la actividad de los jugos puros procesados (licuados y centrifugados) de las frutas
y de los extractos totales de musgos y hepáticas, contrario a los procedimientos comúnmente
utilizados en fitoquímica donde utilizan solventes de baja, mediana y alta polaridad para extraer
los MS de las muestras (Bilbao 1997) y obteniendo resultados muy interesantes para la mayoría
de las especies evaluadas. La evaluación de las fracciones totales y de los jugos puros procesados
de las frutas puede presentar ciertas ventajas frente al estudio de las fracciones son solventes de
diferente polaridad dado que no solo se mantiene la totalidad de compuestos químicos y en las
proporciones en que naturalmente se producen, sino que ofrece un amplio espectro de
compuestos y puede tener mejor actividad que con otros solventes, dado que extrae la totalidad
de los compuestos de interés (Douglas 2010). A partir de los resultados se puede decir que
efectivamente el uso de los jugos puros de frutas y extractos totales de los briófitos fue
favorecedor dado que brindó resultados muy interesantes para la mayoría de las especies
evaluadas.
El agua es el solvente universal y el DMSO es utilizado como solvente cuando no es posible
disolver una sustancia en el agua. El DMSO, utilizado para diluir los briófitos, se probó como
control negativo de manera pura. No obstante, se debe tener cuidado con el uso del DMSO puro
dado que en varios estudios muestran que es recomendable usar el DMSO en bajas
concentraciones (alrededor del 1%) debido a que puede presentar efectos tóxicos o acción
terapéutica (Brayton 1986; Ojo et al. 2007). A pesar de esto, no se observó ningún efecto de
DMSO puro sobre el crecimiento bacteriano y por lo tanto, no presentaron efectos sobre las
bacterias analizadas por lo que, es posible que la actividad que mostraron los extractos no fue
alterada. Así mismo, el control negativo utilizado para la evaluación de las frutas fue agua
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
35
destilada dado que los jugos representan un extracto completo acuoso dado naturalmente por el
contenido de agua de las frutas y, al igual que el DMSO, tampoco afectó el crecimiento
bacteriano.
Las bacterias evaluadas, indicadoras de actividad biológica, permitieron efectivamente dilucidar
las propiedades antibacteriales de las especies de briófitos y frutas. No obstante, no se observó
ningún patrón o diferencia de actividad entre tipos de bacterias (grampositivas y gramnegativas),
a pesar que se esperaría una mayor resistencia por parte de las bacterias gramnegativas, dado que
poseen una capa de lipopolisacáridos que las hace más resistente a la acción de antibióticos,
contrario a las grampositivas que no la presentan quedando más expuestas y susceptibles a la
acción de sustancias antibióticas (Santamarina et al. 1997) y por ello, los antibióticos
generalmente son más activos contra grampositivas que contra gramnegativas (Bodade et al.
2008). Esto muestra que las especies de bayas y briófitos evaluados, presentan una fuerte acción
antibacteriana con un amplio espectro de acción, sobre ambos tipos de bacterias, haciéndolos más
interesantes en su utilización y potencial económico.
Otro aspecto importante a analizar es la diferencia en actividad de especies silvestres, en
contraste con las cultivadas. Podría pensarse que las especies silvestres presentan mejor actividad
que las cultivadas, dado que es posible que los compuestos químicos relacionados con la defensa
ante agentes externos (condiciones ambientales y patógenos) se potencialicen si las especies están
constantemente expuestas a estas condiciones y sea necesario producirlos y utilizarlos
continuamente; contrario a las plantas cultivadas, las cuales se mantienen en condiciones mucho
más favorables y se complementa su defensa con productos contra patógenos. No obstante, el
estudio de Sabovljević et al. (2011) presenta mejores resultados en actividad antifúngica para
briófitos provenientes de cultivos artificiales que para las plantas silvestres. Esto sería aún más
importante que encontrar actividad en las especies obtenidas directamente de su hábitat, dado que
su producción en condiciones artificiales y controladas se promovería, al igual que su
conservación en los ambientes naturales. No obstante, aún falta información sobre este tema,
dado que la producción de metabolitos secundarios puede ser estimulada por la presencia y
acción de patógenos sobre las plantas. Según los resultados obtenidos, las especies silvestres
(musgos, hepáticas y la mora) se destacaron en la actividad antibacteriana, frente a las otras frutas
evaluadas que son cultivariedades comerciales. Sin embargo para poder hacer una afirmación
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
36
sería interesante evaluar las mismas especies, tanto comerciales como silvestres de cada especie,
comprobando si hay variación en la actividad y si hay diferencias en la composición de MS en
cada muestra.
En cuanto a las pruebas químicas preliminares, por medio de ellas se puede obtener una
aproximación a las principales familias de metabolitos secundarios presentes en las muestras y
que pueden ser los causantes de la actividad mostrada. De acuerdo a los compuestos encontrados
en varios estudios en las especies de briófitos y de las bayas (anteriormente ya mencionados), os
resultados de estas prueas son acordes ya que se encontraron sesquiterpenlactonas y los
glicósidos de flavonoides, asì como esteroides, esteroles, terpenos, fenoles, flavonoides y
alcaloides, que pueden ser los responsables de la actividad antibacteriana. No obstante, esto
brinda una idea general pero es necesario realizar otro tipo de pruebas como espectrofotometrìa
de masas para identificar los compuestos presentes, de una manera más segura y confiable. Así
mismo, dado que las pruebas para los jugos se realizaron tomando el jugo tal cual como fue
probada su actividad (el jugo completo), el agua presente pudo haber interferido en las reacciones
y por ende en los resultados por lo que es recomendable realizar las pruebas con el jugo
liofilizado o seco, y luego podría compararse ambos resultados para observar sí el agua interfiere
en dichas reacciones.
11. CONCLUSIONES
Los briófitos y bayas tienen un gran potencial económico como productos antibacteriales y
medicamentos contra bacterias patógenas. A parte de las plantas vasculares o fanerógamas, las
plantas no vasculares o criptógamas (Briofitos) también poseen actividad antibacteriana, e
incluso en mayor proporción que las frutas, mostrándose como fuente de productos
antimicrobianos. Este estudio confirmó la actividad antibacteriana de cuatro especies de briófitos
(Sphagnum sp, Hypnum sp. Metzgeria sp. y Trichocolea sp.) y de cuatro angiospermas (mora
silvestre, arándano, uva y agraz) obtenidas de diferentes regiones de Colombia, presentándose
como posibles fuentes de alimentos funcionales y como (mora silvestre, arándano, uva y
agraz)candidatos para medicamentos o preservantes alimenticios.
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
37
12. RECOMENDACIONES Y PERSPECTIVAS FUTURAS
Se recomienda tener en cuenta otras metodologías de extracción, incluir fraccionamiento de las
muestras con diferentes solventes y hacer un estudio bioguiado, evaluando su actividad mediante
otro tipo de pruebas antimicrobianas (microdilución o evaluación por discos), en especial para
confirmar o rectificar la ausencia de actividad de los jugos de fruta que no inhibieron el
crecimiento de las bacterias. Por medio de la identificación de los MS presentes en las fracciones
activas se puede saber qué moléculas son las responsables de la actividad y mediante pruebas in
vitro podría comprobarse su acción sinérgica contra el crecimiento bacteriano. Así mismo,
pueden evaluarse los extractos y jugos frente a otros microorganismos (hongos, virus u otras
bacterias) con el fin de observar el rango de actividad biológica de las especies evaluadas, así
como también evaluar otras actividades biológicas (i.e. anticancerígenas y antioxidantes).
Finalmente, con el fin de obtener un producto certificado y validado, es recomendable pasar a
estudios preclínicos y clínicos, evaluar la toxicidad de las muestras y las dosis recomendables
para su uso como fármacos.
A futuro, también es importante estudiar el mecanismo de acción de los MS sobre las células
microbianas, para evaluar y analizar qué factores son los determinantes en el efecto negativo
contra las células bacterianas. Así mismo, a partir del estudio de especies taxonómicamente
cercanas, se pueden seleccionar las especies con mayor potencial e interés de estudio.
Otro aspecto de gran importancia, es la obtención masiva de las especies para la producción de
extractos. En el caso de las frutas comerciales, ya existen las técnicas agronómicas y
metodologías que permiten obtener cantidades significativas del material vegetal. Sin embargo, la
obtención a gran escala de los briófitos es difícil dado que en el país no se han desarrollado ni
aplicado las técnicas para la producción masiva de briófitos. No obstante, centros internacionales
de producción masiva de briófitos muestran las técnicas que pueden usarse para generar grandes
cantidades del material, en condiciones artificiales y sin afectar los ecosistemas, como por
ejemplo el cultivo in vitro y el uso de bioreactores para mayor producción.
De esta manera, el proceso de bioprospección de especies vegetales es bastante amplio pero
prometedor y este tipo de estudios brinda las bases para la selección de las especies más
promisorias dentro de la gran diversidad de especies vegetales de Colombia.
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
38
13. AGRADECIMIENTOS
A Luis Gonzalo Sequeda, por su apoyo, confianza, dedicación y entusiasmo en el proceso de
realización del trabajo de grado, a Noemí Téllez por sus aportes en el proceso de evaluación y en
especial a los integrantes y funcionarios de los Grupos de Investigación en Fitoquímica (GIPUJ)
y Grupo de Terapia Celular y Molecular, de la Pontificia Universidad Javeriana, por su apoyo y
colaboración.
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14. ANEXOS
Tabla 8. Especies evaluadas
Fruta Nombre científico Familia Comercial / Silvestre
Departamento Municipio Vereda Colecta
Piña Ananas comosus Bromeliaceae Comercial Santander Giron Choca Agosto 3 de 2011
Arandano Vaccnium myrtillus Ericaceae Comercial Cundinamarca Chía Ocatí Junio 17 de 2011
Pera rosada PIT* PIT* Silvestre Cordoba San Carlos Arroyo grande Junio 23 de 2011
Ají dulce PIT* PIT* Silvestre Cordoba Cereté Lorito Junio 23 de 2011
Corozo Bactris minor Arecaceae Silvestre Cordoba Montería Pueblo seco Junio 23 de 2011
Carambolo Averrhoa carambola Oxiladaceae Comercial Valle La Unión - Agosto 15 de 2011
Níspero Manilkara sp. Sapotaceae Comercial Cordoba Cereté El retiro de los indios Junio 23 de 2011
Uva Vitis labrusca Vitaceae Comercial Valle del cauca La Unión - Agosto 15 de 2011
Agraz Vaccinium meridionale
Ericaceae Comercial Boyacá San Miguel - Junio 17 de 2011
Mora Rubus sp. Rubiaceae Silvestre Cundinamarca La Calera Buenos Aires Alto Julio 27 de 2011
Musgo 1 Sphagnum sp. Sphagnaceae Silvestre Cundinamarca La Calera Buenos Aires Alto Julio 27 de 2011
Musgo 2 Hypnum amabile Hypnaceae Silvestre Cundinamarca La Calera Buenos Aires Alto Julio 27 de 2011
Hepática 1 Metzgeria sp. Metzgeriaceae Silvestre Cundinamarca La Calera Buenos Aires Alto Julio 27 de 2011
Hepática 2 Trichocolea sp. Trichocoleaceae
Silvestre Cundinamarca La Calera Buenos Aires Alto Julio 27 de 2011
*En proceso de Identificación taxonómica por el Herbario de la Pontificia Universidad Javeriana (HPUJ)
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
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Tabla 9. Parámetros físico-químicos de los jugos de fruta evaluados
Peso Crisol Vacio (g)
Peso Crisol con Jugo (g)
Peso final Seco (g)
Peso Jugo (g)
Peso Agua (g)
Solidos totales (g)
% Sólidos (% m/m)
% Humedad
Densidad (g/ml)
Concentración/pozo (mg/ml)
Piña 13.2472 14.3329 13.8383 1.0857 0.4946 0.5911 54.44 45.56 1.3186 1.21
Mora silvestre 13.3879 14.4596 13.4383 1.0717 1.0213 0.0504 4.70 95.30 1.2881 13.70
Arándano 13.2536 14.1081 13.3706 0.8545 0.7375 0.117 13.69 86.31 1.2805 4.68
Pera rosada 12.1863 13.6246 12.2767 1.4383 1.3479 0.0904 6.29 93.71 1.2803 10.18
Ají dulce 13.6235 14.2414 13.7309 0.6179 0.5105 0.1074 17.38 82.62 - -
Corozo 13.5595 15.8380 14.1110 2.2785 1.727 0.5515 24.20 75.80 1.2713 2.63
Carambolo 13.2568 15.8819 13.5115 2.6251 2.3704 0.2547 9.70 90.30 1.3023 6.71
Níspero 13.1208 14.6222 13.4478 1.5014 1.1744 0.327 21.78 78.22 1.3779 3.16
Agraz 13.6777 15.781 13.9603 2.1033 1.8207 0.2826 13.44 86.56 1.3211 4.92
Uva Isabella 13.1216 14.9984 13.3412 1.8768 1.6572 0.2196 11.70 88.30 1.0622 4.54
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Figura 3. Briófitos evaluados: los musgos Sphagnum sp. y Hypnum sp. y las hepáticas Metzgeria
sp. y Trichocolea sp.
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
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Figura 4. Frutas evaluadas: Piña, mora silvestre, arándano, pera rosada, ají dulce, corozo, uva
Isabella, agraz, carambolo y níspero costeño.
Figura 5. Resultados de las pruebas antimicrobianas para los cuatro briófitos (a las dos
concentraciones activas) contra algunas de las bacterias evaluadas. Control negativo DMSO puro
y control positivo Clindamicina.
Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)
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Figura 6. Resultados de las pruebas antimicrobianas para las cuatro bayas con actividad
antibacteriana (mora silvestre, arándano, agraz y uva Isabella), contra algunas de las bacterias
evaluadas. Control negativo agua y control positivo Clindamicina.