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EXPRESION, PURIFICACION PARCIAL Y ESTUDIOS
COMPUTACIONALES DE LA IDShr PRODUCIDA EN Pichia pastoris
HOMERO SAENZ SUAREZ
TESIS DE GRADO PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AL TÍTULO
DE DOCTOR EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
Luis Alejandro Barrera A. Ph.D, Director
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE POSGRADO
Bogotá DC
Diciembre de 2005
ii
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución No. 13 de julio de 1946.
"La Pontificia Universidad Javeriana no se hace responsable por los conceptos,
criterios, opiniones y conclusiones expresados por sus alumnos, solo velará porque el
trabajo no tenga ataques personales y únicamente se vea en él, el anhelo de buscar la
verdad y la justicia".
iii
EXPRESION, PURIFICACION PARCIAL Y ESTUDIOS
COMPUTACIONALES DE LA IDShr PRODUCIDA EN Pichia pastoris
HOMERO SAENZ SUAREZ APROBADO: ___________________________ Luis Alejandro Barrera A Ph.D Director
___________________________ Julio Delgado Ph.D Jurado 1
___________________________ Felipe García Ph.D Jurado 2
___________________________
Patricia Landázuri Ph.D Jurado 3
___________________________ Orlando Acevedo Ph.D Jurado 4 ___________________________ Ramón Fayad Ph.D Jurado 5
iv
A José Alejandro y Marco Antonio Quienes Constituyen los Pilares que Soportan mi Lucha Diaria por la Vida
v
AGRADECIMIENTOS
El autor desea expresar sus agradecimientos a: El Estado Venezolano en la Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado” por el financiamiento para mi formación doctoral. La Pontificia Universidad Javeriana en el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo (IEIM) por ofrecerme la oportunidad de adquirir conocimiento y experiencias que han permitido mi crecimiento personal. El Dr. Luis Alejandro Barrera por su voluntad de aceptarme como su estudiante. El Dr. Leonardo Lareo, quien dirigió gran parte de este trabajo. Linda, mi apoyo incondicional Mi familia que me ofrendó gran parte de su tiempo. Mis compañeros de doctorado Raúl, Patricia y Olga Yaneth por su alto sentido de compañerismo. Los miembros del IEIM, los actuales y los ausentes, por su generosidad. Belarmino Sosa y familia, las manos siempre amigas, aun con la distancia. Fidelia y Teresa, quienes atendiendo el llamado Divino tuvieron que marcharse. Finalmente, a Dios Todopoderoso que me permitió llegar con vida a este día.
vi
INDICE GENERAL
PORTADA i
NOTA ACLARATORIA ii
HOJA DE APROBACION iii
AGRADECIMIENTOS iv
DEDICATORIA v
INDICE GENERAL vi
INDICE DE TABLAS x
INDICE DE FIGURAS xii
RESUMEN xiii
ABSTRACT
INTRODUCCION 1
OBJETIVOS 4
REVISION DE LITERATURA 5
Errores Innatos del Metabolismo 5
Mucopolisacaridosis Tipo II o Síndrome de Hunter 6
Estructura del Gen de la Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa 10
Ensayos Terapéuticos para el Síndrome de Hunter 10
Terapia de Reemplazo Enzimático 11
Sistemas de Expresión de Proteínas Recombinantes 15
La Enzima Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa 20
Glicosilación de Proteínas 24
Aplicación de Programas Computacionales en el Análisis de Macromoléculas 29
MATERIALES Y METODOS 31
SEPARACIÓN DE LA IDURONATO 2-SULFATO SULFATASA HUMANA
RECOMBINANTE (IDShr) EXPRESADA EN Pichia pastoris
Y Escherichia coli 31
Determinación de la Concentración de Proteínas 31
Determinación de Actividad Enzimática de la IDShr 31
Determinación de Actividad Proteolítica 32
vii
Electroforesis en Gel de Poliacrilamida 32
Western Blot 33
Producción de Anticuerpos Policlonales contra Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa
Humana Recombinante (IDShr) 33
Preparación de una Columna de Afinidad (Superosa 6 GP-anti IDShr) 34
Separación de la IDShr Expresada en Pichia pastoris 34
Concentración de Proteínas por Liofilización 35
Dializado de Muestras para Actividad IDShr 35
Ruptura Celular de Pichia pastoris 35
Separación de la IDShr Expresada en Escherichia coli. 36
EXPRESION DE LA IDURONATO 2-SULFATO SULFATASA HUMANA
RECOMBINANTE (IDShr) EN Escherichia coli EMPLEANDO EL SISTEMA
DE FUSION DE GENES GLUTATION S-TRANSFERASA (GST) 37
Plásmidos 37
Microorganismos 37
Purificación de los plásmidos 37
Separación de la Banda del cDNA de la IDSh del pUC13-IDSh 38
Digestión del plásmido pGEX 3X 39
Desfosforilación del pGEX 3X-IDSh Digerido 39
Obtención del constructo pGEX 3X-IDSh 39
Preparación de Células Competentes de E. coli 39
Transformación en E. coli competentes 40
Bancos de E. coli 40
Expresión de la IDShr en Escherichia coli JM109-pGEX 3X. 41
ANALISIS COMPUTACIONAL DE LA ENZIMA IDURONATO 2 SULFATO
SULFATASA HUMANA (IDSh) 41
Acceso Computacional a la Secuencia de IDSh 41
Accesibilidad, Hidrofobicidad, Flexibilidad 41
Punto Isoeléctrico y Peso Molecular 41
Sitios de Fosforilación 41
Sitios de Glicosilación 41
viii
Bloques y Prints 42
Perfil de Antigenicidad 42
Alineamientos 42
Estructura Secundaria 42
Estructura Terciaria 42
Modelo Estructural del Sitio Activo 43
Análisis de las Mutaciones Puntuales 43
RESULTADOS 44
SEPARACIÓN DE LA IDURONATO 2-SULFATO SULFATASA HUMANA
RECOMBINANTE (IDShr) EXPRESADA EN Pichia pastoris Y Escherichia
coli 44
Determinación de la Concentración de Proteínas 44
Determinación de Actividad Enzimática de la IDShr 44
Producción de Anticuerpos Policlonales Contra la Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa
Humana Recombinante (IDShr) 44
Preparación de una Columna de Afinidad (Superosa 6 GP-anti IDShr) 49
Separación de la IDShr Expresada en Pichia pastoris 50
Separación de la IDShr Expresada en Escherichia coli 59
EXPRESION DE LA IDURONATO 2-SULFATO SULFATASA HUMANA
RECOMBINANTE (IDShr) EN Escherichia coli EMPLEANDO EL SISTEMA
DE FUSION DE GENES GLUTATION S-TRANSFERASA (GST) 64
ANALISIS COMPUTACIONAL DE LA IDURONATO 2 SULFATO SULFATASA HUMANA (IDSh) 64
Hidrofobicidad, Accesibilidad y Flexibilidad. 65
Punto Isoeléctrico y Peso Molecular 65
Sitios de Fosforilación 65
Sitios de Glicosilación 69
Bloques y Prints 71
Alineamientos 71
Estructura Secundaria 73
Estructura Terciaria 84
ix
Modelo Estructural y Funcional para el Sitio Activo 89
Cálculo del “Root Mean Square” (RMS) 94
Perfil de Antigenicidad 94
Modelo de Estructura Terciaria de la IDSh Con la Secuencia del Péptido Señal 96
Análisis de las Mutaciones Puntuales 103
Efecto de las Mutaciones Estudiadas Sobre la Estructura Terciaria de la IDSh 109
DISCUSION 111
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 129
BIBLIOGRAFIA 131
x
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación de las Mucopolisacaridosis (MPS) 7
Tabla 2. Efecto de Procesos de Congelación-Descongelación sobre
la Actividad de IDS plasmática 45
Tabla 3. Concentración y Título de Anticuerpos Policlonales Anti-IDShr
(IgG) Obtenidos en Conejo 46
Tabla 4. Cuadro Resumen de Ensayo para Demostrar Capacidad de
Inmunoreconocimiento de una Columna de Superosa 6 GP anti-IDShr 49
Tabla 5. Condiciones Experimentales de los cultivos M-7 y M-13
de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 50
Tabla 6. Resultados Obtenidos para Algunos Parámetros de los Cultivos
M-7 y M-13 de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 51
Tabla 7. Niveles de Proteínas Durante el Proceso de Ultrafiltración de
Sobrenadantes de Cultivos de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 51
Tabla 8. Efecto de la Diálisis Sobre la Actividad IDShr en las Diferentes
Fracciones Obtenidas Durante el Proceso de Ultrafiltración 53
Tabla 9. Concentración de Proteínas Mediante Liofilización y su Efecto
Sobre la Actividad de la IDShr en Fracciones Obtenidas por Ultrafiltración. 53
Tabla 10. Actividad Enzimática de Fracciones de IDShr Separadas por
Cromatografía de Afinidad (Superosa 6 GP-anti-IDS) 54
Tabla 11. Separación de la IDShr Expresada en Pichia pastoris
GS115 pPIC9-IDS/28 57
Tabla 12. Cuantificación Mediante ELISA de IDShr Expresada en
Pichia pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 Durante las Fases del Proceso de
Ultrafiltración 58
Tabla 13. Actividad IDShr en cultivos de E. coli JM109-pUC-13/IDS en
tres niveles de escalado 61
Tabla 14. Niveles de Proteínas y Actividad IDshr en E. coli
JM 109-pUC 13/IDS Durante el Proceso de Ultrafiltración de
Sobrenadantes y en Lisados 61
xi
Tabla 15. Separación Cromatográfica de IDShr Expresada en E. coli 62
JM 109 pUC-13/IDS
Tabla 16. Separación de IDShr Expresada en E. coli JM109-pUC-13/IDS 63
Tabla 17. Predicción Computacional de la Estructura Secundaria de la
IDSh Mediante 11 Programas de Predicción de Estructura de Proteínas 73
Tabla 18. Aminoácidos del Sitio Activo de ARSA, ARSB e IDS 90
Tabla 19. Relación Entre la Severidad Fenotípica del Síndrome de Hunter y la Naturaleza y Ubicación del Aminoácido Mutado
en 114 Mutaciones Puntuales de la IDSh 106
xii
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Algunos Síntomas Asociados al Síndrome de Hunter 9
Figura 2. Mecanismo de Conversión de Císteína a Formil-glicina 21
Figura 3. Procesamiento de la IDS 21
Figura 4: Detección Mediante Western-blot. de la IDShr Expresada en E. coli 23
Figura 5. Detección Mediante Western-blot de la IDShr Expresada in
P. pastoris 24
Figura 6. Electroforesis del Anticuerpo Policlonal anti-IDShr 46
Figura 7. Especificidad del Anticuerpo Policlonal Anti-IDShr 47
Figura 8. Western blot de Sobrenadante de E. coli 47
Figura 9. Cromatografía de Afinidad para la IDShr Expresada
en P. pastoris 48
Figura 10. Electroforesis PAGE-SDS 12% de Sobrenadante de
Cultivo de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 e IDShr pura (TKT) 52
Figura 11. Cromatograma de Exclusión Molecular de Retentado de
Ultrafiltración de Cultivos de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 55
Figura 12. Cromatografía de Afinidad para la Separación IDShr
Expresada en P. pastorisGS115 pPIC9-IDS/28 56
Figura 13. Cromatograma de Exclusión Molecular de Retentado de
Ultrafiltración de Cultivos de E. coli JM 105 pUC13-IDS/28 60
Figura 14. Secuencia aminoacídica de la IDSh 64
Figura 15. Perfil de Hidrofobicidad de la IDSh 66
Figura 16. Perfil de Accesibilidad de la IDSh 67
Figura 17. Perfil de Flexibilidad de la IDSh 68
Figura 18. Sitios Potenciales de Fosforilación (Presencia de T y Y) en la IDSh 69
Figura 19. Sitios Potenciales de O-glicosilación (Presencia de T, S o Y) en la
IDSh 70
Figura 20. Sitios potenciales de N-glicosilación en la IDSh 70
Figura 21. Alineamiento de la IDSh con la Arilsulfatasa B 72
Figura 22. Alineamiento de la IDSh con la Arilsulfatasa A 72
xiii
Figura 23. Predicción de la Estructura Secundaria de IDSh. 82
Figura 24. Predicción de un Fragmento de la Estructura Terciaria de la IDSh. 85
Figura 25. Predicción de un Segmento de la Estructura Terciaria de la IDSh. 85
Figura 26. Modelo Propuesto para la Estructura Terciaria de la IDSh 86
Figura 27. Predicción de la Estructura Terciaria de la IDSh. 87
Figura 28. Sitios Potenciales N-glicosilación en la Forma Madura de la IDSh 88
Figura 29. Ubicación de los Sitios potenciales N-glicosilación en
la forma madura de la IDSh. 89
Figura 30. Localización de los Aminoácidos (rojo/azul) que
Componen el Sitio Activo de la IDSh. 91
Figura 31. Molécula de Heparan Sulfato 92
Figura 32. Heparan Sulfato en el Sitio Activo de la IDSh. 93
Figura 33. Ubicación del Manganeso en el Sitio Activo de la IDSh. 94
Figura 34. Perfil de Antigenicidad de la IDSh 95
Figura 35. Ubicación en el Modelo de Estructura Terciaria de la IDSh de Cuatro Péptidos Diseñados para la Producción de Anticuerpos IgY anti-IDShr 96
Figura 36. IDSh conteniendo el Péptido Señal 98
Figura 37. Perfil de Hidrofobicidad del α-MF 99
Figura 38. Perfil de Hidrofobicidad del Péptido Señal. 99
Figura 39. Perfil de Hidrofobicidad de la IDSh con el Péptido Señal. 100
Figura 40. Perfil de Flexibilidad del Péptido Señal 100
Figura 41. Perfil de Flexibilidad de la IDSh con Péptido Señal 101
Figura 42. Western blot de Sobrenadantes y Lisados de P. pastoris pPIC-9/IDS
del cultivo M-22 101
xiv
RESUMEN
Con el propósito de mejorar las condiciones de expresión y purificación de la IDShr
expresada en P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 y E. coli pUC 13-IDS/28 se adelantó el
presente trabajo que contempló una parte experimental y otra computacional. Con relación a
la parte experimental se empleó como método de detección de la IDShr una prueba
fluorométrica con el uso del sustrato MU-αIdoA-2S, que permitió comprobar que la IDShr
expresada en esos modelos biológicos era activa. Empleando como antígeno IDShr
purificada y donada por TKT, se obtuvo en conejos un anticuerpo policlonal anti-IDShr, el
cual fue empleado para la elaboración de una columna de afinidad, usada durante el proceso
de purificación.
Se realizaron 20 cultivos P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 a nivel de biorreactor con
volúmenes de trabajo de 1.0 a 3.0 litros. Los cultivos fueron centrifugados y los
sobrenadantes sometidos a ultrafiltración empleando secuencialmente membranas para
exclusión de moléculas de 100 y 30 KDa. Los retentados de esta manera obtenidos fueron
corridos en cromatografía de exclusión molecular y los picos con actividad IDShr se
sometieron a cromatografía de afinidad. Las fracciones obtenidas con un nivel de siete
purificaciones y menos del 2% de recuperación mostraron actividades enzimáticas hasta de
58,78 nmol/h/mg de proteína, es decir, más de 4 y 9 veces los valores de referencia del
laboratorio del IEIM para la IDSh plasmática y leucocitos. Sin embargo, estos valores no
cumplen las expectativas para la producción de la enzima recombinante en cantidades
clínicamente útiles. La cuantificación de IDShr por ELISA, mostró que menos del 1%
corresponde a IDShr. Lo anterior demuestra que el nivel de expresión en P. pastoris fue bajo.
Igualmente en E. coli pUC 13-IDS/28 los niveles de actividad y expresión fueron bajos. En
los dos casos más del 60% de las proteínas totales se encontraron en el ultrafiltrado final
(menor a 30 KDa) y presentaron actividad IDShr, lo cual posiblemente se deba a actividad
proteolítica que genera fragmentos que mantienen parte del sitio activo y pueden presentar
actividad enzimática
En busca de mejorar el sistema de expresión fue clonado el cDNA de la IDSh empleando el
plásmido de expresión pGEX 3X y se expresó la IDShr en E. coli JM109 bajo el sistema
xv
GST, lográndose obtener 17.28 ng de IDShr/mg de proteína, el paso siguiente lo constituye la
purificación de la enzima por cromatografía de afinidad.
El análisis computacional permitió la obtención de información de la IDSh acerca de sus
perfiles de hidrofobicidad, flexibilidad, accesibilidad y antigenicidad, punto isoeléctrico,
peso molecular, sitios potenciales de fosforilación, O y N-glicosilación, prints, bloques y
alineamientos con otras moléculas con similaridades a la IDSh. Esta información fue
empleada para la elaboración de modelos computacionales de predicción de las estructuras
secundaria, terciaria y sitio activo. El modelo de estructura terciaria permitió el diseño
exitoso de péptidos específicos para la producción de anticuerpos IgY anti-IDShr.
Se logró establecer que el constructo pPIC 9-IDS/28 contiene los 25 residuos del péptido
señal y los 8 aminoácidos del propéptido. Estos residuos debieron ser eliminados, pues el
constructo contiene la señal de secreción α-MF, constituyen una zona altamente hidrofóbica
que cubre la entrada al bolsillo que contiene los aminoácidos que constituyen el sitio activo.
Lo anterior permite explicar los bajos niveles de expresión de IDShr, dado que esos residuos
adicionales deben alterar la conformación de la enzima recombinante con consecuencias
directas en su plegamiento. Al no encontrarse correctamente plegada la proteína es retenida,
no puede abandonar el retículo endoplásmico y es factible que se degrade a nivel de los
proteosomas. Se lisaron células de P. pastoris y se encontraron intracelularmente actividades
hasta de 4.24 nmol/h/mg de proteína, en un cultivo que en los sobrenadantes había sido
detectada actividad IDShr de 3.25 nmol/h/mg. Algunas moléculas pueden escapar al sistema
de control y son secretadas. Dos o más de estas moléculas pueden asociarse por las regiones
hidrofóbicas y este tipo de asociaciones explican la presencia, en Western blot de
sobrenadantes, de bandas correspondientes a pesos aproximados a 120 KDa.
El análisis de las mutaciones puntuales asociadas al modelo de estructura terciaria permitió
contribuir al establecimiento de una relación genotipo-severidad de la enfermedad.
Palabras Clave: IDShr, Hunter, Estructura terciaria, P. pastoris, E. coli
xvi
ABSTRACT This work was carried out in order to improve the expression conditions and purification of
the hrIDS in and E. coli JM109/pUC13-IDS-28. The work comprises two parts an
experimental and a computational one. In relation to the experimental part, a fluorometric
test using MU-αIdoA-2S as substrate was used for the detection of the hrIDS, this test was
used in order to check that the hrIDS expressed in those biological models was biologically
active. Using as antigen the purified hrIDS (donated by TKT), a polyclonal antibody against
α-hrIDS was obtained in rabbit, this was used to make an affinity chromatography column,
that was employed in the purification trials.
Twenty cultures of P. pastoris GS115/pPIC9-IDS-28 were carried out used working volumes
from 1.0 to 3.0 liters. The supernatants were sequentially ultra-filtrated, using membranes
with molecular exclusion between 30 and 100 kDa. The retained fractions were resolved in
molecular size exclusion chromatography and the collected material showing hrIDS activity
were submitted to affinity chromatography. The obtained fractions with a purity degree of
seven and less than 2% recovery showed enzymatic activities up to 58.78 nmol/h/mg of
protein, that is to say, more than 4 and 9 times our reference values for the hIDS in plasma
and leukocytes. However, these values do not meet the expectations for the production of the
recombinant enzyme in quantities clinically useful. The ELISA quantification of hrIDS,
showed that less than 1% corresponds to hrIDS. This demonstrates that the expression level
in P. pastoris was low. In E. coli/pUC13-IDS-28 the activity levels and expression were low.
In the two cases more than 60% of the total proteins with hrIDS activity were in a fraction of
less than 30 KDa,. These active fragments could be possibly due to proteolitic action, which
generate peptides that retain part of the active site of the enzyme.
In search of improving the expression system, the cDNA of the hIDS was cloned using the
expression vector pGEX 3X. The construct (pGEX 3X-IDS) was transformed and expressed
in JM109 under the GST system, allowing us to obtain 17.28 ng hrIDS/mg of protein.
The computational analysis allowed us to obtain the information about the hydrophobicity,
flexibility, accessibility, antigenicity profiles and isoelectric point, molecular weight,
xvii
potential sites of phosphorilation, O- and N-glicosilación of hIDS, prints, blocks and
alignments with other molecules with some similarities to the hIDS. This information was
employed for the elaboration of computational models and for the prediction of the
secondary, tertiary and active site structures.
The terciary structure pattern allowed the successful design of specific peptides for the
production of IgY antibodies against hrIDS.
It was established that the construct pPIC9-IDS-28 contains the 25 aminoacids of signal
peptide and the 8 amino acids of the pro-peptide. Those residues must be eliminated from the
construct because it contains the signal of secretion of α-MF and for that reason constitute a
highly hydrophobic area that may hinder the entrance of the substrate to the pocket that
contains the amino acids that constitute the active site. Thes findings may explain the low
level of expression of hrIDS, because those additional residues should alter the conformation
of the recombinant enzyme leading to an inappropriate folding. When the protein is not
correctly folded it is retained within the endoplasmic reticulum and it is possibly digested at
the proteosome. P. pastoris cells were lised and we found intracellular activities up to 4.24
nmol/h/mg, were found whereas hrIDS activity in the supernatant was 3.25 nmol/h mg. We
then postulate that some molecules may escape from the control system and are released
from the cell. Two or more of these molecules can be associated through the hydrophobic
regions which would explains the presence, in the supernatants Western-Blot, several bands
of a MW close to 120 kDa.
The analysis of the point mutations, and its affection the tertiary structure, allowed to draw
some retarlations between genotype and the severity of the disease .
Keywords: hrIDS, Hunter, Structures third, P. pastoris, E. coli
INTRODUCCION
En el Síndrome de Hunter o mucopolisacaridosis tipo II (MPS II) (McK 309900),
existe deficiencia de la enzima Iduronato 2-Sulfato-Sulfatasa (IDS) (E.C. 3.1.6.13),
ocasionando con ello, acumulación tisular de heparán sulfato y dermatán sulfato,
además de excreción urinaria de los mencionados glicosaminoglicanos. Las
consecuencias de ésta deficiencia enzimática se traducen en cuadros clínicos con facies
toscas, disostosis múltiple, deformidades esqueléticas, hepatoesplenomegalia, estatura
corta, hipertensión pulmonar, alteraciones en el miocardio, retardo mental y muerte
prematura (1).
En esta enfermedad, como en otros errores innatos del metabolismo, el defecto se halla
a nivel del gen que codifica para la enzima, lo cual la convierte en una patología
intratable mediante la terapéutica convencional. Por consiguiente, el manejo de la MPS
II, tradicionalmente ha sido dirigido a tratar de corregir las manifestaciones clínicas de
la enfermedad. En tal sentido se ha utilizado, el uso de audífonos, fisioterapia y terapia
ortopédica. Sin embargo, el tratamiento ideal para la MPS II, como para la mayoría de
los errores innatos del metabolismo, debe ser aquel que pueda implementarse en etapas
tempranas de la vida, lo cual permitirá prevenir las secuelas a largo plazo. En este
sentido, dada la urgente necesidad humana en que se ha convertido la búsqueda de
nuevas medidas terapéuticas para enfermedades corrientemente intratables, como las
genéticas, laboratorios académicos, farmacéuticos y de biotecnología orientan sus
intereses, en gran medida, en el estudio de alternativas clínicas para los pacientes con
este tipo de patologías. Con relación a esto, se ha tratado a los pacientes, mediante
infusión de plasma normal, sin embargo, dicha terapia ha resultado muy costosa.
Adicionalmente, se ha probado el transplante alogénico de médula ósea, lo cual ha
permitido la corrección metabólica en algunos tejidos, sin embargo, la escasa
disponibilidad de donantes, las complicaciones inmunológicas, la alta tasa de mortalidad
de los pacientes transplantados y la poca eficiencia en la prevención de la progresión del
deterioro neurológico en pacientes con fenotipo severo, ha limitado su aplicación.
2
Los hallazgos biotecnológicos de los últimos años, han proporcionado la base
experimental para implementar estudios conducentes a buscar el desarrollo de
terapéuticas tales como reemplazar los genes defectuosos, es decir, terapia génica o
bien, proveer la enzima o proteína deficiente a los tejidos en los cuales es deficiente, es
decir, terapia de reemplazo enzimático (TRE).
La terapia de reemplazo enzimático ha sido exitosa en el tratamiento de enfermedades
como la inmunodeficiencia combinada severa (SCID) para la cual se emplea la
adenosina deaminasa (AD) de bovino, la enfermedad de Gaucher tipo I en la cual se
utiliza la β-glucocerebrosidasa, la enfermedad de Fabry en cuyo caso se le proporciona
al paciente la α-Galactosidasa y MPS I con la utilización de la α-L-iduronidasa. Así
mismo existen protocolos de TRE para enfermedades metabólicas, como las hemofilias
A y B, ocasionadas por deficiencia de los factores de coagulación VIII y IX, las
deficiencias de α1-antitripsina, hormona del crecimiento y enzimas pancreáticas en la
fibrosis quística. Se estan llevando a cabo ensayos clínicos de TRE para un número
importante de enfermedades de depósito lisosomal, tales como, Pompe, Niemann-Pick
tipo B, Wolman, las MPS VII, VI y IVA, las cuales son enfermedades de
almacenamiento lisosomal causadas por deficiencia de las enzimas, α-glucosidasa,
esfingomielinasa, lipasa ácida, β-glucuronidasa, N-acetilgalactosamina 4-sulfato
sulfatasa y N-acetilgalactosamina-6-sulfato-sulfatasa, respectivamente y de otras
patologías no lisosomales como el angioedema hereditario en el cual existe deficiencia
del inhibidor de la C1-esterasa y la enfermedad de pénfigo vulgar en donde se presenta
una respuesta autoinmune a la desmogleina-3. En el caso de la MPS II el uso de enzima
recombinante producida en células CHO está aprobado para Europa.
El potencial uso de enzimas en TRE exige la obtención y purificación de proteínas en
cantidades necesarias para los estudios de estructura, función, estabilidad,
direccionamiento, antigenicidad y pruebas pre-clinicas. La obtención a partir de sus
fuentes naturales ha sido difícil y laboriosa. Los bajos volúmenes obtenidos, los altos
costos, los largos períodos de tiempo empleados y los avances en el conocimiento de la
estructura, función, regulación y manipulación de los genes, han dado paso, a la
3
producción de proteínas en modelos biológicos mediante la tecnología del ADN
recombinante, con el fin de obtener un producto similar al humano. Los resultados de
estudios recientes, presentan a la levadura metilotrófica Pichia pastoris y la bacteria
Escherichia coli como buenos modelos de expresión de proteínas humanas con fines
clínicos.
Aunque la TRE resulta una alternativa terapéutica factible, los costos de esta terapia,
para las enfermedades que existe, son extremadamente altos. Para mejorar esta situación
y contribuir a que la TRE se coloque al alcance de pacientes de escasos recursos, el
Instituto de Errores Innatos del Metabolismo (IEIM) de la Pontificia Universidad
Javeriana, desde hace varios años orienta gran parte de los esfuerzos investigativos a
generar información para implementar protocolos de TRE para mucopolisacaridosis,
entre ellas, el síndrome de Hunter. El presente trabajo se orientó a la purificación de la
IDShr y el análisis computacional de la enzima, puesto que no existen reportes
experimentales acerca de sus estructuras secundaria, terciaria ni de su sitio activo. El
empleo de programas computacionales que tienen como base la información acumulada
en bases de datos como Gen Bank, ExPASy y EMBL, permitió, mediante modelación
homóloga, el desarrollo de modelos computacionales de predicción de la estructura y
funcionabilidad de la proteína. La información generada por el análisis computacional
permitió explicar el comportamiento de la proteína recombinante y entender resultados
experimentales de los procesos de expresión en Pichia pastoris y Eschericia coli y
purificación de la enzima heteróloga. Además, contribuirá a orientar la futura
experimentación. Por ejemplo, el desarrollo de nuevos constructos para la expresión y
los estudios del comportamiento de la molécula en el proceso de direccionamiento a los
tejidos de los pacientes Hunter.
4
OBJETIVOS
Objetivo General
Lograr avances en la modelación computacional de la estructura de la IDSh y en los
procesos de expresión y purificación de la proteína recombinante expresada en
P. pastoris y E coli con miras a la producción de mayores cantidades de enzima
activa para uso en TRE en pacientes con el Síndrome de Hunter.
Objetivos específicos 1. Adaptar un método fluorométrico usado en la determinación de la enzima en plasma
para la detección de IDShr en muestras de P. pastoris y E. coli.
2. Mejorar el sistema de purificación de la IDShr mediante la producción de un
anticuerpo policlonal y su empleo en cromatografía de afinidad.
3. Implementar un sistema de purificación de la IDShr más rápido y sencillo
introduciendo dos etapas de ultrafiltración, una de exclusión molecular y una de
cromatografía de afinidad.
4. Contribuir al mejoramiento del sistema de expresión y purificación de la IDShr en
E. coli empleando el sistema GST.
5. Obtener información computacional de la IDSh con respecto a los perfiles de
hidrofobicidad, accesibilidad, flexibilidad, antigenicidad, el punto isoeléctrico, el
peso molecular, los potenciales sitios de fosforilación, N- y O-glicosilación,
bloques, prints y alineamientos con moléculas cuya estructura terciaria está
determinada experimentalmente.
6. Emplear la información computacional obtenida para la elaboración de modelos de
las estructuras secundaria, terciaria y sitio activo de la IDSh.
7. Emplear la información computacional obtenida para el mejoramiento del sistema
de expresión y purificación de la IDShr
8. Contribuir al establecimiento de una relación genotipo-severidad en la enfermedad
de Hunter.
5
REVISIÓN DE LITERATURA
Errores Innatos del Metabolismo Los errores innatos del metabolismo (EIM), son desórdenes bioquímicos causados por
defectos en la estructura o función de proteínas, producto de alteraciones a nivel de los
genes que codifican para dichas biomoléculas. Existen cerca de 550 patologías
asociadas a EIM y aunque no son muy frecuentes, tomados como grupo pueden afectar
al 1% de los recién nacidos (1).
La gran mayoría de estas enfermedades se producen por mutaciones que alteran la
expresión fenotípica de proteínas. Pueden presentarse por defectos en una sola enzima
como la fenilalanina-hidroxilasa en la fenilcetonuria o involucrar varias enzimas como
en el Síndrome de Zellweger, en cuyo caso varias peroxinas pueden estar afectadas.
Puede generarse disfunción de un transportador como la cistinosina en la cistinosis,
defecto en un receptor como el de las LDL en la hipercolesterolemia familiar o
deficiencia de una hormona como en el hipotiroidismo (1). Una clasificación
fisiopatológica (2), ubica a las enfermedades metabólicas en tres grandes grupos. El
primero comprende los desórdenes de complejos moleculares como los desórdenes
lisosomales, peroxisomales, síntesis de colesterol y otros. El segundo grupo abarca los
defectos del metabolismo intermediario que conducen a intoxicación, tales como los
defectos del ciclo de la urea, aminoacidopatías (fenilcetonuria, homocistinuria,
tirosinemia, etc), acidemias orgánicas (propiónica, metilmalónica, isovalérica, etc). El
último grupo incluye entidades con síntomas debidos a deficiencias energéticas, como
son las glicogenosis, defectos en la oxidación de ácidos grasos o desórdenes en la
cadena respiratoria.
A pesar de tratarse de enfermedades relativamente raras, el estudio de los EIM está
indicado en casos en que el paciente presenta crisis neonatales, retardo o regresión del
desarrollo psicomotor, problemas óseos generalizados, facies toscas, anormalidades
oculares, organomegalia, hipoglicemia, convulsiones, acidosis o hiperamonemia de
difícil manejo, cuerpos cetónicos, azúcares reductores o cristales raros en orina, olores
extraños (moho, mantequilla rancia, pies sudados, jarabe quemado o pescado
6
descompuesto) o asociación de las crisis con ingesta de proteínas, carbohidratos,
productos lácteos o cuando existan antecedentes familiares de dichas enfermedades (3).
Puesto que en las enfermedades metabólicas hay bloqueo de una o varias rutas del
metabolismo normal, la ausencia o acumulación de metabolitos específicos, constituye
la base de las pruebas de laboratorio (3), que junto con las manifestaciones clínicas
permiten el diagnóstico de estas enfermedades. La mayoría de los EIM son
enzimopatías, las cuales generalmente se heredan en forma recesiva y usualmente se
necesitan niveles menores al 10% de la actividad metabólica normal, para que existan
manifestaciones clínicas. Debido a que estas entidades se generan por alteraciones a
nivel genético, no existe tratamiento farmacológico convencional y su manejo
tradicionalmente, está dirigido a corregir o prevenir algunas manifestaciones clínicas,
por ejemplo, el empleo de dietas, en el caso de las acidemias orgánicas y los desórdenes
de aminoácidos (2) o el transplante de córnea, el uso de audífonos y la terapia
ortopédica en las mucopolisacaridosis (4,5).
Mucopolisacaridosis Tipo II o Síndrome de Hunter
Las mucopolisacaridosis (MPS) son EIM en los cuales existe deficiencia de alguna de
las hidrolasas lisosómicas que catalizan la degradación de mucopolisacáridos, más
corrientemente denominados glucosaminoglicanos (GAG). Considerando la enzima
deficiente, estas enfermedades se clasifican en siete grupos (Tabla 1). Cuando existe
deficiencia de la Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa (IDS), corresponde al tipo II (MPS II) y
es conocida como Síndrome de Hunter (McK 309900), puesto que Charles Hunter fue
quien la describió por primera vez en 1917 (1). La deficiencia enzimática origina,
excreción urinaria y acumulación sistémica de heparán y dermatán sulfato a nivel
lisosomal (2).
7
Tabla 1. Clasificación de las Mucopolisacaridosis (MPS)1.
MPS Epónimo Enzima Deficiente GAGs Acumulados Manifestaciones Clínicas
Tipo IH Hurler α-L-Iduronidasa Dermatán y Heparán sulfato Opacidad corneal Disostosis multiple
Organomegalia Enfermedad cardíaca Muerte en infancia
Tipo IS Scheie α-L-Iduronidasa Dermatán y Heparán sulfato Opacidad corneal
Rigidez articular Inteligencia normal
Tipo IH/S Hurler/Scheie α-L-Iduronidasa Dermatán y Heparán sulfato Fenotipo intermedio entre IH y IS
Tipo II Hunter (leve) Iduronato sulfatasa (IDS) Dermatán y Heparán sulfato Inteligencia normal Corta estatura
Supervivencia 20-60 años
Tipo II Hunter (severa) Iduronato sulfatasa (IDS) Dermatán y Heparán sulfato Disostosis múltiple Organomegalia
Muerte antes de 15 años Tipo IIIA Sanfilippo A Heparan N-sulfatasa
(Sulfamidasa) Heparán sulfato Deterioro mental profundo.
Hiperactividad. Manifestaciones somáticas medias.
Tipo IIIB Sanfilippo B α-N-acetil glucosaminidasa Heparán sulfato Fenotipo similar a IIIA
Tipo IIIC Sanfilippo C Acetil-CoA:α-glucosamida acetiltransferasa
Heparán sulfato Fenotipo similar a IIIA
Tipo IIID Sanfilippo D N-acetil glucosamina 6 sulfatasa
Heparán sulfato Fenotipo similar a IIIA
Tipo IVA Morquio A N-acetil galactosamina 6 sulfatasa (GALNS)
Queratán y Condroitín sulfato
Deformidades esqueléticas Hipoplasia odontoide
Opacidad corneal Tipo IVB Morquio B β-galactosidasa Queratán sulfato Espectro similar a IVA
Tipo V No existe
Tipo VI Maroteaux Lamy Arilsulfatasa B Dermatán sulfato Disostosis múltiple Opacidad corneal
Inteligencia normal
Tipo VII Sly β–glucuronidasa (GUSB) Dermatán, Heparán y Condroitín sulfato
Disostosis múltiple Hepatoesplenomegalia
Amplio espectro de severidad incluyendo hidrops fetalis
VIII No existe Hialuronidasa
1 Tomado de Sáenz H et al, 2004.
8
Los GAG constituyen el mayor componente de la matriz no fibrosa del tejido conectivo
y se encuentran en grandes cantidades en el cartílago, hueso, vasos sanguíneos,
válvulas cardíacas, piel, tendones, córnea y en pequeñas cantidades en otros órganos
como el hígado y el cerebro (6). Químicamente, estos heteropolisacáridos están
compuestos por residuos de hexosaminas y ácidos urónicos. En el caso de heparán
sulfato, sus unidades monoméricas son N-acetilglucosamina y ácido L-idurónico,
encontrándose excepcionalmente el ácido D-glucurónico, mientras que en el
dermatán sulfato son N-acetilgalactosamina 4-sulfato y acido L-idurónico. La IDS
cataliza la reacción de remoción del sulfato en posición C-2 del ácido L-idurónico
presente en el heparán sulfato y el dermatán sulfato (1). La deficiencia de esta reacción
no permite la degradación normal de los mencionados GAG y explica su acumulación
intralisosomal y excreción urinaria. Estas dos alteraciones fisiológicas permiten el
diagnóstico de la enfermedad a nivel de laboratorio, con el hallazgo de estos GAG en
orina y la determinación de la actividad de la enzima en plasma y células como
leucocitos o fibroblastos (2).
Las consecuencias del defecto molecular se traducen en cuadros clínico que presentan
características, en grado variable, en un crónico y progresivo curso que involucra facies
toscas, disostosis múltiple, pecho en quilla, cráneo alargado, corta estatura, mano en
garra, genu valgum, limitaciones del movimiento articular, hepatomegalia,
hipertricosis, macroglosia, sordera neurosensorial y hernias inguinales o umbilicales
(Figura 1) (7). Se han descrito tres presentaciones clínicas de la enfermedad: moderada,
intermedia y severa. En la forma leve o moderada, a diferencia de las formas
intermedia y severa, no hay compromiso de la esfera mental y los pacientes sobreviven
cinco o seis décadas, con aparición tardía de la sintomatología, mientras que en la
forma intermedia los síntomas aparecen más tardíamente que en la forma severa, en la
cual se presentan las manifestaciones clínicas entre los dos y cuatro años de edad,
además del retardo mental los afectados presentan alteraciones del comportamiento y
generalmente, muerte antes de la adolescencia (7).
9
A B
C D Figura 1. Algunos Síntomas Asociados al Síndrome de Hunter. Son evidentes la hepatomegalia (A), facies toscas (B), mano en garra (C), lesiones dérmicas nodulares (D).
La incidencia de la enfermedad para Israel se reportó con una frecuencia de
1:34.000 en hombres nacidos vivos (8), en el Reino Unido, se estimó en 1:132.000 (9),
10
en Australia 1:165.000 (10) y en la Columbia Británica en 1:111.000 (11), mientras
que para Colombia no existen datos de prevalencia de la enfermedad.
Estructura del Gen de la Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa
El Síndrome de Hunter es una enfermedad ligada al cromosoma X y el gen de la IDS
está ubicado citogenéticamente en la región Xq28 (12). El gen de la IDSh tiene
aproximadamente 24 kb que comprenden nueve exones y ocho intrones (12-14). Un
cDNA de 2,3 Kb codifica la secuencia completa de 550 aminoácidos de la IDSh (12).
En la región del promotor no se encuentran secuencias del tipo cajas TATA o CAAT,
sin embargo, se hallan dos secuencias consenso GC, esto es consistente con la
característica de dicho gen de presentar bajos niveles de transcripción (13). De otro
lado, se ha reportado un pseudogen (IDS2), localizado a 20 Kb del gen de la IDS y
aunque tiene secuencias homólogas a los exones 2 y 3 y a los intrones 2, 3 y 7 del gen
de la IDS, su función es desconocida (15).
Para la IDSh se han reportado 309 mutaciones, de las cuales 167 son puntuales, 27 por
“splicing” alternativo, 55 pequeñas delecciones, 23 pequeñas inserciones, 2 indels, 8
rearreglos y una duplicación (7,16-39). La literatura no reporta estudios que establezcan
el efecto de las mutaciones sobre la funcionalidad enzimática y el fenotipo en pacientes
con síndrome de Hunter.
Ensayos Terapéuticos para el Síndrome de Hunter En la MPS II, como en la mayoría de los EIM la alteración se encuentra en el gen, por
lo cual no existe tratamiento farmacológico y esto la convierte en una enfermedad
incurable. Sin embargo, se han intentado terapéuticas como el transplante de médula
ósea (40-43), que no ha resultado exitoso al no lograrse la regresión de los síntomas ni
detener la progresión del deterioro mental, además de los riesgos infectocontagiosos y la
dificultad de conseguir donantes histocompatibles. El tratamiento con intercambio de
plasma (44), tampoco demostró beneficio clínico alguno, a pesar que hubo un aumento
en la actividad de la enzima plasmática. Por otro lado, el transplante de fibroblastos
(45), aunque generó aumento en la actividad de la enzima y el correspondiente
11
incremento en la degradación del heparán sulfato y dermatán sulfato, igualmente resultó
poco efectivo. De otro lado, cuando se utilizó IDS obtenida a partir de orina humana se
observó una disminución en los niveles intralisosomales de GAG (46), sin llegar a
convertirse en la medida terapéutica ideal. Otros intentos de terapia los han constituido
los implantes subcutáneos de membrana amniótica (47) y de células madres
hematopoyéticas (48). Actualmente, se adelanta el primer TRE en humanos (49).
Después de los ensayos en el modelo animal, un ratón knockout (ids-KO) obtenido por
delección del exon 4 y parte del 5 y de pruebas en monos, Muenzer y colaboradores
(49), han evaluado en 12 pacientes, tres dosis (0.15, 0.5 y 1.5 mg/Kg) de IDShr
producida en células CHO. Posteriormente, se aumento el número de pacientes a 45 y
mas recientemente a 96, con dosis semanales de enzima recombinante de 0.5 mg/kg de
peso corporal. En todos los casos se ha observado disminución en los depósitos
lisosomales de glicosaminoglicanos y reducción de los mismos en orina.
Trabajos recientes in vitro, empleando vectores virales han mostrado diferentes niveles
de eficiencia en la disminución de los depósitos de GAG en células deficientes en IDS
(50-57). Así mismo, se han adelantado algunos protocolos para suplir IDS a células
cultivadas deficientes en la enzima y se han logrado importantes niveles de corrección
empleando proteína recombinante suplementada a neuronas y células gliales (56),
fibroblastos, células COS y linfoblastoides (58-61).
Los resultados obtenidos hasta ahora, demuestran que células normales o transformadas
para producir IDShr, secretan al medio la enzima y que está puede ser captada por otras
células mediante receptores de superficie como el receptor de manosa 6-fosfato (58-61).
Luego la enzima es endocitada hasta los lisosomas y allí puede catalizar la hidrólisis de
heparán sulfato y dermatán sulfato. Lo anterior, convierte al síndrome de Hunter en una
enfermedad potencialmente tratable mediante TRE.
Terapia de Reemplazo Enzimático El tratamiento ideal para enfermedades incurables, como los EIM, debe ser aquel que
pueda implementarse en etapas muy tempranas de la vida y de esta manera, prevenir la
aparición de la sintomatología y las secuelas a largo plazo. Con relación a esto, los
12
hallazgos biotecnológicos, a partir de los años 80, tales como la clonación del ADN, la
síntesis de oligonucleótidos, aislamiento y empleo de enzimas restricción y la
utilización de plásmidos bacterianos, reorientaron la investigación en biomedicina y
proporcionaron la base experimental para iniciar el desarrollo de terapéuticas no
convencionales, como son reemplazar o suplementar los genes defectuosos por medio
de la terapia génica o proveer enzimas funcionales exógenas a los tejidos en los cuales
están ausentes o son deficientes, mediante la TRE.
Los primeros protocolos clínicos de terapia génica de células somáticas aparecieron en
la década de los 90 y en la actualidad, más de 4000 pacientes llevan en sus cuerpos
células modificadas mediante ingeniería genética, producto de más de un centenar de
protocolos de terapia génica en marcha (57). Sin embargo, aunque esta novedosa
terapéutica se asume como la solución esperada, por largo tiempo, para el tratamiento
de un gran número de enfermedades intratables, los resultados en algunos pacientes,
sugieren que aún no se han logrado los niveles óptimos de transferencia y expresión de
los genes exógenos y sus productos. Esto ha conducido a que su empleo se haya
restringido, mientras se desarrollan sistemas más eficientes de transferencia de los genes
terapéuticos y se profundice en el conocimiento de los mecanismos de expresión y
regulación genética, de esos genes exógenos, en las células transfectadas. Como
consecuencia de esto y hasta tanto no se solucionen los problemas que presenta la
terapia génica, el desarrollo en la producción y disponibilidad de proteínas
recombinantes para TRE parece que tendrá en corto tiempo un impacto mayor sobre el
tratamiento de estas patologías (62-64). En este sentido, estudios tendientes al empleo
de TRE en un número importante de enfermedades, tales como, Pompe, Niemann-Pick
tipo B, Wolman, las MPS VII, VI y IVA, las cuales son enfermedades de
almacenamiento lisosomal causadas por deficiencia de las enzimas: α-glucosidasa,
esfingomielinasa, lipasa ácida, β-glucuronidasa, N-acetilgalactosamina 4-sulfato
sulfatasa y N-acetilgalactosamina-6-sulfato-sulfatasa, respectivamente. Así mismo
existen protocolos de TRE para enfermedades metabólicas, no lisosomales, como la
inmunodeficiencia severa combinada, causada por deficiencia de adenosina deaminasa
(ADA), el angioedema hereditario en donde existe deficiencia del inhibidor de la C1-
esterasa, la enfermedad de pénfigo vulgar en donde se presenta una respuesta
13
autoinmune a la desmogleina-3, las hemofilias A y B, ocasionadas por deficiencia de los
factores de coagulación VIII y IX, las deficiencias de α1-antitripsina, hormona del
crecimiento y enzimas pancreáticas en la fibrosis quística (62-64).
La inmunodeficiencia severa combinada fue la primera enfermedad hereditaria no
lisosomal tratada con TRE (65). También, las enfermedades de Gaucher (66,67), de
Fabry (68,69) y MPS I (70,71), se encuentran en fase de aplicación en humanos. Las
otras enfermedades mencionadas, actualmente se encuentran en fases experimentales, a
nivel de laboratorio, en ensayos con modelos animales o en sus fases tempranas
preclínicas (70-81). Todos estos datos, indican que la TRE se presenta a corto plazo
como la medida terapéutica más viable para el manejo en forma eficiente, menos
traumática y más económica de pacientes con enfermedades hasta ahora incurables.
El principio general de la TRE es proporcionarle al paciente la enzima deficiente, sin
embargo para esto es necesario solucionar algunos problemas como la obtención de la
molécula y su direccionamiento a los tejidos en el organismo del paciente. Esto último,
debe ser considerado a dos niveles: el órgano y la célula blanco, puesto que la
deficiencia enzimática puede estar localizada en el espacio extracelular, en el citosol o
en un compartimiento subcelular, en este último caso, la enzima exógena debe
atravesar varias barreras naturales. Cuando el espacio extracelular es el blanco, el
acceso es fácil, tales son los casos del tratamiento de la inmunodeficiencia severa
combinada con la ADA (65) y la suplementación enzimática a nivel pancreático en la
fibrosis quística (81). Si la deficiencia se encuentra a nivel citosólico o subcelular, la
enzima exógena debe atravesar la membrana plasmática, en el primer caso y
adicionalmente, la membrana de la organela, como en las enfermedades mitocondriales
o peroxisomales (1,2). Los lisosomas se comunican con el espacio extracelular a través
de mecanismos endocíticos, gracias a lo cual, en las enfermedades de depósito
lisosomal, es posible llevar enzimas exógenas endocitadas a los lisosomas y de esta
manera poner en contacto la enzima terapéutica con el material a hidrolizar.
En algunos casos en TRE se ha tenido que modificar la molécula de utilidad clínica
para poder dirigirla a los tejidos afectados, aumentar su vida media en el torrente
14
sanguíneo, mejorar su estabilidad o para que sea reconocida por receptores específicos
expresados en las células blanco. Un ejemplo lo constituye la gangliosidiosis GM2 en
cuyo caso la Hexosaminidasa A, es endocitada en cantidades superiores por los
astrocitos tipo I, comparados con las células indiferenciadas epiteloides (82). Con
relación a esto, procedieron a cationizar la enzima conjugándola con poli-lisina lo que
condujo a un aumento en la adsorción de la enzima a la membrana plasmática y su
posterior internalización. Otra enzima modificada con el propósito de lograr una mayor
eficiencia en su empleo clínico fue la ADA que se conjugó con polietilenglicol (83). El
tiempo de permanencia en el plasma aumentó de 30 minutos a 30 horas, se inhibió la
proteólisis y disminuyó la antigenicidad. La enzima N-acetilgalactosamina 4-sulfato
sulfatasa, deficiente en el síndrome de Maroteaux-Lammy, fue igualmente modificada
buscando mejorar el direccionamiento al tejido cartilaginoso. Esta enzima fue
conjugada con poli-lisina o etildiamino para que cationizada difundiera más fácilmente
a través de la matriz extracelular, lográndose un nivel importante en la reducción de los
depósitos de GAG, en el miocardio y menor para otros órganos (80).
En las células blanco, si bien los receptores reconocen un ligando, la especificidad
puede variar, así por ejemplo, las neuronas tienen afinidad por la toxina tetánica, debido
a que posee un alto contenido de gangliósidos y un fragmento de 50 KDa es retenido
por las neuronas sin resultar tóxico. Aprovechando esto, se fusionó ese fragmento a la
hexosaminidasa A, lo cual hizo que la enzima modificada se internalizara en mayor
proporción que la normal (82). El caso más llamativo de modificación de la molécula
terapéutica, por su eficiencia, lo constituyen las deglicosilaciones sucesivas de la β-
glucocerebrosidasa, para eliminar los residuos de ácido siálico y galactosa y exponer los
de manosa. Lo cual permitió que fuera reconocida por los receptores de manosa
presentes en la superficie de los macrófagos (84).
Aunque los resultados anteriores consolidaron la idea de la necesidad de modificaciones
para el mantenimiento en el plasma o el reconocimiento a nivel celular de la enzima de
utilidad terapéutica, recientemente la lipasa ácida lisosomal, deficiente en las
enfermedades de Wolman y Wilson, en las cuales hay almacenamiento de esteres de
15
colesterol, fue expresada en la levadura Pichia pastoris (P. pastoris) y sin ningún tipo
de modificación química a nivel de laboratorio, fue empleada en ratones con deficiencia
de la enzima, logrando disminuir los niveles de colesterol en intestino, hígado y bazo
(75). Es necesario anotar que, todos los intentos en las enfermedades con compromiso
del SNC, como Tay-Sachs, Sandhoff, Niemann-Pick, Sly, no han logrado revertir los
síntomas por la incapacidad de las enzimas para atravesar la barrera hematoencefálica
(1). Esto último, ha llevado a pensar en la posibilidad de una administración directa por
cateterización arterial en los órganos involucrados, a pesar de existir ya un fallido
intento con la enfermedad de Tay-Sachs, debido a la escasa cantidad de enzima
empleada (82). Este procedimiento podría solucionar los problemas de necesidad de
altas concentraciones de la enzima terapéutica y su pérdida a nivel hepático o su
dilución plasmática.
Recientemente (85), se probó con éxito, un sistema de reconocimiento y endocitosis
hasta lisosomas de las enzimas α-L-iduronidasa y α-glicosidasa, empleando receptores
de la familia LDL. Las enzimas fueron fusionadas a un fragmento del receptor asociado
a proteinas (RAP), una molécula residente del retículo con función de chaperona en la
síntesis de lipoproteínas, lo que explica porque es reconocido por los receptores
empleados. Además de ser un sistema independiente de las glicosilaciones, algunos de
estos receptores están involucrados en fenómenos de transcitosis, lo cual ofrece la
potencialidad de emplearse para atravesar la barrera hematoencefálica. También fue
ensayada con buenos resultados (86), otra alternativa independiente de las
glicosilaciones, la cual consistió en la fusión de la β-glucuronidasa a un fragmento del
factor de crecimiento similar a la insulina tipo II (IGF-II), el cual es reconocido por el
receptor de manosa 6-fosfato independiente de catión (IGF-II/CI-MPR) y luego
endocitado hasta los lisosomas.
Sistemas de Expresión de Proteínas Recombinantes El uso de enzimas en TRE exige previamente, la producción y purificación de dichas
moléculas en cantidades suficientes para efectuar estudios de cinética de expresividad,
caracterización bioquímica, bioactividad, antigenicidad, estabilidad y aun modificarlas
químicamente, si es el caso, antes de ser ensayadas en modelos animales y su posterior
16
empleo en terapia humana. Sin embargo, la obtención y purificación de proteínas a
partir de sus fuentes naturales para estudios de estructura y función con el propósito de
ser empleadas con fines terapéuticos ha sido una labor difícil y laboriosa, situación aun
más complicada para las enzimas lisosomales, especialmente las sulfatasas dada la poca
expresividad de ellas por parte de las células. Los bajos volúmenes obtenidos por esta
vía, los altos costos, los largos períodos de tiempo empleados y los avances en el
conocimiento de la estructura, función, regulación y manipulación de los genes, han
dado paso, a la producción de proteínas con la tecnología del ADN recombinante en
modelos biológicos, con el fin de obtener un producto similar al humano. Dentro de
estas posibilidades se han probado los cultivos de bacterias, levaduras y líneas celulares
de mamíferos. Puesto que las bacterias no pueden glicosilar, solo pueden emplearse
para la expresión de proteínas no-glicosiladas o susceptibles de ser glicosiladas en el
laboratorio (87). Aunque las líneas celulares CHO y COS son sistemas tradicionalmente
utilizados para la expresión de glucoproteínas, su manipulación es bastante compleja,
costosa y no siempre esas proteínas son estables o correctamente ensambladas, por lo
cual el rendimiento es bajo (58-61). La expresión de proteínas y su posterior escalado
en modelos biológicos como Escherichia coli (E. coli) (88-90), o levaduras
metilotróficas como P. pastoris han resultado una metodología rápida, eficiente y a
bajo costo. Así, resultados de estudios recientes (91-97), presentan a este tipo de
levadura como un excelente modelo de expresión de proteínas humanas.
E. coli constituye un buen modelo biológico para la expresión de proteínas
recombinantes no glicosiladas por ser un organismo relativamente simple, fácil de
cultivar en altas densidades y su genoma bien conocido. Desde hace más de 25 años
(88), este sistema de expresión ha permitido obtener grandes volúmenes de proteínas
heterólogas (88-90), facilitado por el diseñado de plásmidos compatibles con el genoma
de cepas desarrolladas para uso biotecnológicos. Los elementos genéticos de los
plásmidos de expresión incluyen un origen de replicación (ori), marcadores de
resistencia antibiótica, promotores transcripcionales, regiones de iniciación de la
traducción así como secuencias de terminación de la transcripción y traducción (89). En
la actualidad existen más de 70 sistemas de expresión basados en plámidos pET y
pBAD los cuales incluyen promotores, sitios múltiples de clonación, sitios de clivaje
17
para proteasas, compañeros de fusión y un gran numero de modificaciones genéticas
dependiendo de los propósitos de expresión (90).
El estrés metabólico al cual es sometida la célula bacteriana al utilizarse como sistema
de expresión, resulta en la acumulación de productos insolubles producto de la
formación de cuerpos de inclusión. Estos agregados son generalmente proteínas
incorrectamente plegadas y biológicamente inactivas. En condiciones normales las
proteínas citoplasmáticas son capaces de plegarse espontáneamente, mientras que los
agregados requieren chaperonas, lo que significa que los cuerpos de inclusión son
acumulados de intermediarios incorrectamente plegados por ineficiencia en la actividad
de las chaperonas (89). Para resolver esa situación existen dos alternativas, intentar
solubilizar los agregados y lograr que las proteínas se plieguen correctamente o
modificar las estrategias de producción para obtener proteínas solubles (90). Dado que
el primero de los casos no es lo deseable puesto que la recuperación es poca y la
probabilidad de plegamiento es escaso, se han realizado exitosos ensayos reduciendo la
temperatura (30°C), lo que permite la síntesis de chaperonas, sin embargo, esta
disminución de temperatura conduce a una disminución en el crecimiento y como
consecuencia una merma en la biomasa. Igualmente, se han desarrollado cepas como
c41 y c43 que contribuyen a la expresión soluble de proteínas recombinantes. De otro
lado, la vía más simple para producir proteínas recombinantes en E. coli son los cultivos
en lote, sin embargo, los nutrientes son proporcionados desde el inicio y esto puede
guiar a cambios en el pH, oxígeno disuelto y disminución del sustrato. En cultivos lote
alimentado, la fuente de energía puede ajustarse de acuerdo a la rata de consumo y otros
factores pueden ser regulados para obtener máxima producción de proteína y biomasa
(90). Otra buena estrategia para evitar los cuerpo de inclusión es la co-expresión de
chaperonas (88-90). También ha sido muy exitoso el empleo de “tags” de afinidad, muy
útiles para la purificación de la proteína recombinante y que a la vez previenen la
proteólisis e incrementan la solubilidad (89,90). Entre estos tenemos MBP, NusA, GTS
y más frecuentemente un pequeño fragmento N-terminal del IF2 (90). De otra parte se
han expresado proteínas empleando constructos de fusión con lacZ o GFP y un sistema
18
basado en un complejo oleosina-GFP, empleando el factor de clivaje Xa para separar la
GFP y posteriormente reconstituir la parte lipídica con la adición de triglicéridos (90).
Más de 25 años de empleo de E. coli en la expresión genética, han establecido que es
un buen modelo biológico para muchas aplicaciones científicas de expresión de
proteínas. En E. coli se han logrado expresar, entre otras proteínas humanas, insulina,
eritropoyetina, interferon α, hemoglobina, glucagón, hormona del crecimiento y factor
de crecimiento epidérmico.
P. pastoris es una levadura metilotrófica, en virtud de lo cual, es capaz de metabolizar
el metanol como su única fuente de carbono, para ello su genoma cuenta con dos genes
que codifican para la alcohol oxidasa, AOX1 y AOX2 (96). El primero de ellos es
responsable de la mayoría de las actividades celulares de la alcohol oxidasa y su
expresión es regulada e inducida por el metanol, típicamente la concentración de esta
enzima corresponde a más o menos 30% del total de proteína soluble, en células que
crecen en medios con metanol como fuente de carbono. El gen AOX1 ha sido aislado e
incorporado en plásmidos y el promotor AOX1 usado para dirigir la expresión de un
importante número de genes (97). La regulación del promotor se realiza a nivel
transcripcional y se efectúa mediante un proceso que contempla dos etapas, una de
represión-derrepresión y otra de inducción. El crecimiento sobre glucosa reprime la
transcripción, aun en presencia del inductor metanol, por lo cual es recomendado para
una óptima inducción, el crecimiento en medio con glicerol (96,97).
Se ha lograda la producción de proteínas recombinantes citoplasmáticas y secretadas en
niveles similares a E. coli y superiores a S. cereviciae (97). Un aspecto importante para
el sistema de expresión, lo constituye el hecho de que P. pastoris secreta muy bajas
cantidades de proteínas nativas y por consiguiente los productos secretados pueden
llegar a constituir más del 80% de las proteínas del medio (93,94).
Como organismo eucariótico, P. pastoris posee varias de las ventajas de los sistemas de
expresión de eucariotes superiores, tales como el procesamiento, plegamiento y
modificaciones postranslaciones de las proteínas. A diferencia de Saccharomyces
19
cereviciae (S. cereviciae), no hiperglicosila ni presenta manosas terminales con
uniones glucosídicas α-1,3 (responsables de hiperantigenicidad) y sus cadenas
glicosídicas del tipo alta en manosas, tienen en promedio 8 a 14 residuos de ese azúcar
(98), contrastando con los 50-100 residuos en S. cereviciae (99). Gracias a lo anterior,
P. pastoris constituye un sistema de expresión adecuado para glicoproteínas humanas,
pues sus patrones de glicosilación, si bien no son idénticos, son más parecidos (94), a
los patrones presentes en mamíferos que los de S. cereviciae, muy empleada hasta hace
algunos años.
Fermentaciones de alta densidad parecieran ideales para la producción de proteínas
heterólogas, pues aumentan los niveles de secreción al medio de cultivo. Sin embargo,
otras moléculas, como las proteasas, igualmente aumentan sus concentraciones. En estas
condiciones proteínas como la invertasa (99) y la lisozima bovina (93) son levemente
estables y otras como el factor de crecimiento epidérmico son significativamente
degradadas (100). Para minimizar la proteólisis se han empleado estrategias como el
cambio de cultivo con la variación de pH, la adición de casaminoacidos (97) o el uso de
cepas mutantes para PEP4. Este gen codifica para una proteasa responsable de la
activación de otras proteasas (93).
La mayoría de los protocolos para la expresión de proteínas heterólogas en P. pastoris
han contemplado la utilización de cassettes de expresión de una sola copia (92-98), sin
embargo, más recientemente se han empleado constructos de genes heterólogos con
multicopias (100). Este modelo biológico puede ser utilizado para expresión de
proteínas intracelulares o de secreción. En este último caso, el empleo de secuencias de
señal de secreción ha resultado muy eficiente (91, 94,97).
Algunos ejemplos de proteínas heterólogas humanas expresadas en P. pastoris,
producidas con propósitos clínicos son: D-alanina carboxipeptidasa, superóxido
dismutasa, invertasa, factor de crecimiento epidérmico, interleuquinas 2 y 11, una
subunidad del receptor de IgE, factor de crecimiento 1- similar a insulina, inhibidor 6 de
proteinasa, factor de necrosis tumoral (TNF) y análogos TFN-9, TFN-6 y TFN-Arg,
interferón, caspasa 3, antitrombina, factor de crecimiento endotelio-vascular, quitinasa,
20
colágeno tipo I, tropomiosina, carnitina palmitotransferasa, quimiotripsinógeno,
β-hidroxiesteroide deshidrogenasa, catalasa e inhibidor de angiogénesis k4k5 (91-95).
La Enzima Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa La Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa (EC 3.1.6.13) es una hidrolasa, la cual actúa sobre
enlaces ester-sulfato y cataliza la reacción de hidrólisis del grupo sulfato en posición C-
2 del ácido L-idurónico presente en el dermatán sulfato y heparán sulfato (1). Un
péptido precursor de 550 aminoácidos es codificado por un cDNA de 2.3 Kb (14).
Este precursor presenta ocho sitios potenciales de glicosilación, 62 de O-glicosilación y
26 de fosforilación (101). Los primeros 25 residuos corresponden a la secuencia del
péptido señal y otros ocho residuos son removidos posteriormente, durante el proceso
de maduración de la proteína (102). La comparación de la secuencia de aminoácidos de
la IDSh muestra marcada homología con otras sulfatasas estudiadas, como las
Arilsulfatasas A, B y C (103,104). Fue comprobado mediante mutagénesis dirigida en
células COS, que el centro activo está relacionado con la cisteína en posición 84 (60),
que al igual que en otras sulfatasas para su actividad catalítica requiere la conversión
postranslacional de la cisteína en un residuo de ácido 2-amino-3-oxoproico o formil-
glicina (105,106). La figura 2 presenta el mecanismo propuesto para la mencionada
conversión química.
La enzima ha sido aislada de fluidos corporales como líquido amniótico, plasma y
orina (46,107-109), de órganos como placenta, hígado, riñón e intestino (110-113), de
fibroblastos humanos (59), y enzima recombinante obtenida de células cultivadas (58-
61). En todos los casos se ha considerado que las formas maduras presentan pesos
moleculares entre 42 y 45 KDa y que existe eliminación de una forma menor de 14-18
KDa. Estas formas maduras son el producto, de un procesamiento que incluye
glicosilaciónes, deglicosilaciones, fosforilaciones y proteólisis (Figura 3) (58-61).
Inicialmente es sintetizado un precursor de 76 KDa, que por fosforilación y
glicosilación genera una forma de 90 KDa, la cual, por proteólisis origina una forma de
62 KDa y otra de 18 KDa. Posteriormente una deglicosilación conlleva a la formación
21
de un glicopeptido de 55 KDa que finalmente por una segunda proteólisis entrega la
forma madura de 45 KDa.
Figura 2. Mecanismo de Conversión de Císteína a Formil-glicina. Inicialmente el grupo tiol es oxidado hasta tioaldehido, usando un compuesto X como agente aceptor de hidrógenos. Enseguida, el tioaldehido es hidrolizado y se libera H2S. finalmente el aldehido es regenerado por la entrada de agua. Traducido de Bond C et al (104).
Figura 3. Procesamiento de la IDS. Los valores entre paréntesis indican los pesos moleculares de los péptidos sin glicosilar. Traducido de Millat et al (59-61).
Se han caracterizado varias formas de la IDS en tejidos y fluidos humanos con tres
formas A, B y C. En hígado, las formas A y B solo se distinguen entre ellas por su punto
isoeléctrico, siendo la más ácida la forma B y se hacen indistinguibles con la remoción
del ácido siálico (110). Tanto en suero como en líquido amniótico se determinó
únicamente la forma C (107), mientras que en orina (109) y fibroblastos en cultivo las
formas A y B (46). La forma A resultó más termolábil que la B (110), mientras que la
actividad enzimática es óptima a un pH 4.5 (109,110,111), decrece después de 55°C y
es nula por encima de 64°C (112). Los procesos de purificación han resultado poco
eficientes, así, cuando se utilizó un protocolo que incluyó precipitación con sulfato de
amonio, columnas cromatográficas de conA-sefarosa y DEAE Bio-Gel, se extrajeron las
22
formas A y B con rendimientos de 2.3 y 21.2% y purificaciones del orden de 6.7 y 37.6,
respectivamente (110). Los pesos moleculares de las formas aisladas obtenidos por
filtración en gel, variaron entre 170 y 190 KDa para la forma B y entre 80 y 115 KDa
para la forma A, mientras que cuando, los mismos, se determinaron por
ultracentrifugación resultaron entre 81 y 83 y entre 83 y 94 KDa, respectivamente (110).
Posteriormente, el mismo autor (112), agregó al protocolo una electroforésis preparativa
y una columna de fenil-sefarosa CL-48 para aislar solamente la forma B, con un
rendimiento del 6.5% y purificación de 30030 veces. En este caso, el peso molecular
varió entre 80 y 100 KDa. Para extraerse de orina (109), se empleó precipitación con
sulfato de amonio, pasaje por columna cromatográfica de conA-sefarosa, una nueva
precipitación con sulfato de amonio y empleo de una columna de DEAE-celulosa,
separándose las formas A y B con recuperaciones de 17 y 16% y purificaciones de 77 y
124 veces. A partir de 100 litros de orina se obtuvieron 4.4 mg, que se emplearon para
la producción de anticuerpos-IDS en ratones y estandarización de una técnica de
ELISA. Más recientemente (113), se purificó IDSh a partir de hígado y otros órganos
como placenta, riñón e intestino, obteniéndose resultados similares en todos los casos.
El protocolo de purificación incluyó columnas cromatográficas de conA-sefarosa, azul
A-agarosa, PBE 94, TSK HW 50S-fractogel, fenil-sefarosa CL-4B y TSK G3000SW
ultrapac. Utilizando cantidades menores de tejido que en los protocolos anteriores, se
obtuvieron recuperaciones de 5 y 2% y purificaciones de 549450 y 205128 para las
formas A y B de hígado. En todos los casos estudiados, se obtuvieron formas peptídicas
largas y cortas de IDS purificada, tanto para las formas A como B variaron en peso
molecular, entre 39 y 44 KDa y entre 17 y 18.5 KDa al establecerse los pesos por
exclusión molecular, mientras que al estimarse por electroforésis fueron de 42 y de 30
para el péptido largo y para el corto de 18 y de 14 KDa. Aún no se ha determinado la
estructura cristalina de la enzima ni caracterizado sus glicosilaciones.
En cuanto a su actividad biológica, la pierde rápidamente en agua, soluciones como
NaCl 10-100 mM, condroitin 4-sulfato y 6-sulfato 0.1 mM. Nitrocatecol sulfato y
fosfatos la inhiben, mientras que Mn++ 2 mM la incrementa y la albúmina sérica bovina
(BSA) 0.1% la estabiliza (114).
23
Con el propósito de implementar protocolos de TRE para la enfermedad de Hunter, en
el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo (IEIM) de la Pontificia Universidad
Javeriana, el cDNA de la IDS humana fue clonado y expresado en E. coli (Figura 4) y
en P. pastoris (Figura 5) (115,116). Empleando la cepa JM109 de E. coli y el plásmido
pUC 13-IDS se obtuvo actividad catalítica de 1.5 nmol/h/mg de proteína (115) y con la
utilización del plásmido pPIC 9-IDS y la cepa GS115 de P. pastoris valores de
actividad biológica de 2.54 nm/h/mg de proteina a nivel de 10 ml de cultivo (117).
Posteriormente se aumentaron los volúmenes de trabajo hasta 100 ml y se obtuvieron
valores de actividad IDS de 0.75 nm/h/mg de proteina (117). Se ha escalado el
proceso a nivel de biorreactor (118), con el objeto de obtener cantidades de IDShr
suficientes para los procesos de purificación y estudios de caracterización bioquímica de
la enzima recombinante. Esto permitirá las pruebas en animales de experimentación,
como paso previo antes de su empleo en humanos. Actualmente se cuenta con pruebas
de inmunodetección de IDShr como Dot Blot y ELISA (119,120).
Figura 4. Detección Mediante Western blot de la IDShr Expresada en E. coli A (Western blot de 8% SDS-PAGE) y B (Western blot de 12% SDS-PAGE). 1A = lisado, 4B = sobrenadante. 2A y 3B = lisado y sobrenadante control. Tomado de Landázuri P et al (116).
1 2 3 4
A B
KDa 62 52 49 40
KDa 97 49 43 41 40
24
Figura 5. Detección Mediante Western blot de la IDShr Expresada en P. pastoris Carril 1: sobrenadante control, Carriles 2-5: sobrenadantes de 0, 24, 48 y 72 horas de cultivo. Tomado de Landázuri P et al (115). Glicosilación de Proteínas Las glicoproteínas son proteínas con uno o más grupos de carbohidratos
(oligosacáridos) unidos por enlaces covalentes a ciertos a aminoácidos de su cadena
polipeptídica. Un alto porcentaje (91.7%) de las proteínas de mamíferos son
glucoproteínas, el 8.3 % restante son potenciales proteínas no glicosiladas, algunas de
las cuales se asocian a subunidades glicosiladas (121). Las glicoproteinas están
presentes en todos los organismos vivos con diversidad de funciones. Son
glicoproteinas los receptores, componentes de canales y transportadores de membranas
biológicas, hormonas, enzimas, factores de trascripción, componentes de la matriz
extracelular, moléculas de adhesión, neurotransmisores, inmunoglobulinas y moléculas
estructurales. Lo anterior explica la diversidad de funciones en las cuales están
involucradas estas biomoléculas, entre las cuales se pueden señalar el reconocimiento
celular, el intercambio molecular célula-célula y las células-medio, la transmisión de
mensajes bajo el control de los sistemas nervioso y hormonal, la actividad de células
contráctiles, el bloqueo e inducción de rutas metabólicas, el equilibrio iónico y
1 2 3 4 5
25
molecular intra y extracelularmente, algunas actividades relacionadas con la respuesta
inmune, la regulación del ciclo celular, el direccionamiento y otras (122).
Con base en la unión entre la secuencia aminoacídica y las cadenas hidrocarbonadas,
las glucopreoteínas, pueden clasificarse en tres grupos (123):
1. N-glicosiladas, en cuyo caso se presentan enlaces glucosidicos tipo N, es decir,
uniones que involucran el grupo amida de la asparagina (N) y el azúcar N-
acetilglucosamina, en las secuencias N–X–S y N–X–T, donde X puede ser cualquier
aminoácido excepto prolina.
2. O-glicosiladas, en las cuales existen enlaces glucosídicos tipo O, es decir uniones
entre el OH de serina o treonina y el azúcar N-acetilgalactosamina, se incluyen aquí las
uniones a la hidroxiprolina e hidroxilisina de los colágenos
3. GPI-enlazadas, en las cuales se encuentran enlaces glucosilfosfatidilinositol (GPI), es
decir, la unión entre el aminoácido terminal del extremo carboxilo y un residuo
fosforiletanolamida unido a un oligosacárido, el cual a su vez, esta unido mediante una
glucosamina al fosfotidilinositol.
La glicosilación de proteínas se lleva a cabo por una vía biológica compleja, ordenada y
no al azar, dependiente de la secuencia de la proteína, del fenotipo celular y del medio
ambiente fisiológico de la célula sintetizadora. Este proceso puede ser descrito como un
conjunto de eventos químicos que se inician en el retículo endoplasmático y terminan en
el aparato de Golgi (122).
La síntesis de la secuencia aminoacídica de toda glicoproteína se inicia en ribosomas
libres en el citoplasma, con la traducción de su correspondiente ARNm. En principio se
forma una secuencia de 25-30 aminoácidos hidrofóbicos que van a constituir la
secuencia señal. Al empezar a emerger estos aminoácidos del canal del ribosoma son
reconocidos por la partícula de reconocimiento de la secuencia señal (PRS),
ribonucleoproteína compuesta por 300 ribonucleótidos y seis péptidos (122). La síntesis
proteica se detiene hasta que el complejo ribosoma-péptido señal-PRS encuentra sobre
la membrana del retículo un complejo de proteínas, conocido como translocón (124), el
26
cual esta compuesto por el receptor de la PRS, el receptor del ribosoma, el receptor de la
secuencia señal, la peptidasa señal, la oligosacaril transferasa y la sec 69 que constituye
el canal por el cual se transloca el péptido naciente hacia el lumen del retículo
endoplásmico, en donde sufrirá modificaciones postranslacionales como eliminación del
péptido señal por la peptidasa señal, formación y reorganización de puentes de disulfuro
por la proteína disulfuro isomerasa, adición y remoción de azucares y plegamiento
(122).
La síntesis del oligosacárido a ser transferido a un residuo de asparagina del péptido
naciente, se inicia en la cara citoplasmática de la membrana del retículo. Un lípido de
membrana, el dolicol-fosfato (compuesto por unas veinte unidades de isopreno), sirve
como aceptor, inicialmente le es transferida una N-acetilglucosamina-P (GlcNAc-P) a
partir de UDP-GlcNAc bajo la catálisis de la GlcNAc-fosfotransferasa. Posteriormente
otra GlcNAc-transferasa cataliza la adición de una nueva molécula de GlcNAc, luego
secuencialmente a partir de nucleótidos GDP-manosa le son agregadas cinco manosas
con el concurso de las manosiltransferasas I, II, III, IV y V. El complejo formado es
transladado a través de la membrana del retículo endoplásmico, producto de un
movimiento de “flip flop” dirigido por la flipasa e hidrólisis de ATP. Las manosil
transferasas VI, VII, VIII y IX (residentes del retículo endoplásmico), adicionan
secuencialmente cuatro manosas y las glucosil transferasas I y II agregan una y dos
moléculas de glucosa, sin embargo, en este caso no se emplean azucares de nucleótidos
sino el donador es el dolicol-fosfato, al cual se le transfieren los azucares a nivel
citoplasmático. El oligosacárido de 14 azucares (2 GlcNAc-9 manosas y 3 glucosas), es
transferido en bloque sobre el peptido naciente, en una reacción catalizada por la
oligosacaril transferasa y sufre modificaciones en el retículo endoplásmico y luego en el
complejo de Golgi. Una manosidasa elimina una manosa y las glucosidasas I y II
hidrolizan una y las dos restantes moléculas de glucosa. Con excepción de
Schizosacharomyces pombe, que no elimina la manosa, este procesamiento
oligosacarídico es conservado evolutivamente (125). La eliminación de las tres glucosas
es la base de un mecanismo de regulación del correcto plegaje de la glicoproteína, en el
cual intervienen dos proteínas residentes del retículo, la calnexina y la calnereticula, la
primera componente de membrana y segunda proteína soluble. Luego de que dos de
27
las glucosas han sido eliminadas, el glicopéptido se une a la calnexina y/o
calnereticulina, luego se expone al ERp57 otro factor de plegamiento y cuando el tercer
residuo de glucosa es eliminado, el complejo se disocia. Si la proteína no está bien
plegada, el oligosacárido es reglucosilado por una glucosiltransferasa y la proteína se
asocia con las mencionadas lectinas, repitiéndose el ciclo hasta lograr su plegamiento
correcto (126) o ser degrada por el proteosoma 23S, para lo cual es transportada
retrógradamente a través de la membrana (127). Al superar este punto de control la
glicoproteína en formación pasa al complejo de Golgi en donde continua su
procesamiento.
En el complejo de Golgi existen compartimentalizadas, glucosiltransferasas,
glicosidasas, fosforilasas y fosfatasas que van a permitir la modificación del
oligosacárido en formas muy variadas dependiendo del destino final, el tipo de tejido y
organismo específico. Si las proteínas tienen como destino ser secretadas, o formar
parte de una membrana biológica, en la cara cis de Golgi, las manosidasas 1a y 1b
eliminan cuatro moléculas de manosa, estos oligosacáridos corresponden a los
denominados de alta manosa compuestos, entonces por dos acetilglucosaminas y 5-8
manosas. En la cara medial, GlcNAc transferasas I y II adicionan una y luego otra
molécula de GlcNAc, mientras que la fucosil transferasa cataliza la reacción de
trasferencia de una fucosa. Finalmente, en la cara trans de Golgi la galactosil trasferasa
y la sialil transferasa dirigen la adición de dos galactosas y dos ácidos siálicos,
respectivamente, teniendo como donadores los nucleótidos GDP-fucosa, UDP-
Galactosa CMP-ácido siálico, los cuales ingresan a las cavidades del complejo de Golgi
mediante sistemas de transporte tipo antiporte, que permite la salida y con ello el
reciclaje de los nucleótidos. Los oligosacáridos así formados son conocidos como
oligosacáridos complejos y pueden hallarse desde dos hasta cinco cadenas
hidrocarbonadas. El tercer tipo de oligosacárido que puede encontrarse en una
glicoproteína es del tipo híbrido, en este caso en la cara medial de Golgi, no son
eliminadas manosas, se adicionan dos acetilglucosaminas y en trans Golgi galactosas y
ácidos siálicos. Aunque las cadenas híbridas y de alto contenido de manosa se forman
por procesamiento de cadenas complejas, todos los N-oligosacáridos conservan en
común una estructura pentasacárida (2 N-acetilglucosaminas y 3 manosas).
28
A diferencia de las glicoproteínas de secreción y de membrana, las destinadas a
convertirse en proteínas lisosómicas sufren a nivel del complejo de Golgi un
procesamiento diferente para ser direccionadas a los lisosomas a través de un marcador
biológico especifico denominado el parche manosa 6-fosfato. En la cara cis de Golgi, en
una primera reacción catalizada por la N-acetilglucosaminil-fosfotransferasa se
transfiere N-acetilglucosamina-P al carbono seis de uno o varios residuos de manosa y
en una segunda reacción catalizada por una fosfodiesterasa, es removida la N-
acetilglucosamina, dejando fosforiladas las manosas en posición 6. En las caras medial
y trans de Golgi existen receptores de manosa 6-fosfato, los cuales reconocen el
mencionado motivo y retienen las enzimas que luego en vesículas recubiertas de clatrina
son dirigidas a los lisosomas, con la participación de receptores de la familia SNARE
(128).
Aunque los mecanismos de O-glicosilación no estan completamente dilucidados,
existen varias diferencias en la síntesis con respecto a las N-glicoproteinas. En el caso
de las O-glicosilaciones la unión se realiza entre el OH de la serina/treonina y la N-
acetilgalactosamina o la galactosa, en el caso de los colágenos, menos frecuentes son las
O-glicosilaciones utilizando fucosa, xilosa o glucosa (129). Adicionalmente, se han
reportado las O-glicosilaciones glucosa-tirosina y manosa-triptofano, en la glicogenina
y una ARNasa humana (129). En este tipo de glicosilación los azucares se unen uno a
uno, no participa el dolicol fosfato ni las glucosidasas (123). Existen enzimas
específicas para las O-glicosilaciones, sin embargo, hay otras comunes para N y O-
glicosilaciones. Aunque se conocen unos pocos casos de O-glicosilación directa de
proteínas citoplasmáticas y nucleares, la formación de O-glicanos se efectúa en el
retículo endoplásmico y el complejo de Golgi. En el caso de las levaduras se inicia con
la adición de dos manosas a partir del dolicol-P-Manosa y en el aparato de Golgi hay
elongación con 1-7 residuos (125), mientras que para los mamíferos se han postulado
dos modelos: en el primer caso, en el retículo hay adición de manosas con catálisis de la
O-manosil transferasa 1 (POMT1) y elongación con diversos azucares en el aparato de
Golgi (129). En el segundo caso se inicia directamente en el complejo de Golgi, en
29
donde se transfieren Galactosa, GlcNAc, GalNAc y posterior elongación y modificación
con adición de polilactosamina, acido siálico, fucosa, sulfatos y acetilos.
Con relación a las proteínas enlazadas a GPI, la primera etapa en la síntesis consiste en
la transferencia de la GlcNAc, desde UDP-GlcNAc hasta el inositol fosfato. La
GlcNAc es desacetilada e inmediatamente son adicionados tres residuos de manosa y
posteriormente la fracción fosforil etanolamida que permite la unión al aminoácido
terminal del extremo carboxilo del péptido (123).
Se ha señalado que las glicosilaciones están involucradas en los procesos de plegaje
(126,127,130), direccionamiento (128), estabilidad (130,131), transporte (130),
reconocimiento (132), señalización (133), secreción (134) y actividad catalítica en el
caso de las enzimas (130,131).
Aplicación de Programas Computacionales en el Análisis de Macromoléculas
Existen una serie de programas computacionales que proporcionan una amplia gama de
predicciones a nivel estructural de macromoléculas, de las cuales, aun no se ha logrado
experimentalmente determinar su estructura tridimensional. Este tipo de estudios exigen
seguir una metodología computacional, utilizando diversos programas que son de libre
acceso y que en muchos casos son servidores Web, siendo esto una herramienta muy
importante y de gran utilidad como fuente de datos. Posteriormente, con los datos
obtenidos, se procede a realizar un análisis bioquímico de la macromolécula con el
propósito de obtener un modelo o aproximaciones a la estructura y función de la
biomolécula en estudio (135). Dentro de las herramientas computacionales usadas
tenemos servidores Web, los cuales presentan múltiples opciones para el análisis de las
estructuras moleculares en estudio y programas que permiten visualizar estas moléculas.
De los servidores más comúnmente empleados podemos señalar al National Center for
Biotechnology Information (NCBI) (136), establecido en 1988 como una fuente para la
información de biología molecular, el cual crea bases de datos públicas, conduce
investigaciones en biología computacional, desarrolla herramientas de sofware para
analizar los datos de los genomas, información biomédica y otras opciones. El servidor
30
del Swiss Institute of Bioinformatics (SIB): ExPASy (Expert Protein Analysis System)
Molecular Biology Server (137), está dedicado al análisis de secuencias y estructura de
proteínas, presenta un gran sistema de enlaces a bases de datos y ofrece opciones para
la predicción de gran número de aspectos estructurales de las moléculas en estudio.
Está claramente establecido que menos del 1% del total de proteínas tienen estructura
terciaria determinada experimentalmente y cerca del 20% de los dominios del total de
proteínas son reportados como producto de la predicción computacional por homología.
Lo que significa que tenemos conocimiento de menos del 10% del total de proteínas y
aunque la mayoría de estas estructuras tridimensionales han sido obtenidas por
cristalografía o resonancia magnética nuclear (NMR), también muchas de ellas son
producto del modelaje teórico (138). Dadas las limitantes técnicas y económicas que
significa las tecnologías señaladas, surge como alternativa viable la predicción
computacional, siguiendo algoritmos establecidos, pero que necesariamente requieren el
concurso de la experiencia experimental del investigador (138).
31
MATERIALES Y METODOS
SEPARACIÓN DE LA IDURONATO 2-SULFATO SULFATASA HUMANA RECOMBINANTE (IDShr) EXPRESADA EN Pichia pastoris Y Escherichia coli .
Determinación de la Concentración de Proteínas
La concentración de proteínas totales se estableció mediante la técnica de Folin-Lowry
(139), para lo cual se emplearon 20 µl de cada muestra, se le adicionaron 500 µl del
reactivo de cobre (0,278 g de tartrato de sodio y potasio, 66 mg de CuSO4.5H2O, 2.0 g
de NaCO3.10H2O en 100 ml de agua desionizada) y se incubaron a 55°C durante cinco
minutos, enseguida les fueron agregados 2.0 ml del reactivo de folin (625 ml de folin
en 100 ml de agua) y se realizó la lectura de absorbancia a 610 nm. Para estimar la
concentración de proteína total en las muestras, se elaboró una curva de calibración de
BSA, con soluciones de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 y 0.5 mg/ml.
Determinación de Actividad Enzimática de la IDShr Para la determinación de la actividad enzimática de la IDShr se empleó el sustrato
fluorométrico 4-metil umbeliferil-α-iduronato 2-sulfato (MU-αIdoA-2S) 1.25 mM
(140). A 10 µl de muestra se le adicionaron 20 µl de buffer del sustrato
(CH3COONa/CH3COO y Pb(CH3COO)2.3H20 10 mM) y se incubó a 37ºC durante
cuatro horas, al cabo de las cuales se le adicionaron 40 µl de buffer Pi/Ci (NaH2PO4
0.4 M, C6H5Na3O7.2H2O 0.2M pH 4.5 y NaN3 0.02%) y 10 µl de LEBT (suspensión
de enzimas lisosomales de hígado de conejo, parcialmente purificadas). La solución fue
incubada por 24 horas a 37ºC. La reacción se detuvo con 650 µl de buffer de parada
(NaHCO3/NaCO3 0.5M, pH 10.7, conteniendo glicina 1.7 mM). La fluorescencia fue
determinada en un fluorómetro Turner 450, con longitudes de onda de excitación y
emisión de 360 y 415 nm, respectivamente. Como control se empleó plasma humano.
La actividad enzimática fue expresada como nanomoles de sustrato convertido por hora
por miligramos de proteína total (nmol/h/mg de proteína total).
Para el cálculo de la actividad catalítica de la enzima se utilizó la siguiente fórmula
32
Actividad IDS = (FA - FB) X FF X D
4h
FA: Fluorescencia de MU-αIdoA-2S
FB: Fluorescencia de Blanco
D: Dilución de la muestra.
FF: Factor de fluorescencia. Calculado como:
0.6 mg x 1µmol x 30 µl x 1000nmol x 1 = 0.9 ml 198.2mg 10µl µmol 10 (1) (2) (3) (4) (5)
En donde:
(1) = Concentración de Sustrato.
(2) = Peso Molecular de Sustrato.
(3) = Relación volumen total/volumen de muestra.
(4) = Factor de conversión a nmol.
(5) = Sensibilidad del Fluorómetro.
Determinación de Actividad Proteolítica
A 1.0 ml de cada muestra le fue añadido 1.0 ml de solución de caseína al 1% (p/v)
preparada en buffer fosfato. Se incubó a 65°C durante 30 minutos y se adicionó a
cada muestra 1.0 ml de ácido tricloroacético al 15% (p/V). La reacción se detuvo
incubando por cinco minutos a 4°C, se leyó la absorbancia a 280 nm de longitud de
onda y el cálculo fue realizado estimando que 0.5 unidades de DO son equivalentes a
10 unidades proteolíticas (UP/ml/min) (141).
Electroforesis en Gel de Poliacrilamida
A las muestras se les adicionó un volumen igual de buffer de carga (Tris-HCl 50 mM,
pH 6.8, ditiotreitol 100 mM, dodecil sulfato de sodio (SDS) 2%, azul de bromofenol
0.1% y glicerol 10%). Las proteínas se separaron por electroforesis en geles de
poliacrilamida al 12% (SDS/PAGE), según el método descrito por Laemmli (142).
33
Western Blot
Las proteínas presentes en las muestras de E. coli y P. pastoris, se separaron mediante
SDS-PAGE y fueron transferidas a papel de nitrocelulosa Hybond. La membrana fue
bloqueada con TTBS (TBS, Tween 0.1%) y leche descremada al 5% (143). Como
control positivo fue utilizado un anticuerpo monoclonal donado por Kasuko Sukegawa
de la Universidad de Gifu del Japón. Como anticuerpo secundario se empleó anti-IgG
de ratón marcado con peroxidasa (Sigma), para el control positivo y cuando se probó
su especificidad o al ser utilizado como control el anticuerpo policlonal producido en
conejo, se uso como anticuerpo secundario anti-IgG de conejo marcado con peroxidasa
(Sigma).
Producción de Anticuerpos Policlonales contra Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa Humana Recombinante (IDShr).
Para la producción de anticuerpos policlonales se utilizó IDShr purificada y donada por
Transkariotic therapies (TKT). Se utilizaron dos conejos, a los cuales se les inoculó con
concentraciones diferentes de IDShr (100 µg/ml o 50 µg/ml). Se realizaron cinco
inmunizaciones con intervalos de siete días, utilizando en la primera adjuvante
completo de Freund´s y en las siguientes, adjuvante incompleto de Freud´s. El suero
obtenido del sangrado de los animales se diluyó 1:2 con PBS pH 7.2, luego fue
filtrado empleando una membrana de 0.45 µm y se corrió con un flujo de 1.0 ml/min,
en una columna de afinidad Hi-Trap Protein A (Amersham Pharmacia Biotech), como
buffer de corrida se empleó PBS pH 7.2 y se eluyó con ácido cítrico 0.1 M pH 3.6.
Las fracciones fueron colectadas en 60 µl de Tris-HCl 1.0 M pH 9.0, cuantificadas por
el método de Folin-Lowry y evaluadas por PAGE-SDS 12%. El título de los
anticuerpos fue determinado por Dot blot, para lo cual 25 ug/ml del antígeno fueron
colocados sobre una membrana de nitrocelulosa HYBOND 0.22 nm previamente
humedecida en TBS (Tris HCl 20 mM pH 7.5, NaCl 500 mM) y como control se utilizó
suero preinmune del conejo. La membrana fue bloqueada con una solución de TBS,
BSA 1% y se lavó con TTBS. Posteriormente, se realizaron diluciones dobles seriadas
del anticuerpo en TTBS-BSA 2% y nuevamente fue lavada. Se adicionó el anti-IgG de
conejo marcado con peroxidasa en una concentración de 0.4 ug/ml en solución TTBS-
34
BSA 2% y se realizó un último lavado. Para visualizar la prueba, la membrana de
nitrocelulosa, fue tratada con una solución de 3´-3´ Diaminobenzidina durante 30
segundos, se incubó durante 30 minutos en PBS pH 7.2 y se dejó secar (119). La
especificidad del anticuerpo policlonal obtenido fue comprobada por Western blot. La
IgG purificada fue dializada contra PBS 0.1 M pH 7.0 para ser empleada en la
elaboración de una columna de afinidad.
Preparación de una Columna de Afinidad (Superosa 6 GP-anti IDShr)
Para la preparación de una columna de afinidad se utilizaron 2.0 ml de Superosa 6 PG
(Amersham Pharmacia Biotech), los cuales fueron lavados con 20 ml de agua destilada
estéril y se mezclaron con 4.0 ml de NaIO4, se incubó en agitación a temperatura
ambiente durante dos horas, al cabo de las cuales se lavó con 20 ml de PBS, fueron
adicionados 12 mg de CNBr y nuevamente se lavó con 20 ml de agua destilada estéril.
Enseguida, le fueron adicionados 25 mg de IgG anti-IDS y se dejó en incubación
durante 12 horas. Se empacó la columna y fue equilibrada con 20 ml de PBS (143). La
columna se probó con una muestra de retentado del cultivo M-13 de P. pastoris.
Separación de la IDShr Expresada en Pichia pastoris
Para la expresión de la IDShr se empleó la cepa GS115 (Invitrogen) de P. pastoris
transformada con el plásmido pPIC9-IDS (115). Utilizando el clon pPIC9-IDS/28
fueron realizados 20 cultivos a nivel de biorreactor, con volúmenes de trabajo de uno
hasta tres litros los mismos se denominaron secuencialmente M-1 hasta M-20. La
levadura recombinante fue crecida en medio salino (3.5 ml de H3PO4 85%, 0.15 g
CaSO4·2H2O, 2.4 g de K2SO4, 1.95 g de MgSO4·7H2O, 0.65 g KOH) durante 120
horas, con inducción por metanol (0.5%) cada 12 horas a partir de las 24 horas de
cultivo (144). Los cultivos fueron centrifugados a 3500 rpm por 20 min a 4°C y los
sobrenadantes obtenidos sometidos a ultrafiltración en un sistema Amicon con el
empleo secuencial de membranas de celulosa regenerada YM-100 y YM-30 (“cut off”
de 100 y 30 KDa, respectivamente). Las fracciones concentradas (volúmenes máximos
de 10 ml) obtenidas de esta forma, fueron corridas en una columna de exclusión
molecular, de Sephacryl S-200 (Amersham Pharmacia Biotech), de longitud 40 cm y
35
con un flujo de 0.5 ml/min, empleando como solución de corrida buffer acetato 0.1 M
pH 5.0. Los picos de absorbancia a 280 nm, que mostraron actividad IDShr fueron
corridos en columna de Superosa 6 GP-anti IDS, de longitud 3.5 cm y con flujo de 0.2
ml/min. La columna fue equilibrada con PBS pH 7.2 y las fracciones de IDShr fueron
eluídas con TBS pH 8,75. Los eluídos de la columna de afinidad fueron cuantificados
por el método de Folin-Lowry, determinada su actividad proteolítica, actividad IDShr y
evaluados por electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% según las metodologías
descritas anteriormente.
Concentración de Proteínas por Liofilización
Con el propósito de probar un protocolo de liofilización como sistema de concentración,
se tomaron muestras de cada una de las fracciones del proceso de ultrafiltración. Las
mismas fueron dejadas 48 horas a -70°C y se liofilizaron durante 12 horas empleando
un liofilizador LabCongo (Lyph-lock-6-freez Dry). Los liofilizados fuero reconstituidos
en 1.0 ml de buffer acetato 0.1 M pH 5.0.
Dializado de Muestras para Actividad IDShr
Con el fin de establecer el efecto de un proceso de diálisis sobre la actividad enzimática
de la IDShr, se dializaron durante 24 horas contra TRIS-HCl 0.1 M pH 7.0 muestras de
cada una de las fracciones de la ultrafiltración y posteriormente se sometieron a la
prueba de actividad enzimática. Para activar la membrana (12 KDa), se lavó en agua
destilada durante tres horas, se colocó en una solución de sulfito de sodio al 0.3% a
80°C durante un minuto y luego dos minutos a 60°C. Fue lavada con ácido sulfúrico al
0.2% y luego con agua caliente.
Ruptura Celular de Pichia pastoris
Células obtenidas de la centrifugación del cultivo denominado M-13' fueron sometidas
a ruptura celular (145). Para lo cual el precipitado obtenido por centrifugación del
cultivo fue resuspendido en solución salina e incubado a 4°C por 24 horas. Un mililitro
de la solución fue centrifugado a 3000 rpm durante 10 min y el precipitado fue
resuspendido en 1.0 ml de buffer de ruptura (NaH2PO4 50 mM, EDTA 1.0 mM, glicerol
5% (v/v), PMSF 1.0 mM y pH 7.44 ajustado con NaOH 5N). Se leyó la absorbancia a
36
600 nm y se ajustó a una DO entre 50-100. La solución así tratada, fue alicuotada en
dos eppendorf y se agregó un volumen igual de perlas de vidrio. Las muestras fueron
sometidas a 9 ciclos de incubación en hielo y agitación en vortex de 30 y 90 segundos,
respectivamente. Las muestras fueron centrifugadas a 10000 rpm a 4° durante 10 min. A
los sobrenadantes obtenidos se les determinó actividad IDShr y cuantificación de IDShr
por ELISA.
Separación de la IDShr Expresada en Escherichia coli. Para la expresión de la IDShr recombinante se empleó la cepa JM109 de E. coli
transformada con el plásmido pUC13-IDS (JM109-pUC13/IDS) (116). La bacteria se
hizo crecer en LBA (triptona 1%, extracto de levadura 5%, cloruro de sodio 1% ) con
50 µg/ml de ampicilina y en medio mínimo (K2HPO4/KH2PO4 0.05M pH 7.2; NH4Cl
0.1%, MgCl2.6H2O 0.01%, NaCl 0.001%, MnCl2.4H2O 0.001%, FeCl3.6H2O
0.001%, xylosa 0.5%, metionina 3.0 mM y tiramina 3.0 M), con 50 µg/ml de
ampicilina. Las fermentaciones discontinuas se realizaron en frasco agitado
(erlenmeyer) durante ocho horas a 37°C y 250 rpm. Como control se empleó la cepa
JM109 sin transformar. Los cultivos fueron centrifugados a 3500 rpm por 20 minutos a
4°C y a los sobrenadantes obtenidos se les realizó cuantificación de proteínas y
actividad IDShr empleando las técnicas ya descritas.
Los precipitados obtenidos de la centrifugación se sometieron a ruptura celular, para lo
cual se resuspendieron en buffer de ruptura (Tris-HCl 50 mM pH 7.5, NaCl 200 mM,
glicerol 5%, ditiotreitol 1.0 mM, PMSF 1.0 mM), luego se les adicionaron 300 µg/ml de
lisosima y se incubó durante una hora a 4ºC. La suspensión fue sometida a tres ciclos
de congelación-descongelación en nitrógeno líquido y centrifugada a 13000 rpm a 4°C
por 15 minutos. Finalmente, los sobrenadantes fueron dializados contra Tris-HCl 0.1 M
conteniendo NaCl 0.1M (146).
Los sobrenadantes de la centrifugación tanto de los cultivos como de los precipitados
obtenidos después de la ruptura enzimática, fueron sometidos a ultrafiltración en un
sistema AMICON con el empleo secuencial de membranas de celulosa YM-100 y
37
YM-30 para la excluir moléculas mayores a 100 KDa y menores de 30 KDa,
respectivamente. Luego, se corrieron en una columna de exclusión molecular de
Sefacryl S-200 (Amersham Pharmacia Biotech), de longitud 40 cm y con un flujo de 0.5
ml/min, empleando buffer acetato pH 5.0 como solución de corrida. Los picos de
absorbancia a 280 nm, que mostraron actividad IDShr fueron corridos con flujo de 0.2
ml/min en una columna de afinidad, de longitud 3.5 cm, realizada con Superosa 6-GP-
anti IDS. La columna fue equilibrada con PBS pH 7.2 y las fracciones de IDShr fueron
eluídas con TBS pH 8,75.
EXPRESION DE LA IDURONATO 2-SULFATO SULFATASA HUMANA RECOMBINANTE (IDShr) EN Escherichia coli EMPLEANDO EL SISTEMA DE FUSION DE GENES GLUTATION S-TRANSFERASA (GST)
Plásmidos
El gen de la IDSh fue obtenido a partir del plásmido pUC13-IDS, el cual contiene la
secuencia regulatoria y la 3' del gen de la β-galactosidasa del operón lac, un sitio
múltiple de clonación, un origen de replicación, un sitio de trascripción-terminación y
el gen de resistencia a la ampicilina (116). El pUC13-IDS se construyó insertando el
cDNA de la IDSh (1.65 kb), en el sitio de restricción para la enzima EcoRI, el tamaño
total de este constructo es de 4.4 kb.
Como plásmido de expresión fue empleado el pGEX 3X que contiene el gen de la
glutation S-transferasa, un origen de replicación, un sitio múltiple de clonación, el gen
de resistencia para ampicilina y la región para el factor de clivaje Xa. El tamaño de este
plásmido es de 4.52 Kb (147).
Microorganismos
Para la multiplicación de los plásmidos pUC13-IDS y pGEX 3X-IDS y la expresión de
la IDShr se empleó la cepa JM109 de E. coli.
Purificación de los plásmidos
La obtención de los plásmidos se realizó a partir de cultivos de E. coli JM109
transfectadas con el pUC13-IDS y E. coli DH5α transfectada con el pGEX 3X. De los
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cultivos se tomaron 1.5 ml que fueron centrifugados a 3000 rpm durante 15 minutos a
4°C. El precipitado fue resuspendido en 200 µl de TEG (Tris 25 mM, EDTA 10 mM pH
8.0) y dejado a temperatura ambiente durante cinco minutos, al cabo de los cuales se le
adicionaron 400 µl de buffer de lisis (NaOH 0.2 N, SDS 1%) y se colocó en hielo
durante cinco minutos. Luego le fueron adicionados 300 µl de acetato de sodio 3.0 M
pH 4.8 y después de homogenizar se dejó cinco minutos en hielo, al cabo de los cuales
se centrifugó a 12000 rpm durante cinco minutos a 4°C. Al sobrenadante separado le
fueron adicionados 480 µl de isopropanol frío y se incubó a -20°C por 20 minutos.
Luego se centrifugó a 12000 rpm durante 15 minutos a 4°C, posteriormente el
sobrenadante fue descartado y el precipitado resuspendido en 100 µl de TE 1X (Tris-
HCl 10mM pH 8.0, EDTA 1 mM pH 8.0) (148). La concentración de ADN plasmídico
se cuantificó por espectrofotometría. Posteriormente el ADN se sometió a electroforesis
en gel de agarosa al 1.5% y se visualizó con bromuro de etidio (149).
Separación de la Banda de cDNA IDSh del pUC13-IDSh
El plásmido pUC13-IDSh fue digerido usando dos unidades de enzima EcoRI, por cada
µg de DNA plasmídico en un volumen final de 50 µl, luego incubado durante cuatro
horas a 37°C. Los productos de la digestión se separaron por electroforesis en gel de
agarosa al 1.5 % y corrida en buffer TBE 1X (Trisma base 1.0 M, ácido bórico 1.0 M y
EDTA 20 mM) y visualización con bromuro de etidio. El fragmento de 1,65 kb
correspondiente al cDNA de la IDSh se extrajo del gel y fue purificado empleando el
Kit de purificación de ADN Wizard PCR Prep de Promega. Dicho fragmento fue
retirado del gel, transferido a un tubo eppendorf e incubado a 65°C hasta que la agarosa
se licuó, luego de lo cual le fue adicionado 1.0 ml de resina y homogenizado durante 20
segundos y luego se procedió a extraer la agarosa realizando vacío. La suspensión fue
transferida a una minicolumna, se le adicionaron 2.0 ml de isopropanol al 80%, después
de centrifugar a 10000 rpm por dos min, la minicolumna fue transferida a otro
eppendorf para eluir el ADN. Se le adicionaron 50 µl de agua libre de nucleasas y se
centrifugó a 10000 rpm durante un minuto.
39
Digestión del plásmido pGEX 3X
Para la digestión del plásmido pGEX 3X se empleó una mezcla de reacción compuesta
de 1.0 µl EcoRI, 1.0 µl de buffer 10x, 4.0 µl de agua libre de nucleasas y 4.0 µl del
vector, se incubó por dos horas a 30°C y se inactivó la enzima con una incubación a
65°C durante 15 minutos.
Desfosforilación del pGEX 3X-IDSh Digerido
Para desfosforilar los vectores se siguieron las instrucciones del fabricante de la
enzima “Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal” (CIAP) (Promega) (150) y las
recomendaciones de Sambrook et al (148). Para el cálculo de los picomoles de extremo
a desfosforilar se empleó la fórmula:
04.3×⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛=
kb
linealends TallaADN
gADNpmol µ
En donde: (3.04) = Coeficiente de extinción molar.
Obtención del constructo pGEX 3X-IDSh
Para lograr la ligación entre los vectores linealizados y desfosforilados se siguieron las
instrucciones del fabricante de la enzima “T4 DNA Ligase” (Promega) (150) y las
recomendaciones de Sambrook et al (148). Se ensayaron las relaciones molares
inserto:vector 5:1, 3:1 y 1:1. Para el cálculo de los nanogramos de inserto se utilizó la
fórmula:
( ) ba
VectorkbInsertokbVectorng
Insertong ××
=)(
)()(
En donde: ⎟⎠⎞
⎜⎝⎛
ba . Relación molar de
VectorInserto
.
Preparación de Células Competentes de E. coli
La preparación de células competentes de E. coli se efectúo con CaCl2, para lo cual una
colonia de E. coli JM109, se inoculó en 40 ml medio LB y se incubó toda la noche en
40
agitación a 37°C. Luego 400 µl de este cultivo se inocularon en 40 ml de medio fresco
y fueron incubados a 37°C, con agitación hasta una DO entre 0.3 y 0.4 a 600 nm. Este
cultivo fue transferido a tubo de polipropileno de 50 ml y dejado en hielo por 10
minutos, al cabo de los cuales se centrifugó durante cinco minutos a 3000 rpm a 4°C,
se descartó el sobrenadante y el precipitado fue resuspendido en 20 ml de una solución
fría de CaCl2 50 mM. La solución fue dejada en hielo durante 30 minutos,
posteriormente centrifugada a 2500 rpm durante cinco minutos a 4°C, el precipitado
se resuspendió en 4.0 ml de CaCl2 50 mM frío y se dejó por 24 horas a 4°C (149).
Transformación en E. coli competentes
10 ng del plásmido pGEX 3X-IDS se agregaran a 100 µl de cultivo de E. coli JM109
competentes. La mezcla se colocó en hielo por 30 minutos, después de los cuales se
sometió a un choque térmico a 42°C por dos minutos, posteriormente fue adicionado
1.0 ml de medio LB e incubado con agitación suave por una hora a 37°C. Finalmente se
sembraron alícuotas de 50, 100 y 200 µl de las colonias transformadas, en cajas de Petri
con medio LB agar con 50 µg/ml ampicilina (LBA). Las placas se incubaron durante 16
horas a 37°C. Las colonias de las células que crecieron en agar LBA se aislaron y
resuspendieron en 3.0 ml de medio LBA para luego incubarse durante toda la noche
en agitación a 250 rpm a 37ºC (148). De estos cultivos se tomaron 1.5 ml para la
extracción del ADN plásmido y su corrida en gel de agarosa al 1.5% y se visualizó con
bromuro de etidio.
Bancos de E. coli
Los bancos de cepas fueron realizados según el método descrito por Poutou y
colaboradores (151). Las cepas se crecieron en LB por 12 horas a 37 °C y 250 rpm.
Posteriormente se le agregó al volumen de cultivo igual cantidad de medio
suplementado con glicerol al 60% (v/v). Alícuotas de 1.0 ml fueron congeladas a -70 °C
en viales de crioconservación.
41
Expresión de la IDShr en Escherichia coli JM109-pGEX 3X.
Se realizaron cultivos de E. coli JM109-pGEX 3X en LBA en volúmenes de trabajo de
100 ml empleando fiolas de 500 ml, sometidos a 250 rpm de agitación y 37°C por 18
horas. Los cultivos fueron centrifugados a 4000 rpm por 15 minutos y se tomaron
muestras de sobrenadantes y lisados, obtenidos según metodología descrita, para
pruebas de actividad IDShr y ELISA.
ANALISIS COMPUTACIONAL DE LA ENZIMA IDURONATO 2 SULFATO SULFATASA HUMANA (IDSh) Acceso Computacional a la Secuencia de IDSh
El número de acceso para la IDSh a Gen Bank es AAA63197 (136), a Medline se
realizó por el número 91046030, a PubMed con el código 2122463 y allí se encontró
la secuencia aminoacídica de la IDS, en formato FASTA, necesario para los estudios
computacionales, obtenida a partir de la traducción conceptual del cDNA reportada por
Wilson (12,13).
Accesibilidad, Hidrofobicidad, Flexibilidad
Para la predicción de los perfiles de accesibilidad, hidrofobicidad y flexibilidad se
empleó “ProScale" de ExPASy (152).
Punto Isoeléctrico y Peso Molecular
Para las predicciones del punto isoeléctrico y del peso molecular se utilizó el programa
Comput pI/MW (153).
Sitios de Fosforilación
Los potenciales sitios de fosforilación fueron determinados por Netphos-2 (154).
Sitios de Glicosilación
Los potenciales sitios de O- y N-glicosilaciones fueron establecidos por los programas
Net-Oglyc 3.1 (155) y Net-Nglyc 1.0 (156), respectivamente.
42
Bloques y Prints
Los bloques y prints de similaridad con otras moléculas, se obtuvieron mediante el
programa Findermotif (157).
Perfil de Antigenicidad
Para la determinación del perfil de antigenicidad se utilizó el programa JaMBW Chapter
3.1.7 (158).
Alineamientos
Los alineamientos de secuencias fueron realizados empleando el programa BLAST de
NCBI (159).
Estructura Secundaria
Para predecir la estructura secundaria se empleó “Proteomics and Sequence Análisis
Tools” de ExPASy, la secuencia de 517 aminoácidos se remitió a los siguientes
programas de predicción de estructura secundaria: GOR, GOR 1, GOR 3, nnPred,
Sspro, Casp, Meta-Predict, Fasta, SUB, rdb y Psi-Pred y se obtuvo un consenso de
las predicciones de dichos programas (159-165).
Estructura Terciaria
En la predicción de la estructura terciaria se utilizó “Proteomics tools” de ExPASy,
para lo cual, la secuencia de 517 aminoácidos se remitió a los siguientes programas de
predicción de estructura terciaria: SWISS-MODEL, Geno3d, CPH models, 3D-PSSM,
ProSup, SWEET (166-170). Para construir los fragmentos peptídicos que no tuvieron
predicción computacional se empleó el programa BLAST (159), el cual mediante
múltiples alineamientos permitió obtener fragmentos de otras moléculas con secuencias
similares a la IDSh. Finalmente, los 62 residuos que no se encontraban en ninguno de
los fragmentos obtenidos fueron adicionados manualmente uno a uno, atendiendo a su
orientación de acuerdo a la predicción secundaria, para lo cual se empleó el programa
Swiss-pdb Viewer (spdbv) versión 3.7 (166). El modelo de estructura fue minimizado
con el programa Discover 3, del paquete de Insight II 2004, en un computador Silicon
43
Graphic Octane. Para visualizar la estructura tridimensional, se emplearon los
programas RasMol versión 2.6 (171) y spdbv 3.7 (166).
Modelo Estructural del Sitio Activo
Un análisis teórico y computacional de la comparación de estructura y función de otras
sulfatasas (103-106,172), permitió proponer un modelo para el sitio activo de la IDSh.
Para la construcción del heparán sulfato (uno de los sustratos naturales de la IDSh), se
empleó el programa WebLab Viewer Pro (173).
Análisis de las Mutaciones Puntuales
Un análisis teórico y computacional se realizó para las mutaciones puntuales de la IDSh
(16-39).
44
RESULTADOS SEPARACIÓN DE LA IDURONATO 2-SULFATO SULFATASA HUMANA RECOMBINANTE (IDShr) EXPRESADA EN Pichia pastoris Y Escherichia coli.
Determinación de la Actividad enzimática de la IDShr
La actividad enzimática se determino mediante una técnica fluorométrica (140) y para la
misma se empleó como control plasma humano, el cual se mantenía congelado y se
descongelaba para cada ensayo. Progresivamente junto con las descongelaciones la
actividad de la IDSh disminuía. La tabla 2 muestra las variaciones en actividad catalítica
con relación a los procesos de congelación-descongelación de los plasmas empleados.
Producción de Anticuerpos Policlonales Contra la Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa Humana Recombinante (IDShr). Los animales fueron sacrificados a los 36 días y se obtuvieron de los conejos 1 y 2,
respectivamente, 85 y 50 ml de sangre, de los cuales fueron obtenidos 45 y 30 ml de
suero. Las fracciones de IgG separadas fueron cuantificadas mediante la técnica de
folin-Lowry y el título de los anticuerpos fue determinado por la técnica de Dot blot
(Tabla 3).
Las fracciones purificadas fueron corridas en PAGE-SDS al 12% (Figura 6) y en todos
los casos pudieron evidenciarse las bandas correspondientes a las cadenas livianas y
pesadas de la IgG purificada.
La especificidad del anticuerpo policlonal producido fue comprobada por Western blot,
empleando proteína purificada por TKT (Figura 7). El anticuerpo policlonal reconoció
una banda entre 70 y 80 KDa. Además, en un sobrenadante de E. coli reconoció bandas
de 20, 40, 60 y 120 KDa (Figura 8). En un retentato (fracción entre 30 y 100 KDa) de
M-12 reconoció bandas de 70 y 120 KDa (Datos no mostrados).
45
Tabla 2. Efecto de Procesos de Congelación-Descongelación sobre la Actividad de IDS plasmática
Los plasmas fueron conservados a -20°C, se descongelaron para cada prueba y fueron empleados como control en una prueba fluorométrica con el sustrato MU-αIdoA-2S para la determinación de actividad IDSh
Plasma Pruebas (Horas) Fluorescencia Act. IDS
(nmol/h/mg) Disminución
(%) Primera ( 0h) 10 27 1 Segunda (96 h) 23 10.35 61.66 Tercera (936 h) 1 2.70 90.00 Cuarta (1584 h) 4 1.80 94.44 Primera ( 0h) 57 25.65 2 Segunda (192 h) 30 13.50 47.36 Tercera (1296 h) 11 4.95 80.67 Cuarta (1488 h) 6 2.70 89.47 Primera (0h) 54 36.00 3 Segunda (96 h) 37 16.55 54.02 Tercera (264 h) 23 10.35 71.25 Cuarta (312 h) 12 5.40 85.00 Primera (0h) 225 50.63 4 Segunda (72 h) 54 23.52 53.54 Tercera (696h) 29 13.05 74.22 Cuarta (1704 h) 13 5.85 88.44 Primera (0h) 72 42.89 5 Segunda (360) 45 32.45 24.34 Tercera (504) 24 12.86 70.01 Cuarta (576) 7 5.40 87.40
46
Tabla 3. Concentración y Título de Anticuerpos Policlonales Anti-IDShr (IgG) Obtenidos en Conejos
La concentración de IgG fue determinada por la técnica Folin-Lowry y es expresada en mg/ml, mientras que el título fue establecido mediante Dot blot, empleando IDShr purificada por TKT.
Figura 6. Electroforesis de Anticuerpo Policlonal anti-IDShr. PAGE-SDS al 12%. Carriles: 1 Suero preinmune, Carriles 2, 3, 4 y 5 corresponden a las fracciones 1, 2, 3 y 4 de IgG purificadas empleando una columna de afinidad Hi trap proteina A.
Conejo 1 Conejo 2
Fracción Concentración Título Fracción Concentración Título
Suero Total 39.601 Suero Total 43.60
1 13.10 1/32768, 1 7.84 1/16384
2 7.50 1/16384 2 2.10 1//2048
3 2.00 1//2048 3 0.10 1/256
4 0.01 1/1024 4 0.01 1/128
Concentración Total 30.56
Concentración Total 12.31
50 KDa
25 KDa
1 2 3 4 5
47
1 2 A B Figura 7. Especificidad del Anticuerpo Policlonal Anti-IDShr. A=PAGE-SDS 12%, 1=Marcador de peso molecular 2=IDShr purificada por TKT. B=Western blot de la enzima purificada, empleando como anticuerpo secundario anti-IgG de conejo marcado con peroxidasa.
Figura 8. Western Blot de Sobrenadante de E. coli. Un anticuerpo policlonal anti-IDShr producido en conejo reconoció bandas de 120, 60, 40 y 20 KDa. Se uso como anticuerpo secundario anti-IgG de conejo marcado con peroxidasa.
220 130 90 70 60 40 30 20 16 10
IDShr
120KDa
60 KDa
40 KDa
20 KDa
48
Preparación de una Columna de Afinidad (Superosa 6 GP-anti IDShr).
Se probó la capacidad de reconocimiento de la IDShr por parte de la columna de
afinidad empleando retentato obtenido por ultrafiltración (fracción entre 30 y 100 KDa)
del cultivo M-13. Como buffer de corrida se empleó acetato 0.1 M pH 5.0. Un primer
pico de absorbancia a 280 nm, fue recogido y correspondió a la fracción de proteína no
retenida por la columna que no mostró actividad IDShr. El segundo pico de absorbancia
(Figura 10), contenía IDShr, lo cual se determinó por actividad enzimática. La columna
mostró capacidad de reconocimiento de la IDShr, la cual fue eluída con TBS pH 8.5 y
se recogió en los tubos 16-22, conteniendo cada tubo 1.0 ml. Estas fracciones fueron
concentradas hasta 1.0 ml en centricones Amicon YM-10, los cuales fueron sometidos
a centrifugación a 3.500 rpm por 3.0 h a 4°C y determinadas la concentración de
proteína total y actividad IDShr. La tabla 4 detalla los resultados de este experimento
conducente a la comprobación de inmunoreconocimiento de la IDShr columna
preparada, como etapa final del proceso de separación de la enzima recombinante.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23
Fracciones
Abs
orba
ncia
s
Figura 9. Cromatografía de Afinidad para la IDShr Expresada en P. pastoris. La gráfica muestra los resultados del experimento para comprobar que la columna de Superosa 6 GP-anti IDShr preparada reconocía específicamente la IDShr presente en un retentato (fracción entre 30 y 100 KDa) obtenido por ultrafiltración. La detección de proteínas se realizó mediante la lectura de absorbancia a 280 nm de longitud de onda.
49
Tabla 4. Cuadro Resumen de Ensayo para Demostrar Capacidad de Inmunoreconocimiento de una Columna de Superosa 6 GP anti-IDShr.
El retentato corresponde a la fracción proteíca entre 30 y 100 KDa obtenida por ultrafiltración. La concentración de proteínas se determinó por la técnica de Folin-Lowry y la actividad IDShr se estimó empleando el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S.
Volumen Proteína Proteína Total Act. Específica
Fase (ml) (mg/ml) (mg) (nmol/h/mg) Act. Total (nmol/h) Purificaciones
Recuperación (%)
Sobrenadante 160 2.50 400.00 8.45 3380.00
Ultrafiltración (Retentato) 10 3.04 30.4 9.73 295.79 1.15 8.75
Cromatografía de Afinidad (Eluído) 1.0 2.04 2.04 38.8 79.15 4.59 2.34
50
Separación de la IDShr Expresada en Pichia pastoris
En la tabla 5 se detallan algunas de las condiciones experimentales en las cuales se
realizaron los cultivos. Además de los valores de actividad enzimática la tabla 6 muestra
los resultados para algunos parámetros evaluados en los mencionados cultivos. Para
obtener información acerca de los porcentajes de recuperación de proteína a través del
proceso de separación, esta se cuantificó en las diferentes fracciones del proceso de
ultrafiltración. Para dichas fracciones se utilizó la siguiente nomenclatura: menor a 100
KDa que correspondía al ultrafiltrado por la membrana para excluir moléculas mayores
de 100 KDa; menor a 30 KDa el ultrafiltrado por la membrana para excluir moléculas
menores de 30 KDa y Retentato, que correspondía a la fracción retenida en la
membrana para 30 KDa, es decir entre 30 y 100 KDa. Los resultados presentados en
la tabla 7 indican que menos del 7% del total de proteínas están en el rango de 30-100
KDa y el 70% fuera del mismo. Se evidencia que cerca del 20% de las proteínas
presentes en los cultivos se pierden durante el proceso.
Tabla 5. Condiciones Experimentales de los cultivos M-7 y M-13 de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28.
Cultivos
Condiciones Experimentales M-7 M-13
Porcentaje de oxígeno disuelto Máximo (%OD) 102.1 91.5
Porcentaje de oxígeno disuelto Mínimo (%OD) 39.8 27.5
pH 5.90 5.96
Temperatura (ºF) 85.7 85.5
Los cultivos se realizaron a nivel de birreactor de 3.0 litros durante 120 horas.
51
Tabla 6. Resultados Obtenidos para Algunos Parámetros de los Cultivos M-7 y M-13 de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28.
Cultivos
Parámetros M-7 M-13
Velocidad específica de crecimiento (L/h) 0.15 0.18
Velocidad específica de inducción (L/h) 0.0056 0.0031
Factor de rendimiento Y(x/s) crecimiento 0.47 0.63
Factor de rendimiento Y(x/s) inducción 0.14 0.017
Productividad Máxima (U*1000/h) 444.94(33h) 725.71(35h)
Rendimiento máximo (U/g metanol) 3.12 (33h) 9.54 (35h)
Actividad Proteolítica máxima (UP/ml/min) 0.185 0.211
Actividad IDShr máxima (nmol/h/mg) 29.36 (47h) 25.40 (35h)
Los cultivos se realizaron a nivel de biorreactor de 3.0 litros durante 120 horas.
Tabla 7. Concentración de Proteínas Durante el Proceso de Ultrafiltración de Sobrenadantes de Cultivos de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28
Fracción
Recuperación (%)
Proteína (mg/ml)
Vol (ml)
Proteína
total (mg)
Sobrenadante 3.32 160 531.20 100
Menor a 100 KDa 2.86 150 430.00 80.94
Retentato (Entre 100 y 30 KDa) 3.58 10 35.85 6.75
Menor a 30 KDa 2.66 140 373 70.21
La concentración de proteínas se determinó mediante la técnica de Folin-Lowry.
La figura 10 muestra la electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% con SDS, de un
sobrenadante de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 y de la IDShr purificada por TKT.
52
El patrón electroforético evidencia una banda entre 80 y 90 KDa para la proteína
purificada y para el sobrenadante del cultivo de la levadura, varias bandas en un rango
entre 20 y 120 KDa.
1 2 3 Figura 10. Electroforesis PAGE-SDS 12% de Sobrenadante de Cultivo de
P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 e IDShr pura (TKT). 1=sobrenadante, 2= marcador de peso molecular y 3= IDShr pura.
Con relación al efecto de la diálisis sobre la actividad IDShr se presentaron en las
fracciones no dializadas, disminuciones inferiores al 10% (Tabla 8).
La liofilización afectó la actividad IDShr, disminuyéndola considerablemente. En el
caso del retentato se redujo en 79.33 %, mientras que en las otras feacciones las
disminuciones fueron superiores al 90% (Tabla 9).
IDShr
220 130 90 70 60 40 30 20 16 10
53
Tabla 8. Efecto de la Diálisis Sobre la Actividad IDShr en las Diferentes Fracciones Obtenidas Durante el Proceso de Ultrafiltración.
Se dializó contra TRIS-HCl 0.1 M pH 7.0 durante 24 horas empleando una membrana de 12 KDa. La actividad IDShr se estimó empleando el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S. Tabla 9. Concentración de Proteínas Mediante Liofilización y su Efecto Sobre la Actividad de la IDShr en Fracciones Obtenidas por Ultrafiltración.
SL=Sin liofilizar. La concentración de proteínas se determinó por la técnica de Folin-Lowry y la actividad IDShr se estimó empleando el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S. En cuanto a la separación de la IDShr expresada en P. pastoris, la tabla 10 muestra los
niveles de actividad de varias fracciones separadas mediante la metodología descrita.
Actividad IDShr (nmol/h/mg de proteína) Fracción Dializado No Dializado Disminución (%)
Sobrenadante 1.68 1.52 9.53
Menor a 100 KDa 1.82 1.65 9.44
Retentato 1.79 1.62 9.50
Menor a 30 KDa
1.94 1.83 6.68
Proteínas (mg/ml) Actividad IDShr (nmol/h/mg)
Fracción SL Liofilizado SL Liofilizado Disminución (%)
Sobrenadante 0.58 1.30 3.56 0.302 91.54
Mayor a 100 KDa 0.60 2.07 2.02 0.14 93.07
Menor a 100 KDa 0.54 1.17 2.74 0.25 90.88
Retentato 0.45 1.11 2.66 0.55 79.33
Menor a 30 KDa 0.46 1.43 2.71 0.20 92.62
54
La actividad IDShr alcanzó valores hasta de 58,78 nmol/h/mg de proteína, es decir, más
de cuatro y nueve veces los valores promedio para las muestras de plasma y leucocitos,
respectivamente, procesadas durante cinco años en el laboratorio del IEIM.
La figura 11 muestra un cromatograma de exclusión molecular de los retentatos de
ultrafiltración y son visibles tres picos de absorbancia a 280 nm, presentando actividad
IDShr el primero de ellos. Esta fracción con actividad IDShr se sometió a cromatografía
de afinidad y se recogieron dos fracciones (Figura 12). La primera no retenida, sin
actividad IDShr y la segunda correspondiente a la que contenía la enzima recombinante,
demostrado mediante la prueba de actividad catalítica de IDSh.
Tabla 10. Actividad Enzimática de Fracciones de IDShr Separadas por Cromatografía de Afinidad (Superosa 6 GP-anti-IDS)
Muestra (Cultivo)
Proteína total (mg/ml)
Actividad IDShr (nmol/h/mg)
7 0.91 32.211 12 1.16 2.71
13.1 1.73 37.67 13.2 1.11 58.78 13.3 0.78 14.42
El valor de referencia del IEIM para IDSh plasmática es de 12.41 nmol/h/ml y para leucocitos de 6.96 nmol/h/ml. La concentración de proteínas se determinó por la técnica de Folin-Lowry y la actividad IDShr se estimó empleando el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S. La tabla 11 resume el proceso de separación y señala los niveles de recuperación y
purificaciones alcanzadas. Se evidencia que con niveles de 7 purificaciones solamente
se recuperan 0.22% de proteína y menos del 2% de la actividad. La cuantificación por
ELISA (método indirecto) indica que sólo 8.13% (14.3 µg) de la IDShr de los
sobrenadantes es recuperada en los retentatos y más del 60% (108 µg) se pierde en la
fracción menor a 30 KDa (Tabla 12).
55
Figura 11. Cromatograma de Exclusión Molecular de Retentato de Ultrafiltración de Cultivos de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28. Se utilizó una columna de Sefacryl S-200 y la presencia de proteína se monitoreo mediante absorbancia (AU) a 280 nm. Se señala el pico de absorbancia con actividad IDShr determinada con el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2 .
56
Figura 12. Cromatografía de Afinidad para la Separación IDShr Expresada en P. pastorisGS115 pPIC9-IDS/28. Se empleó una columna de Superosa 6 GP anti-IDS y la presencia de proteína se monitoreo mediante absorbancia (AU) a 280 nm. El primer pico de absorbancia corresponde a proteína no retenida. Se señala el pico eluído con TBS pH 8.5, el cual presentó actividad IDShr determinada con el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S.
57
Tabla 11. Separación de la IDShr Expresada en Pichia pastoris GS115 pPIC9-IDS/28
Se empleó ultrafiltración secuencial con membranas de 100 y 30 KDa, exclusión molecular con Sefacryl S-200 y cromatografía de afinidad utilizando Superosa 6 GP- anti IDShr. La concentración de proteínas se determinó por la técnica de Folin-Lowry y la actividad IDShr se estimó empleando el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S. El retentato corresponde a la fracción entre 30 y 100 KDa.
Volumen
Fase (ml) Proteína (mg/ml)
Proteína Total (mg)
Act. Esp (nmol/h/mg)
Act. Total (nmol/h) Purificaciones
Recuperación (%)
Sobrenadante 160 3.3 528 8.27 4366.65
Ultrafiltración (Retentato) 10 4.3 430 17.65 758.95 2.13 17.38
Exclusión Molecular 2.0 2.6 5.20 20.12 104.62 2.43 2.39
Cromatografía Afinidad 2.0 0.60 1.20 58.00 69.60 7.01 1.59
58
Tabla 12. Cuantificación Mediante ELISA de la IDShr Expresada en Pichia pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 Durante las Fases del Proceso de Ultrafiltración.
Fracción
Volumen
(ml)
Proteína
(µg/ml)
Proteína Total
(µg)
IDShr
(µg/ml)
IDShr Total
(µg)
IDShr
(%)
Recuperación
IDShr (%)
Sobrenadante 160 330 52800 1.10 176 0.33
Menor de 100 KDa 150 270 40500 0.94 141 0.34 80.11
Menor de 30 KDa 135 250 33750 0.80 108 0.32 61.36
Retentato 10 340 3400 1.43 14.3 0.42 8.13
Se empleó ultrafiltración secuencial con membranas de celulosa de 100 y 30 KDa. El retentato corresponde a la fracción entre 30 y 100 KDa. La concentración de proteínas se determinó por la técnica de Folin-Lowry y la actividad IDShr se estimó empleando el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S.
59
Separación de la IDShr Expresada en Escherichia coli.
Inicialmente se realizaron cultivos durante 24 horas con volúmenes de trabajo de 100 ml
de LBA y MMA, detectándose actividades IDShr máximas de 0.54 y 0.010 nmol/h/mg
de proteína, respectivamente. La producción se escaló a 500 ml empleando LBA y se
detectó actividad máxima de 0.75 nmol/h/mg de proteína, a las ocho horas de
crecimiento. Tomando como referencia este tiempo, se realizó un ensayo preliminar de
escalado a 1.0 L en biorreactor y se encontró una actividad de 1.91 nmol/h/mg de
proteína (Tabla 13).
Con el propósito de separar la IDShr se hicieron cultivos de ocho horas con volúmenes
de trabajo de 100 ml y/o 500 ml, los sobrenadantes fueron utilizados para el proceso de
separación de la enzima recombinante. La tabla 14 muestra las concentraciones de
proteínas y actividad IDShr de las fracciones de cada una de las etapas del proceso de
ultrafiltración.
Retentatos obtenidos por ultrafiltración fueron sometidos a exclusión molecular y las
fracciones con actividad IDShr se corrieron en cromatografía de afinidad. La tabla 15,
muestra que aunque fueron obtenidas fracciones de la exclusión molecular con actividad
IDShr, la cromatografía de afinidad no separó la IDShr presente en las mismas.
La figura 13 muestra un cromatograma típico de exclusión molecular de retentato
obtenido por ultrafiltración. En todos los casos se observaron dos picos de absorbancia
muy próximos que trataron de resolverse aumentando la longitud de la columna hasta
80 cm, sin embargo los resultados fueron similares. Estas fracciones presentaron
actividad IDShr (Tabla 14). La tabla 16 permite observar que con purificaciones del
orden de 2.68, el porcentaje de recuperación estuvo por debajo del 1%
60
Figura 13. Cromatograma de Exclusión Molecular de Retentato de Ultrafiltración de Cultivos de E. coli JM 109 pUC13-IDS/28. Se empleó una columna de Sefacryl S-200 y la presencia de proteína se monitoreo mediante absorbancia (AU) a 280 nm. Los dos picos de absorbancia presentaron actividad IDShr que fue determinada con el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S.
61
Tabla 13. Actividad IDShr en cultivos de E. coli JM109-pUC-13/IDS en tres niveles de escalado.
Se utilizó medio de cultivo LB suplementado con 50 µg/ml de ampicilina y 3.0 mM de tiramina. La concentración de proteínas se determinó por la técnica de Folin-Lowry y la actividad IDShr se estimó empleando el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S.
Tabla 14. Concentración de Proteínas y Actividad IDshr en E. coli JM 109-pUC 13/IDS Durante el Proceso de Ultrafiltración de Sobrenadantes y en Lisados
Fracción Proteína (mg/ml) Act. IDShr (nmol/h/mg)
Sobrenadante 3,93 1.20
Menor a 100 KDa 3,78 1,19
Retentato 2,81 1,86
Menor a 30 KDa 3,59 0,4
Lisados 1,55 2,82
El retentato corresponde a la fracción entre 30 y 100 KDa. La concentración de proteínas se determinó por la técnica de Folin-Lowry y la actividad IDShr se estimó empleando el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S.
Volumen Act. IDShr
LBAT (ml) Proteína Total
(mg/ml) Tiempo de Cultivo
(horas) (nmol/h/mg)
100 2,48 8 0,54 500 2,94 8 0,75 1000 2,16 8 1,91
62
Tabla 15. Separación Cromatográfica de IDShr Expresada en E. coli JM 109 pUC-13/IDS.
Los retentatos (fracción entre 30 y 100 KDa), fueron obtenidos por ultrafiltración. Para la exclusión molecular se empleó una columna de Sefacryl S-200 y la cromatografía de afinidad se realizó utilizando una columna de Superosa 6 GP anti-IDShr. La concentración de proteínas se determinó por la técnica de Folin-Lowry y la actividad IDShr se estimó empleando el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S. NR = No retenida, ND = No determinada.
Exclusión Molecular Cromatografía de Afinidad
Muestra Proteína Act. IDShr Proteína Act. IDShr
(Retentato) (mg/ml) (nmol/h/mg) (mg/ml) (nmol/h/mg)
A 2.75 3.88 NR ND
F 2.85 4.22 NR ND
L 2.88 3.25 NR ND
H 2.62 3.99 NR ND
K 2.96 2.03 NR ND
63
Tabla 16. Separación de IDShr Expresada en E. coli JM109-pUC-13/IDS.
Se empleó ultrafiltración secuencial con membranas de celulosa de 100 y 30 KDa, el retentato corresponde a la fracción entre 30 y 100 KDa, exclusión molecular con Sefacryl S-200 y cromatografía de afinidad utilizando Superosa 6 GP- anti IDShr. La concentración de proteínas se determinó por la técnica de Folin-Lowry y la actividad IDShr se estimó empleando el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S.
Volumen Proteína Proteina Total Act. Específica
Fase (ml) (mg/ml) (mg) (nmol/h/mg) Act. Total (nmol/h/) Purificaciones
Recuperación (%)
Sobrenadante 160 3.93 628.8 1.20 754.57
Ultrafiltración (Retentato) 10 2.81 28.1 1.86 52.27 1.55 22.30
Cromatografía de Afinidad (Eluído) 2.0 0.82 1,64 3.22 5.28 2.68 0.70
64
EXPRESION DE LA IDURONATO 2-SULFATO SULFATASA HUMANA RECOMBINANTE (IDShr) EN Escherichia coli EMPLEANDO EL SISTEMA DE FUSION DE GENES GLUTATION S-TRANSFERASA (GST).
Los perfiles electroforéticos de los ADN plasmídicos obtenidos a partir de las colonias
de E. coli JM 109 transfectadas con el plasmido pGEX 3X-IDS y crecidas en agar
LBA, mostraron en cuatro casos bandas de aproximadamente 6.5 Kb, es decir el tamaño
del constructo de expresión. De las cuatro bandas se seleccionó la de mayor intensidad y
se procedió a realizar un banco. Se efectuaron pruebas de actividad y cuantificación de
IDShr por ELISA en sobrenadante y lisado celular. En el lisado se detectó IDShr en
cantidad de 17.28 ng/mg de proteína, pero no se detectó actividad enzimática.
ANALISIS COMPUTACIONAL DE LA IDURONATO 2-SULFATO SULFATASA HUMANA (IDSh)
El gen de la IDSh (12), codifica para un precursor de 550 aminoácidos, de los cuales 25
corresponde al péptido señal y otros ocho residuos son eliminados posteriormente
durante el procesamiento de la enzima (Figura 14). La IDSh está conformada por 29 A
(5.6%) 24 R (4.6%), 21 D (7.5%), 39 N(4.1%), 6 C(1.2%), 23 Q(4.4%), 24 E(4.6%),
29 G (5.6%), 15 H (2.9%) , 22 I (4.3%), 55 L (10.6), 19 K (3.7%), 8 M (1.5%), 28 F
(5.4%), 49 P (9.5%), 41 S (7.9), 21 T (4.1), 7 W (1.4%), 26 Y (5.0%), 31 V(5.6%).
Tiene 63 residuos negativos y 43 positivos.
MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSETQANSTTDALNVLLIIVDDLRPSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAYNPWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLQLANSTIIAFTSDHGWALGEHGEWAKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASLPEAGEKLFPYLDPFDSASQLMEPGRQSMDLVELVSLFPTLAGLAGLQVPPRCPVPSFHVELCREGKNLKHFRFRDLEEDPYLPGNPRELIAYSQYPRPSDIPQWNSDKPSLKDIKIMGYSIRTIDYRYTVWVGFNPDEFLANFSDIHAGELYFVDSDPLQDHNMYNDSQGGDLFQLLMP Figura 14. Secuencia aminoacídica de la IDSh. Los primeros 25 residuos corresponden al péptido señal (rojo) y otros ocho aminoácidos (azul) son hidrolizados durante el procesamiento de la enzima. En verde se indican los sitios de N-glicosilación.
65
Hidrofobicidad, Accesibilidad y Flexibilidad. El perfil de hidrofobicidad (Figura 15), muestra variaciones para las diferentes regiones
de la proteína entre -2.5 y 3. Sin embargo, cerca del 80% de las zonas no superan el 1.5
y una pequeña región entre los residuos 1 y 35 resulta en una marcada hidrofobicidad.
El perfil de accesibilidad, en una escala de 0-8, muestra que los valores varían entre 4.2
y 7.8 y que ninguna zona de la molécula presenta valores inferiores a 4. Un alto
porcentaje de la enzima tiene valores de accesibilidad entre 5.5 y una pequeña región
hasta 7.8 (Figura 16). El perfil de flexibilidad (Figura 17), en una escala de 0-0.5,
demuestra que la IDSh es una molécula muy flexible, puesto que la misma presenta
valores que fluctúan entre 0.39 y 0.49 y el 95% de la molécula tiene valores de
flexibilidad superiores a 0.42. Existen dos zonas altamente flexibles, la primera entre
los residuos 50 y 80 que corresponden en el péptido maduro a la región de posiciones
80-110 y la segunda que corresponde a la zona del péptido maduro desde el residuo 440
hasta el final de la proteína, en donde se encuentra el residuo R468, considerado un sitio
altamente mutable.
Punto Isoeléctrico y Peso Molecular
Los valores de predicción computacional fueron 5.15 para el punto isoeléctrico y
58.479 KDa para el peso molecular.
Sitios de Fosforilación
En la secuencia de la IDSh existen 26 sitios potenciales de fosforilación (Figura 18), 14
serinas (posiciones 50, 90, 149, 152, 162, 201, 217, 299, 305, 316, 369, 470, 477, 481),
5 treoninas (posiciones 93, 99, 170, 195, 500) y 7 tirosinas (posiciones 128, 151, 158,
165, 306, 348, 452).
66
Figura 15. Perfil de Hidrofobicidad de la IDSh. para el análisis computacional fue empleado ProScale" de ExPASy y se empleó la secuencia del péptido maduro, es decir, el aminoácido 1 de la figura corresponde al residuo 34 del péptido maduro.
67
Figura 16. Perfil de Accesibilidad de la IDSh. Para el análisis computacional fue empleado ProScale" de ExPASy y se empleó la secuencia del péptido maduro, es decir, el aminoácido 1 de la figura corresponde al residuo 34 del péptido maduro .
68
Figura 17. Perfil de Flexibilidad de la IDSh. Para el análisis computacional fue empleado ProScale" de ExPASy y se empleó la secuencia del péptido maduro, es decir, el aminoácido 1 de la figura corresponde al residuo 34 del péptido maduro.
69
Sitios de Glicosilación
La figura 19 muestra los potenciales sitios de O-glicosilación. Sin embargo, ninguno de
los residuos de T, S o Y es considerado con potencial presencia de glicósidos. Para el
caso de las N-glicosilaciones se establecieron siete potenciales sitios de glicosilación en
residuos de asparagina, en presencia de secuencias N-X-T/S (Figura 20). Los sitios
potenciales de N-glicosilación son las asparaginas en posiciones 115, 144, 246, 280,
325, 513 y 537.
Figura 18. Sitios Potenciales de Fosforilación en la IDSh. Para el análisis computacional fue utilizado el programa Netphos-2.0 y se empleó la secuencia del péptido maduro, es decir, el aminoácido 1 de la figura corresponde al residuo 34 del péptido maduro.
70
Figura 19. Sitios Potenciales de O-glicosilación (Presencia de T, S o Y) en la IDSh. Para el análisis computacional fue utilizado el programa Net-Oglyc 3.1 y se empleó la
secuencia del péptido maduro, es decir, el aminoácido 1 de la figura corresponde al residuo 34 del péptido maduro.
Figura 20. Sitios potenciales de N-glicosilación en la IDSh. Para el análisis computacional fue utilizado el programa Net-Nglyc 1.0 y se empleó la secuencia del péptido maduro, es decir, el aminoácido 1 de la figura corresponde al residuo 34 del péptido maduro.
71
Bloques y Prints
Los bloques y los prints son secuencias con similaridad, sin embargo el tamaño de los
prints es mayor que el de los bloques. Se encontraron prints comunes con moléculas de
las familias de las sulfatasas (sulfatasas 1 y 2), rodopsinas y caderinas Con relación a
los bloques, se encontraron motivos similares con 114 moléculas, entre ellas ATP
sintasa, transaldolasa, glutamato metiltransferasa, guanilato ciclasa, luciferasa,
fosfoglucoisomerasa, fosfolipasa A2, fosfodiesterasa tipo I, ARN polimerasa, MAP
kinasa, proteína CAP, proteína M, giberelina, flagelina, interlucina 13, citocromo C,
proteína ribosómica 16S, proteina resistente a tetraciclina, toxina difterica, proteína
sigma de Salmonella virulens, factor de elongación 1, factor de transcripción TFIID,
replicasa de luteovirus, P-40 del herpes virus y otras.
De las cinco moléculas con similaridad en prints y las 114 con bloques similares a
secuencias de la IDS, solamente las dos sulfatasas mencionadas tienen estructura
tridimensional determinada experimental. Sus números de acceso a SWISSPROT son
PS00523 y PS00149, que en NCBI corresponden a P15289 y P15848. Estas moléculas
son las Arylsulfatasas A (EC. 3.1.6.8) y B (EC. 3.1.6.12). Las secuencias de estas
enzimas fueron alineadas con la secuencia de la IDSh.
Alineamientos
El alineamiento de la IDSh con la aril sulfatasa B(1FSU), mostró que existe un 24% de
similaridad (98/407) y 37% de positividad (154/407), mientras que el 22% (91/407)
corresponde a gaps. En el segundo caso, alineamiento con aril sulfatasa A (1AUK),
estos mismos parámetro fueron 26% (125/474), 38% (183/474) y 16% (80/474),
respectivamente. Los alineamientos se presentan en las figuras 21 y 22. Las siglas
1FSU y 1AUK son los códigos de identificación en el banco de datos de proteínas del
Brookhaven National Laboratory. El término similaridad significa que existe el mismo
aminoácido en la posición, mientras que positividad indica existe un residuo parecido.
Se habla de un gap cuando el programa tiene que realizar un movimiento sobre la
secuencia alineada para poder encontrar un aminoácido igual o parecido al que se
compara con la otra molécula.
72
Query: 5 NVLLIIVDDLR-PSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRR 63 N++LI DDL LGCYG +PN+DQLA+ L F + + ++ PSR + LTGR Sbjct: 4 NIVLIFADDLGYGDLGCYGHPSSTTPNLDQLAAGGLRFTDFYVPVSLATPSRAALLTGRL 63 Query: 64 PDTTRLYDFNSYWRVHAG---NFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYS 119 P +Y G T+ + GY+T GK +H G+ P+ Sbjct: 64 PVRMGMYPGVLVPSSRGGLPLEEVTVAEVLAARGYLTGMAGK-WHLGVGPEGAFLPPHQG 122 Query: 120 ---WSFPPYHPSSEKYENTKTCRGP----DGELHANLLCPVDVL-----DVPEGTLPDKQ 167 + PY +N TC P DG L+ P+ +L + LP + Sbjct: 123 FHRFLGIPYSHDQGPCQNL-TCFPPATPCDGGCDQGLV-PIPLLANLSVEAQPPWLPGLE 180 Query: 168 STEQAI--QLLEKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDG 22 + A L+ + PFFL H H P + F Sbjct: 181 ARYMAFAHDLMADAQRQDRPFFLYYASHHTHYPQFSGQSFA------------------- 221 Query: 226 LPPVAYNPWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSAL 285 +R R + S+ LD VG L++A+ Sbjct: 222 ----------------------------------ERSGRGPFGDSLMELDAAVGTLMTAI 247 Query: 286 DDLQLANSTIIAFTSDHG---WALGEHG-----EWAKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASL 337 DL L T++ FT+D+G + G K + ++ P + + PG A Sbjct: 248 GDLGLLEETLVIFTADNGPETMRMSRGGCSGLLRCGKGTTYEGGVREPALAFWPGHIA—305 Query: 338 PEAGEKLFPYLDPFDSASQLMEPGRQSMDLVELVSLFPTLAGLAGLQVP 386 PG + +L + L PTLA LAG +P Sbjct: 306 ----------------------PG-VTHELASSLDLLPTLAALAGAPLP 331 Figura 21. Alineamiento de la IDSh con la Arilsulfatasa B. (Sbjct = IDS, Querry = ARSB). Existe 24% de similaridad (98/407), 37% de positividad (154/407) y 22% (91/407) corresponde a gaps. Para el análisis computacional se empleò el programa BLAST.
Query: 120 W-SFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLL-CPVDVLDVPEGTLPDKQS------TEQ 171 + ++ Y SE Y + + C D N+ C +D D E K T++ Sbjct: 121 FDTYFGYLLGSEDYYSHERCTLIDA---LNVTRCALDFRDGEEVATGYKNMYSTNIFTKR 177 Query: 172 AIQLLEKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAY 231 AI L+ P FL + H P + P+E+ K Sbjct: 178 AIALITNHPPE-KPLFLYLALQSVHEPLQVPEEYLK------------------------ 212 Query: 232 NPWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDF-QRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLQL 290 P DF Q K R Y VS +D VG + +AL L Sbjct: 213 ------------------------PYDFIQDKNRHHYAGMVSLMDEAVGNVTAALKSSGL 248 Query: 291 ANSTIIAFTSDH-GWALGEHGEWAKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASLPEAGEKLFPYLD 349 N+T+ F++D+ G L W + GR SL E G + ++ Sbjct: 249 WNNTVFIFSTDNGGQTLAGGNNWP----------------LRGRKWSLWEGGVRGVGFV- 291 Query: 350 PFDSASQLMEPGRQSMDLVELVSLFPTLAGLAGLQVPPRCPVPSFHV 396 ++ L + G ++ +L+ + PTL LA P+ F V Sbjct: 292 ---ASPLLKQKGVKNRELIHISDWLPTLVKLARGHTNGTKPLDGFDV 335
Figura 22. Alineamiento de la IDSh con la Arilsulfatasa A. (Sbjct = IDS, Querry = ARSA). Existe 26% de similaridad (125/474), 38% de positividad (183/474), mientras que 16% (80/474) corresponde a gaps. Para el análisis computacional se empleò el programa BLAST.
73
Estructura Secundaria Con los resultados de cada programa de predicción de estructura secundaria, residuo
por residuos, se construyó la tabla 17 la cual es presentada en fragmentos de 20
aminoácidos para facilitar su comprensión. Los dos números en el encabezado de la
última columna corresponde a la posición de los residuos en la proteína madura y la
última fila de la tabla es el consenso de los programas empleados computacionalmente.
El consenso de las predicciones de los programas empleados, permitió la construcción
de un modelo para la estructura secundaria de la IDSh. Para el mismo, los loops
(enrollamientos al azar) y turns (vueltas) se homologaron a coils, por lo cual la
presentación del esquema se hace solamente con base en hélices, hojas plegadas y coils,
correspondiendo a cada una de estas estructuras el 33, 13 y 54%, respectivamente. Las
regiones sin predicción computacional, fueron establecidas con base en los aminoácidos
y las estructuras contiguas a estas regiones. La figura 22 representa el modelo de
predicción de la estructura secundaria de la enzima, las regiones no predichas por
consenso, fueron establecidas con base en los aminoácidos y las estructuras contiguas a
estas regiones.
Tabla 17. Predicción Computacional de la Estructura Secundaria de la IDSh Mediante 11 Programas de Predicción de Estructura de Proteínas.
Secuencia IDS T D A L N V L L I I V D D L R P S L G C 34-53 GOR H H H H H H E E E E E E T C C T T T T T GOR1 H H H H H H E E E E E E E E E T T E E T GOR3 H H H H H H H H E H H C C C C C C C C C Nnpredict H H H E E E E E Sspro C C C C C E E E E E E E C C C C C C C C Casp C C C C C E E E E E E C C C C C C C C C MetaPred L L L L L L E E E E E E L L L L L L L L Fasta L L L L L E E E E E E L L L L L L L L L SUB L E E E E E L L L Psi-Pred C C C C C E E E E E E E C C C C C C C C Rdb E L L L L E E E E E E L L L L L L L L L Concenso H H H E E E E E E E L C C C C L L C
74
Secuencia IDSh Y G D K L V R S P N I D Q L A S H S L L 54-73 GOR T T E E E E E C C T C E E E E C E C H H GOR1 E E E E E E E E E T H H E E H H H H H H GOR3 C C C E E E E C C C H H H H H H H H H H Nnpredict H H H H H H H H Sspro C C C C C C C C H C H H H H H H C C C E Casp C C C C C C C C C C H H H H H H H C C E MetaPred L L L L L L L L L L H H H H H H H L L L Fasta L L L L L L L L L L H H H H H H H L L E SUB L L L L L L H H H H H H H Psi-Pred C C C C C C C C C H H H H H H H C C E E Rdb L L L L L L L L L L H H H H H H H L L E Concenso L L L L L L H H H H H H H H H H Secuencia IDSh F Q N A F A Q Q A V C A P S R V S F L T 74-93 GOR H H H H H H H E E E E E T T E E E E E T GOR1 H H H H H H H H E E E E E T E E E E E E GOR3 H H H H H H H H H E C C C C E E E E E E Nnpredict H H H H H H H H H H E E Sspro E C C E E C C C C C C C H H H H H H H C Casp E C C C E C C C C C C C C C H H H H H H MetaPred E L L L E L L L L L L L L L H H H H H H Fasta E L L L E L L L L L L L L L H H H H H H SUB H H H H H H H H H L E Psi-Pred E E E E E E C C C C C C H H H H H H H H Rdb E L L L E L L L L L L L L L H H H H H H Concenso E H H H E H H H C C L H H H H H H Secuencia IDSh G R R P D T T R L Y D F N S Y W R V H A 94-113 GOR T C C T T E E E E T T T T T T T E E T C GOR1 T C C T T E E E E E T T T T T E E E E C GOR3 E C C C C C E E E E E H C C E E E E E E Nnpredict E H E E E E Sspro C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C Casp C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C MetaPred L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Fasta L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L SUB L L L L L L Psi-Pred C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C Rdb L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Concenso L C C L E C C E E C
75
Secuencia IDSh G N F S T I P Q Y F K E N G Y V T M S V 114-133GOR T T T C C E E T E T T T T T T E E E E E GOR1 T T T C E E E E E E T T T T T E E E E E GOR3 C C C C C C E E E E C C C C E E E E E E Nnpredict E E E E E E Sspro C C C C H H H H H H H H C C C C E E E E Casp C C H H H H H H H H H H H C C C E E E E MetaPred L L H H H H H H H H H H H L L L E E E E Fasta L L H H H H H H H H H H H L L L E E E E SUB L L L L L E E E E E Psi-Pred C C C C C H H H H H H H C C C C E E E E Rdb L L H H H H H H H H H H H L L L E E E E Concenso H H H H H H H H H H H E E E E E Secuencia IDSh G K V F H P G I S S N H T D D S P Y S W 134-153GOR E E E E E C T C C C T C T T T C T T T T GOR1 E E E E E E T C C C T C T T T C T T T T GOR3 E E E E E C C C C C C C C C C C C C E E Nnpredict E E Sspro E E E C C C C C C C C C C C C C C C C C Casp C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C MetaPred L L L L L L L L L L L L L L L L L L Fasta L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L SUB L L L L L L L L L L L L L L L L Psi-Pred C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C Rdb L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Concenso E E E E L C C C C L C L L L Secuencia IDSh S F P P Y H P S S E K Y E N T K T C R G 154-173GOR C E C T C C C C C T T T T T T T T T C C GOR1 E E E T C C C C C H H H H T T T T T T C GOR3 E C C C C C C C C C C E C C C E E C C C Nnpredict Sspro C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C Casp C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C Meta Pred L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Fasta L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L SUB L L L L L L L L L L L L L L Psi-Pred C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C Rdb L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Concenso C C C C C C C C L L L L L L L L C
76
Secuencia IDSh P D G E L H A N L L C P V D V L D V P E 174-193GOR C T C H H H H H H E E E E E E E E E C T GOR1 C T H H H H H H H E E E E E E E E E E T GOR3 C C C C C C H C H C C C C C C C C C C C nnpredict Sspro C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C Casp C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C MetaPred L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Fasta L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L SUB L L L L L L L L L Psi-Pred C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C rdb L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Concenso C C C C C C L L L L C C C C C L C C Secuencia IDSh G T L P D K Q S T E Q A I Q L L E K M K 194-213GOR T C C C T C C C H H H H H H H H H H H H GOR1 T H C C T H H H H H H H H H H H H H H H GOR3 C C C C C C C H H H H H H H H H H H H H nnpredict H H H H H H H H H H Sspro C C C H H H H H H H H H H H H H H H H H Casp C C C C H H H H H H H H H H H H H H H H MetaPred L L L H H H H H H H H H H H H H H H H H Fasta L L L L H H H H H H H H H H H H H H H H SUB L L L L L L L L H H H H H H H H H Psi-Pred C C C C H H H H H H H H H H H H H H H C rdb L L L L H H H H H H H H H H H H H H H H Concenso C C C H H H H H H H H H H H H H H H H Secuencia IDSh T S A S P F F L A V G Y H K P H I P F R 214-233GOR T C C C H H H H H H T T C C T T E E T C GOR1 H H H H H H H H H H T T C C T E E E T E GOR3 H H H C H H H H H H H C C C C C C C C C nnpredict E E E E E Sspro C C C C C E E E E E E C C C C C C C C C Casp C C C C C E E E E E E E C C C C C C C C MetaPred L L L L L E E E E E E E L L L L L L L L Fasta H L L L L L E E E E E E E L L L L L L L SUB L L L E E E E E L L L L L L L L L Psi-Pred C C C C C E E E E E C C C C C C C C C C rdb L L L L L H H H H H E E L L L L L L L L Concenso C E E E E E E E C C L L L L L C
77
Secuencia IDSh Y P K E F Q K L Y P L E N I T L A P D P 234-253GOR C T T T T E E C C C T E E E E C C C C C GOR1 C T T H H H E E C H H E E E E E C C C E GOR3 C C H H H H H H C H H H H H H C C C C C nnpredict H Sspro C C H H H H H H H H C C C C C C C C C C Casp C C H H H H H H C C H H C C C C C C C C MetaPred L L H H H H H H L L H H L L L L L L L L Fasta L L L H H H H H H L L H H L L L L L L L SUB L L H L L L L L L Psi-Pred C C C H H H C C C C C C C C C C C C C C rdb L L H H H H H H L L H H L L L L L L L L Concenso C H H H H H H C H H C C C C C Secuencia IDSh E V P D G L P P V A Y N P W M D I R Q R 254-273GOR T E T T C C C C E E E C T T E E E E H T GOR1 E E E T E E E E E E E E T T E E H E H H GOR3 C C C C C C C C C C C C C C H H H H H H nnpredict H H H E E E E E E H H H H H Sspro C C C C C C C C C C C C C C H H H H C C Casp C C H H H H H H H H H C C C C H H H H H MetaPred L L H H H H H H H H H L L L L H H H H H Fasta L L L H H H H H H L L H H L L L L L L L SUB L L L H H H H H H H H H L L L L H H H H Psi-Pred C C H H H H H H C C C C C C C H H C C C rdb L L H H H H H H H H H H H L L H H H H H Concenso L L H H H H H H H H H C C L H H H H H Secuencia IDSh E D V Q A L N I S V P Y G P I P V D F Q 274-293GOR H H H H E E E E E E T T C C E E E E E E GOR1 H H H H E E E E E E T T E E E E E E E E GOR3 H H H H E E E C C C C C C C C C E H E E nnpredict E H H H Sspro C C C C C C C C C C C C C C C C H H H H Casp H H H H H C C C C C C C C C C C H H H H MetaPred H H H H H L L L L L L L L L L L H H H H Fasta H H H H H L L L L L L L L L L L H H H H SUB H H L L L L L H H H H Psi-Pred C H H C C E E C C C C C C C C C H H H H rdb H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H Concenso H H H H H E E C C C L C C C C C H H H H
78
Secuencia IDSh R K I R Q S Y F A S V S Y L D T Q V G R 294-313GOR E T T T T T E E E C E C T T T E E E E E GOR1 E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E GOR3 H H H E E E E E E E E E E C C H H H H H nnpredict E E E E H H Sspro H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H Casp H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H MetaPred H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H Fasta H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H SUB H H H H H H E E E H H Psi-Pred H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H rdb H H H H H H H H L L L L L E E E E E E L Concenso H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H Secuencia IDSh L L S A L D D L Q L A N S T I I A F T S 314-333GOR E E E H H H H H H H H H C E E E E E E C GOR1 E E E H H H H H H H H H E E E E E E E C GOR3 H H H H H H H H H H H H H H E E E E E H nnpredict H H Sspro H H H H H H H C C C C C C E E E E E E C Casp H H H H H H H H C C C C E E E E E E E C MetaPred H H H H H H H H L L L L L E E E E E E L Fasta H H H H H H H H L L L L L E E E E E E L SUB H H H H H H H H H H H E E E Psi-Pred H H H H H H H C C C C C C E E E E E E C rdb L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Concenso H H H H H H H H H H H L E E E E E E E Secuencia IDSh D H G W A L G E H G E W A K Y S N F D V 334-353GOR T C T C C C C C H C H H H T T C T T T C GOR1 T C T C H H H H H H H H H H H C T T H E GOR3 C C C H E H H C H C H H H H H C H H H H nnpredict H H H H H E H H H H H H H H Sspro C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C Casp C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C MetaPred L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Fasta L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L SUB Psi-Pred C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C rdb L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Concenso C C C C C C C C H C H H H C L L L C
79
Secuencia IDSh A T H V P L I F Y V P G R T S S L P E A 354-373GOR E E E E E E E E E E C T T C C C C C H H GOR1 T C T C H H H H H H H H H H H C T T H E GOR3 H H E C C E E E E E C C C C C C C C H H nnpredict H H H H H Sspro C C C E E E E E E C C C C C C C C C C C Casp C C C C C E E E E C C C C C C C C C C C MetaPred L L L L L E E E E L L L L L L L L L L L Fasta L L L L L E E E E L L L L L L L L L L L SUB E E E E E L L L L L L H H Psi-Pred C C C E E E E E E C C C C C C C C C C C rdb L L L L L E E E E L L L L L L L L L L L Concenso C E E E E E C C C C C C H H Secuencia IDSh G E K L F P Y L D P F D S A S Q L M E P 374-393GOR H H H E E E T E C C T T H H C C C C C C GOR1 H H H E E E E E C C T H H H H H H E E H GOR3 H H H H C H C C C C C C C H H H H C C C nnpredict H H H H H H H H Sspro C C C C C C H C C C H H H H H H H C C C Casp H C C C C C C C C C C C C H H H H H H C MetaPred H L L L L L L L L L L L L H H H H H H L Fasta H L L L L L L L L L L L L H H H H H H E SUB H L L L L L L L L L Psi-Pred C C c C C C C C C C C C C C H H H H C C rdb H L L L L L L L L L L L L E E E E E E L Concenso H H H L L L C C L L H H H H H C C Secuencia IDSh G R Q S M D L V E L V S L F P T L A G L 344-413GOR T T H C H E E E E H H H H E H H H H C C GOR1 T H H H H H E E H H H H H E H H H H H H GOR3 C C C C C H H E H H H H H H H H H H H H nnpredict E E E Sspro C C C C C C C C C C C C H H H H H H H C Casp C C C C C C E E C H H C H H H H H H H H MetaPred L L L L L L E E L H H L H H H H H H H H Fasta L L L L L L L E E L H H L H H H H H H H SUB L L H H H H H H Psi-Pred C C C C C C C E E E C C H H H H H H H H rbd L L L L L L E E L H H L H H H H H H H H Concenso C C C E E E H H H H H H H H H H H
80
Secuencia IDSh A G L Q V P P R C P V P S F H V E L C R 414-433GOR C T E E E E T T E T C T T E E H H H H H GOR1 E E E E E E T E E E E E E E H H H H H H GOR3 C C C C C C C C C C C C C C C E E H H H nnpredict H E E E E E E E Sspro C C C C C C C C C C C C C C C H E H E C Casp H C C C C C C C C C C C C C C C C C C C MetaPred H L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Fasta H H L L L L L L L L L L L L L L L L L L SUB L L L L L L L L L H H H H H Psi-Pred C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C rdb H L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Concenso C C C C C C H H H H Secuencia IDSh E G K N L L K H F R F R D L E E D P Y L 434-453GOR H H H H H H H H H H H C C C T T C T T C GOR1 H H H H H H H H H H H H H H T T C T T C GOR3 H C H H H H H H H H H H H H C C C C C C nnpredict E E E E E E E E H H H Sspro C C C C C C C C C C C C C C C C C C C Casp C C C C H H H H H C C C C C C C C C E E MetaPred L L L L H H H H H H L L L L L L L L E E Fasta L L L L L H H H H H L L L L L L L L L E SUB H H H H H H H H H L L L L L L Psi-Pred rdb L L L L H H H H H L L L L L L L L L E E Concenso H H H H H H H H H L L C L E Secuencia IDSh P G N P R E L I A Y S Q Y P R P S D I P 454-473GOR T C C C E E E E E E T T C T C T T C E C GOR1 T C C C E E E E E E E E C T C T T E E E GOR3 C C C C C E E E E C C C C C C C C C C C nnpredict E E E Sspro C C C C C C C H C C C C C C C C C C C C Casp E E E C C C C H H H C C C C C C C C C C MetaPred E E E L L L L H H H L L L L L L L L L L Fasta E E E L L L L H H H L L L L L L L L L L SUB L L L E E E E E L L L L L L L L Psi-Pred C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C rdb E E E L L L L H H H L L L L L L L L L Concenso E C C C C E E E H C C C C C C
81
Secuencia IDSh Q W N S D K P S L K D I K I M G Y S I R 474-493GOR T T C T T C T C H H H E E E E E E E E E GOR1 T E C T T C T C H H H E E E E E E E E E GOR3 E C C C C C C C H H H H H E E E E E E E nnpredict H E E E E E E E Sspro C C C C C C C C H H H H H C C C C C E E Casp C C C C C C C C H H H H H H C C E E E E MetaPred L L L L L L L L H H H H H H L L E E E E Fasta L L L L L L L L H H H H H H L L E E E E SUB L L L L L L L L L L Psi-Pred C C C C C C C C E E E E E C C C C C C C Rdb L L L L L L L L H H H H H L L L H H H H Concenso L C C C H H H H H E E L E E E E Secuencia IDSh T I D Y R Y T V W V G F N P D E F L A N 494-513GOR E E E T T E E E E E T C C C T H H H H H GOR1 E E E E E E E E E E E C C C T H H H H H GOR3 E E E E E E E E E E E C C C C H H H H H nnpredict E E E E E E E E H H H Sspro E C C C C C C E E E E C C C C C C C C C Casp C C C E E E E E E C C C C C C C C C C C MetaPred L L L E E E E E E L L L L L L L L L L L Fasta L L L E E E E E E L L L L L L L L L L L SUB E E E E E E L L H H H H Psi-Pred C C C C C E E E E E C C C C C H H H C C Rdb L L L H H H H H H L L L L L L L L L L L Concenso E E E E E E E E E E C C C C H H H H Secuencia IDSh F S D I H A G E L Y F V D S D P L Q D H 514-533GOR H H H H C H H H E E E E T C C C T H T E GOR1 H H H H H H H H E E E E T C C H H H H E GOR3 H H H H H H H H E E E C C C C C H C C C nnpredict H E E E Sspro C C C C C H H H H C C C C C C C C H H C Casp C C C C C C C H E E C C C C C C H H H H MetaPred L L L L L L L H E E L L L L L L H H H H Fasta L L L L L L L H E E L L L L L L H H H H SUB E E E E E L L L L Psi-Pred C C C C C H H H C C C H H H C C C C C C Rdb L L L L L L L L H E E L L L L L L H H H Concenso H C H H H E E E L C C C H H H H
82
Secuencia IDSh N M Y N D S Q G G D L F Q L L M P 534-550GOR T T T T T T T T T C E E E E E C C GOR1 E E E T T T T T T E E E E E E E H GOR3 C C C C C C C C C C H H H E H C H nnpredict H H H H Sspro C C C C C C C H H H H H H H H C C Casp C H C C C H H H H H H H H H H H C MetaPred L H H L L H H H H H H H H H H H L Fasta L H L L L H H H H H H H H H H H L SUB L L L L L L L L L L L L Psi-Pred C C C C C C C H H H H H H H C C C Rdb H L L L H H H H H H H H H H H H L Concenso C C C H H H H H H H H H H C Los programas GOR, GOR-1, GOR-3 predicen para Helice (H), Coil (C), Hoja
plegada (E) y Beta turn (T), los programas Sspro y Casp lo hacen para Hélice (H),
Hoja plegada (E) y Coil (C), los programas MetaPred, Fasta, SUB y rdb predicen
para regiones en Hélice (H), Hoja Plegada (E) y Loop (L), mientras que nnPredict
solamente para Hélice (H) y Hoja Plegada (E).
83
Figura 23. Predicción de la Estructura Secundaria de IDSh. Coil, hoja plegada, hélice. Los resultados son producto del consenso de 11 programas de predicción de estructura secundaria de proteínas.
45
63
80
93
N
128
137
H
N
197
214
192
244
264
277
289
325
A
362
377
402
414
430
Y
Q
499 508
529
550
84
Estructura Terciaria
Ninguno de los programas predijo una estructura de la molécula, solamente SWISS-
MODEL, entregó dos fragmentos por similaridad con las estructuras experimentalmente
determinadas 1AUK e IFSU que corresponden a la Arilsulfatasa A (ARSA) y la
Arilsulfatasa B (ARSB). El primer segmento comprende los aminoácidos ubicados
desde la posición número 34 hasta la 108, su secuencia es:
DALNVLLIIVDDLRPSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSR
VSFLTGRRPDTTRLYDFNSY (Figura 24) y el segundo segmento con predicción
(Figura 25), comprende los aminoácidos en posiciones 287 a 341, con la secuencia:
PIPVDFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLAQLANSTIIAFTSDHGWAL.
Los resultados de los alineamientos múltiples presentaron un total de 29 proteínas con
fragmentos de identidades con la IDSh entre 21 y 52%. Dentro de ese grupo de
moléculas tenemos Arilsulfatasa de P. aeruginosa, ARSB humana, Flavohemoglobina
de Eutrophus, Dihidropteridina reductasa de C. elegans, las cadenas D, E, F de la F1 de
la ATPasa de Berillium fluoride. De misma molécula, la cadena A en hígado de rata, las
cadenas D, E F de bovino y la cadena B en cloroplastos. Igualmente, las cadenas A y B
transaldolasa de los mutantes E96a, N35a, D17a y T156a de E. coli. Finalmente, otras
moléculas como tiosterasa, transaldolasa B, d-aminociclasa, el dominio de unión del
receptor beta. Un total de 15 fragmentos que contenían secuencias con identidades
entre el 37 y 52%, fueron unidos a los fragmentos obtenidos de SWISS-MODEL
empleando el programa Swiss-Pdb Viewer (spdbv) versión 3.7. Además, 62 residuos
que no se encontraban en ninguno de los fragmentos, fueron adicionados manualmente
uno a uno, atendiendo a su orientación de acuerdo a la predicción secundaria. El modelo
fue sometido a minimización energética con el programa Discover 3 del paquete Insigth
II de 2004, para lo cual fue empleado un computador Silicon Graphics Octane. Para la
visualización de la estructura tridimensional, se emplearon los programas RasMol
versión 2.6 y spdbv versión 3.7. Las figuras 27 y 28 presentan el modelo propuesto
para la estructura terciaria completa de la IDSh. El modelo presenta 33,3% en helice,
7,2% en hoja plegada y 59,5% en coil, que son porcentajes similares a los obtenidos en
la predicción secundaria.
85
Figura 24. Predicción de un Fragmento de la Estructura Terciaria de la IDSh.
(Residuos 34-108). Visualización de la molécula mediante el programa RasMol 2.6. Este fragmento fue enviado por Swiss Model.
Figura 25. Predicción de un Segmento de la Estructura Terciaria de la IDSh.
(Residuos 254-308). Visualización de la molécula por el programa RasMol 2.6. Este fragmento fue enviado por Swiss Model.
NH2
COOHNH2
COOH
86
Figura 26. Modelo Propuesto para la Estructura Terciaria de la IDSh. Visualización de la molécula mediante el programa RasMol 2.6.
87
Figura 27. Predicción de la Estructura Terciaria de la IDSh. Visualización de la molécula mediante el programa spdbv 3.7.
La figuras 28 y 29 muestran la ubicación de los cinco sitios de N-glicosilación
presentes en el péptido después de procesado y se puede evidenciar que todos ellos
están expuestos. La visualización de la estructura se realizó con spdbv 3.7.
88
Figura 28. Sitios Potenciales N-glicosilación en la Forma Madura de la IDSh. La visualización de la molécula fue realizada por spdbv 3.7. En amarillo se señala la cisteína 84 y en rojo los sitios de N-glicosilación.
89
Figura 29. Ubicación de los Sitios potenciales N-glicosilación en la Forma Madura de la IDSh. La visualización de la molécula fue realizada por spdbv 3.7. En amarillo se señala la cisteína 84 y en rojo los sitios potenciales de N-glicosilación.
Modelo Estructural y Funcional para el Sitio Activo
El análisis teórico y computacional de la comparación de estructura y función de otras
sulfatasas (103-106,172), permitió proponer un modelo para el sitio activo de la IDSh.
Se conoce que las sulfatasas requieren para su activación una modificación
postranslacional que se realiza a nivel del retículo endoplásmico, consistente en la
transformación de un residuo de cisteína en formilglicina (103). En la IDSh el residuo
90
de cisteína que sufre la oxidación hasta formilglicina corresponde a la cisteína en
posición 84. Los residuos ubicados cerca de la cisteína y que experimentalmente se
demostró que componen el centro activo de la ARSA (172) y la ARSB (104), se
comparan con los homólogos de la IDSh en la tabla 18. Con base en esta información se
localizaron los residuos conservados y su ubicación espacial se muestra en la figuras
30 y 32, mientras que la figura 31 ilustra uno de los sustratos de la IDSh, el heparan
sulfato, molécula elaborada empleando el programa WebLab Viewer Pro (173).
Considerando la similitud de la organización del centro activo de la IDSh y de las
ARSA y ARSB se postula que al igual que estas dos enzimas en donde se demostró
experimentalmente la necesidad de iones de magnesio, en el primer caso y de calcio en
el segundo (104, 172), para ser activa la IDSh requiere la presencia de un catión
divalente, se propone que en este caso sea el manganeso, dado que está establecido que
este catión incrementa la capacidad catalítica de la enzima (114). Su posible
localización dentro del centro activo se muestra en la Figura 33.
Tabla 18. Aminoácidos del Sitio Activo de ARSA, ARSB e IDS
AMINOACIDO ARSB ARSA IDS D 53 29 451
D 54 30 46 C 91 61 84 R 95 72 88 K 145 123 135 H 147 125 138 H 242 229 226 D 300 281 334 N 301 282 350 K 318 302 347
1Posición del aminoácido en la secuencia primaria
91
Figura 30. Localización de los Aminoácidos (rojo/azul) que Componen el Sitio Activo de la IDSh. En Verde se señala la cisteína 84. Visualización de la molécula mediante el programa spdbv 3.7.
92
Figura 31. Molécula de Heparan Sulfato. Este GAG es uno de los sustratos naturales de la IDSh. Estructuras elaboradas con el programa WebLab Viewer Pro.
SO4=SO4=
93
Figura 32. Heparan Sulfato en el Sitio Activo de la IDSh. Los aminoácidos que conforman el sitio activo en verde y el heparan sulfato en rosado. Visualización mediante el programa spdbv 3.7
94
Figura 33. Ubicación del Manganeso en el Sitio Activo de la IDSh. En rojo-azul se observa el heparan sulfato. Visualización mediante el programa spdbv 3.7
Cálculo del “Root Mean Square” (RMS)
El “Root Mean Square” (RMS), es una medida que permite establecer la diferencia en
la distribución espacial de los átomos de dos moléculas. El modelo de estructura
terciaria de la IDSh fue comparado con la ARSB y la ARSA y se encontraron valores de
0.78 y 0.86 Å respectivamente.
Perfil de Antigenicidad
La figura 34 muestra el perfil de antigenicidad de la IDSh. Para la producción, en
huevo de gallina de anticuerpos IgY contra la IDSh se diseñaron cuatro péptidos con
secuencias no conservadas en las sulfatasas y la figura 35 muestra la ubicación de los
mismos en el modelo de estructura terciaria de la IDSh. Los niveles de reconocimiento
variaron en forma descendente en las IgY generadas por los péptidos 2, 3, 1 y 4.
95
Figura 34. Perfil de Antigenicidad de la IDSh. Se indican las zonas en las cuales se encuentran las secuencias de los cuatro péptidos diseñados para la producción de anticuerpos IgY. Las flechas de colores verde, rojo, amarillo y magenta corresponden a las zonas de los péptidos 1, 2, 3 y 4 respectivamente.
Figura 35. Ubicación en el Modelo de Estructura Terciaria de la IDSh de Cuatro Péptidos Diseñados para la Producción de Anticuerpos IgY anti-IDShr. Los colores verde, rojo, amarillo y magenta corresponden a los péptidos 1, 2, 3 y respectivamente. Visualización mediante el programa spdbv 3.7.
Modelo de Estructura Terciaria de la IDSh Con la Secuencia del Péptido Señal.
Con el propósito de comparar la secuencia nativa de la IDSh y la expresada en nuestro
trabajo (116), se empleo BLAST de NCBI (136). La secuencia del cDNA de la IDSh
nativa (12) y la secuencia nucleotídica que codifica para la enzima recombinante,
obtenida por secuenciación (116), se alinearon y esto permitió establecer que el
plásmido de expresión pPIC-9/IDS contiene tanto la secuencia señal nativa de la IDSh,
como la secuencia completa del α-MF (174).
Al modelo de estructura terciaria se adicionaron los 33 aminoácidos que se eliminan en
el proceso de maduración de la enzima. Para esto se empleó el programa spdbv 3.7 y la
97
nueva estructura fue sometida a procesos de minimización. La figura 36 presenta el
modelo computacional de la IDSh que incluye los mencionados residuos. En la misma
se puede observar que los 33 aminoácidos adicionales, forman una hélice, una parte de
la cual cubre completamente la entrada al bolsillo donde se encuentran los aminoácidos
que componen el sitio activo y la región restante se pliega buscando ubicarse en un
espacio que presenta la estructura de la proteína. Para el péptido señal fueron
establecidos los perfiles de flexibilidad e hidrofobicidad e igualmente se hizo la
predicción computacional de estos dos perfiles para la IDSh con el péptido señal. Tanto
el α-MF (Figura 37) como el péptido señal (Figura 38), presentan un alto grado de
hidrofobicidad lo cual aumenta la hidrofobicidad de la enzima, con un cambio de -1 a 3
(Figura 39) y ocurre algo similar con la flexibilidad, puesto que el péptido señal también
posee un alto nivel de flexibilidad, un cambio de 0.4 a 0.5 (Figuras 40 y 41).
Los lisados obtenidos de la ruptura de células del cultivo M-13' mostraron niveles de
actividad enzimática que variaron entre 0.58 y 4.24 nmol/h/mg de proteína. Los
sobrenadantes de este cultivo presentaron actividad de 3.25 nmol/h/mg de proteína. La
presencia de IDShr intracelularmente, permite pensar que la actividad total del sistema
de expresión podría llegar a ser hasta el doble de la encontrada en los sobrenadantes.
Adicionalmente, un Western blot de sobrenadantes y lisados de P. pastoris pPIC9-IDS/
10 del cultivo M-22 (Figura 42), demuestra la presencia de IDShr intracelularmente
(Sosa A y Barrera LA, comunicación personal).
98
Figura 36. IDSh conteniendo el Péptido Señal. En verde se muestran los 25 residuos del péptido señal y los ocho siguientes del propéptido y en rojo los aminoácidos que conforman el sitio activo. Visualización mediante el programa spdbv 3.7.
99
Figura 37. Perfil de Hidrofobicidad del α-MF. Para el análisis computacional fue empleado ProScale" de ExPASy.
Figura 38. Perfil de Hidrofobicidad del Péptido Señal. Para el análisis
computacional fue empleado ProScale" de ExPASy:
100
Figura 39. Perfil de Hidrofobicidad de la IDSh con el Péptido Señal. Para el análisis computacional fue empleado ProScale" de ExPASy.
Figura 40. Perfil de Flexibilidad del Péptido Señal. Para el análisis computacional
fue empleado ProScale" de ExPASy.
101
Figura 41. Perfil de Flexibilidad de la IDSh con Péptido Señal. Para el análisis computacional fue empleado ProScale" de ExPASy.
Figura 42. Western blot de Sobrenadantes y Lisados de P. pastoris pPIC-9/IDS del cultivo M-22. Carriles 1 IDShr Purificada (TKT), Carriles 2,3,4 Sobrenadantes y Carriles 5,6,7 lisados.
~ 120-200kDa
~36-40kDa
~ 55-66kDa
1 2 3 4 5 6 7
102
Los cultivos mostraron niveles de actividad proteolítica que cuando fueron superiores a
6,25 UP/ml/min fueron asociadas a disminuciones en la actividad IDShr (144). Con
respecto a esto sabemos que se han encontrado (175,176), cuatro tipos de proteasas en
P. pastoris carboxipeptidasa Y, aminopeptidasa, proteinasa A (PrA) y proteinasa B
(PrB). La primera hidroliza enlaces peptídicos en el extremo C y la aminopeptidasa en
el extremo N, mientras que la PrA lo hace en secuencias LL-/-VY la PrB tiene
actividad proteolítica similar a tripsina. Durante los procesos de purificación se observó
actividad catalítica IDShr en fracciones menores a 30 KDa producto de la
ultrafiltración. La presencia y acción de proteasas permite explicar el fenómeno
observado. Con relación a esto, la actividad proteolítica de la carboxipeptidasa y la
aminopeptidasa no generan fragmentos pequeños, además no existen dentro de la IDShr
secuencias blanco para la PrA y la proteólisis por parte de la PrB puede generar
diversidad de fragmentos dentro de los cuales podemos encontrar los siguientes:
PSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAV GYHKPHIPFR LVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHA GNFSTIPQYF KENGYVTMSV GKVFHPGISS NHTDDSPYSWSFPPYHPSSE KYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAV GYHKPHIPFR VSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTE QAIQLLEKMKTSASPFFLAV GYHKPHIPFR RPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPE GTLPDKQSTE QAIQLLEKMKTSASPFFLAV GYHKPHIPFR YPK
103
LYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAV GYHKPHIPFR YPKEFQ. Estos fragmentos tienen pesos moleculares inferiores a 30 KDa y todos poseen seis de
los nueve residuos que conforman el sitio activo. La literatura reporta cuatro mutaciones
en las cuales la proteína es incompleta: E177Term, L213Term, Y103Term y R433Term
y los fenotipos corresponden a presentaciones moderadas o intermedias, lo que significa
que estas proteínas mutadas presenta actividad biológica. A excepción de R433Term las
otras formas de proteína tienen pesos moleculares pequeños y conservan seis de los
nueve aminoácidos del centro activo lo cual sugiere que fragmentos como los que puede
generar la PrB se presentaron durante las fermentaciones y son responsables de la
actividad catalítica determinada en las fracciones menores a 30 KDa.
Análisis de las Mutaciones Puntuales Se analizaron 114 (de las cuales se obtuvo la información) de las 169 mutaciones
puntuales reportadas (16-39) y se encontró que corresponden 9 (7.9%), 31 (27.1%), 2
(3.5%), 19 (16.6%), 11 (9.6%), 14 (12.2%) y 23 (20.1%) a los exones II, III, IV, V,
VI, VII, VIII y IX, respectivamente. Al ubicarse sobre el modelo de estructura terciaria
se observa que 87.8% de estas mutaciones se encuentran en regiones en coil.
Con el propósito de establecer una correlación entre las mutaciones puntuales de la
IDSh y la severidad de la enfermedad de Hunter se realizó un análisis teórico y
computacional. Para dicho análisis se consideró como referencia al sitio activo la
ubicación de la cisteína 84 y una región circunscrita en un círculo con radio de 10 Å.
Esta región fue considerada cercana al sitio activo y los residuos fuera de este círculo se
catalogaron como lejanos. La clasificación de los aminoácidos se consideró a pH
fisiológico y se establecieron tres grupos de aminoácidos: hidrofóbicos (G, A, V, L, I,
M, P, F, W); polares neutros (S, T, N, Q, Y, C) y polares cargados (K, R, D, H, E)
(177). La tabla 19 resume los parámetros considerados en el análisis y en la misma se
pueden realizar las siguientes observaciones:
104
1. Todas las mutaciones en la región cercana a la cisteína 84 resultan en presentaciones
severas (A82E, A85S, A85T, P86R, P86R, P86Q, P86L, R88G, R88H, R88L,
R88P).
2. Cualquier aminoácido mutado por Arginina genera un fenotipo severo (S71R,
H335R, W337R, L339R, P358R, L403R, C422R, P120R, K135R). En estos casos
existe un cambio drástico por la introducción de carga eléctrica de la Arginina que
afecta las interacciones electrostáticas en la zona mutada. Es una excepción la
L102R que corresponde a una presentación moderada.
3. Si muta R el fenotipo es moderado (R48P, R95T, R468L). Esto sugiere que los
cambios electrostáticos no son tan severos y se produce una proteína mutada con
niveles de actividad responsable del fenotipo moderado. Sin embargo la mayoría de
las mutaciones en la posición R468- proporcionan fenotipos severos. Este sitio se
considera un sitio altamente mutable y su frecuencia es alta en todas las etnias con
presentaciones severas de la enfermedad (16)
4. Cualquier aminoácido mutado por lisina genera un fenotipo severo (E341K,
E434K, I485K). La presencia de lisina en esos sitios genera cambios drásticos en las
interacciones de los aminoácidos de la proteína.
5. Si muta K siempre el fenotipo es severo (K135R, K135N, K227Q, K227M, K347T).
La pérdida de la carga eléctrica de la lisina produce cambios electrostáticos severos
en la proteína mutada.
6. Cuando la Prolina es mutada por Histidina el fenotipo es moderado (P120H, P266H,
P469H). En estas mutaciones hay cambio de un aminoácido aromático por otro
aromático y el efecto del cambio de hidrofóbico a polar cargado es disminuido por
la distancia al centro activo (21.43, 34.18, 39.65 Å), están ubicadas lejos de la
Cisteína 84.
7. Si muta la H por un residuo polar neutro como la tirosina (H229Y) da un fenotipo
severo, pero si la mutación es lejos (31.46 Å) del sitio activo como H342Y el efecto
es leve y se expresa como un fenotipo moderado.
8. Mutaciones de aminoácidos hidrofóbicos por glutamato generan un fenotipo severo
(A82E, G224E, G336E). Existen cambios severos en la carga eléctrica de las zonas
mutadas y se afectan las interacciones electrostáticas generándose una proteína
mutada con poca o ninguna actividad catalítica. Existe una excepción, la mutación
105
A79E, la misma se produce a 10.23 Å del sitio activo y para la cual no tengo
explicación. Además, mutaciones de D por E (D308E) resultan en presentaciones
moderadas, lo cual se explica porque los dos residuos son polares cargados
negativamente y las alteraciones no deben ser drásticas.
9. Si es mutado el E por un residuo positivo (E34K, E434K) se presenta un fenotipo
severo. El cambio de la naturaleza de la carga eléctrica constituye un cambio
drástico en la estructura y función de la enzima que ocasiona su perdida de actividad
catalítica. Aunque el E se mute por un residuo hidrofóbico si la mutación es
distante del sitio activo (23.27 Å) resulta una presentación clínica moderada como
en el caso de E125V, en donde al parecer la distancia al sitio activo disminuye el
efecto que pudieran tener las nuevas interacciones electrostáticas en el sitio de
mutación.
10. Si mutan aminoácidos alifáticos por Aspartato (G94D, G340D, A346D, N63D) se
tienen fenotipos moderados. Si la mutación es de residuos aromáticos la
presentación de la enfermedad es severa (Y54D, H138D, Y225D), en este caso el
tamaño del aminoácido que se pierde y la carga del aminoácido introducido causan
cambios en la estructura e interacciones de la proteína mutada convirtiéndola en una
molécula sin actividad biológica.
11. Si se muta aspartato por residuos aromáticos (D478Y) el fenotipo es severo. Si este
último tipo de mutaciones son alejadas del sitio activo como D334G (15.85 Å),
D187V (23.23 Å) y D198G (29.89 Å) o se realizan por residuos de asparagina
(D45N, D334N), los fenotipos son moderados. La distancia al sitio activo permite o
no que los efectos locales del cambio de carga y tamaño de los residuos, tengan
efecto sobre las interacciones de los aminoácidos del sitio activo y el cambio de
aspartato por asparagina no genera muchos cambios puesto que las estructuras
químicas en este caso son parecidas y por consiguiente la proteína mutada no sufre
variaciones importantes en su estructura y consecuentemente en su función.
12. Se presentan fenotipos severos cuando hay mutaciones por tirosina (C24Y, C432Y,
D478Y, S117Y, H229Y). La introducción de una molécula aromática en su sitio
destinado genéticamente a un residuo alifático produce cambios de conformación,
responsable de la perdida de actividad en la enzima mutada. En el último caso, si
bien el cambio es residuo aromático por aromático, existe una diferencia de carga
106
que igualmente genera cambios en la estructura proteíca y pérdida de la actividad
biológica. Sin embargo, la mutación puede presentarse alejada del centro activo
como en H342Y (31.46 Å) o N115Y (17,68 Å) en cuyo caso el fenotipo es
moderado.
13. Si es mutado tirosina por un residuo polar neutro (Y108C, Y108S) el fenotipo es
moderado, sin embargo, si el cambio es por un aminoácido polar cargado (Y225D,
Y54D) el fenotipo es severo. El primer caso sugiere que el cambio por aminoácidos
neutros no llegan a alterar significativamente la molécula de IDSh, pero si se
introduce una variación en la carga eléctrica, la proteína es afectada producto de las
nuevas interacciones electrostáticas.
14. Mutaciones por prolina son responsables de fenotipos severos (V89P, L92P,
L182P, L259P, L221P, L314P, H159P, A205P, Q465P).
15. Mutaciones de polar neutro a residuos hidrofóbicos pueden resultar en fenotipos
moderados (T118I, S299I) cuando son distantes del sitio activo (21.63 y 34.21 Å),
con excepción de S349I que es de presentación severa. Este tipo de mutaciones
resultan severas cuando se encuentran ubicadas en una hélice (T309A, N265I) o
cuando el aminoácido hidrofóbico es aromático (S132V, S143F, C184F). El reporte
de las dos últimas mutaciones indica que el fenotipo es de moderado a severo, lo
que evidencia la subjetividad en la observación clínica.
16. Cambios de la misma naturaleza, es decir, aminoácidos hidrofóbico por
hidrofóbico (A346V) o polar neutro por polar neutro (S71N) resulta en fenotipo
moderado. Este tipo de mutaciones sugiere que al tener la misma naturaleza química
los aminoácidos involucrados en la mutación, los cambios no son tan drásticos y la
enzima mutada mantiene algún nivel de actividad biológica, responsable del
fenotipo moderado de la enfermedad.
107
Tabla 19. Relación Entre la Severidad Fenotípica del Síndrome de Hunter y la Naturaleza y Ubicación del Aminoácido Mutado en 114 Mutaciones
Puntuales de la IDSh.
Mutación
Severidad
Cambio de aminoácido
Distancia
a C-84 (Å)
Exón
L41P M-S A/A 14.61 2 D45N M PC/PN 9.18 2 R48P M PC/A 15.63 2 Y54D S PN/PC 23.77 2 N63D M PN/PC 24.61 2 S71R S PN/PC 26.05 2 S71N M PN/PN 26.05 2 A79E M A/PC 10.23 2 Q80Term S PN/ 10.00 2 A82E S A/PC 8.19 3 C84Term S PN/ 0.0 3 A85P S A/A 3.1 3 A85S S A/PN 3.1 3 A85T S A/PN 3.1 3 P86R S A/PC 4.71 3 P86Q S A/PN 4.71 3 P86L S A/A 4.71 3 R88C S PC/PN 5.82 3 R88G S PC/A 5.82 3 R88H S PC/PC 5.82 3 R88L S PC/A 5.82 3 R88P S PC/A 5.82 3 L92P S A/A 11.9 3 G94D M A/PC 14.03 3 R95T M PC/PN 11.91 3 L102R M A/PC 8.79 3 Y103Term S PN/ 10.23 3 Y108C M PN/ 13.48 3 Y108S M PN/PN 13.48 3 N115Y M PN/PN 17.68 3 S117Y S PN/PN 20.72 3 T118I M PN/A 20.84 3(h)
P120R S A/PC 21.43 3(h) P120H M A/PC 21.43 3(h)
108
E125V M PC/A 23.27 3 S132W S PN/A 20.72 3 L135R S A/PC 9.43 3 L135N S A/PN 9.43 3 H138D S PC/PC 15.79 3 S143F M PN/A 11.74 3 Y151Term S PN/ 10.05 4 H159P S PC/A 16.69 4 R172Term S PC/ 22.97 5(S) E177Term M PC/ 22.35 5 L182P S A/A 22.55 5 C184F M – S PN/A 18.94 5 D187V M PC/A 23.23 5 L196S M A/PN 32.33 5 D198G M PC/A 29.89 5 L213Term S A/ 19.4 5 L221P S A/A 12.50 5 G224E S A/PC 10.67 5 Y225D S PN/PC 10.46 5 L227Q S A/PC 10.60 5 L227M S A/A 10.60 5 P228L S A/A 13.59 5 P228T S A/PN 13.59 5 H229R S PC/PC 15.83 5 H229Y S PC/PN 15.83 5 P231L S A/A 17.28 5 Y234Term S PN/ 18.24 5 E245Term S PC/ 18.76 6 L259P S A/A 35.70 6 N265I S PN/A 37.25 6(h) P266R S A/PC 34.18 6 P266H M A/PC 34.18 6 L279Term S A/ 34.46 6 Q298Term S PN/ 36.10 7 S299I M PN/PN 34.39 7 D308N S PC/PN 28.57 7(h) D308E M PC/PC 28.57 7(h) T309A S PN/A 29.98 7(h) L314P S A/A 25.68 7 S333L S PN/A 16.07 7 D334N M PC/PN 15.85 7
109
D334G S PC/A 15.85 7 H335R S PC/PC 18.73 7 G336E S A/PC 21.67 8 W337R S A/PC 24.66 8 L339R S A/PC 30.75 8(h) G340D M A/PC 31.51 8(h) E341K S PC/PC 30.63 8(h) H342Y M PC/PN 31.46 8 W345Term S A/ 36.06 8 A346D M A/PC 39.31 8 A346V M A/A 39.31 8 K347T S PC/PN 40.83 8 S349I S PN/A 36.27 8 P358R S A/PC 39.20 8 G365Term S A/ 46.61 8 Q389Term S PN/ 50.77 8 Q396Term S PN/ 42.39 9 L403R S A/PC 36.00 9(h) L410P S A/A 28.27 9(h) C422R S PN/PC 34.37 9 C422Y S PN/PN 34.37 9 C432Y S PN/PN 31.13 9 E434K S PC/PC 29.63 9 R443Term M PC/ 23.90 9 Q465P S PN/A 31.12 9 Q465Term S PN/ 31.12 9 Y466Term S PN/ 32.22 9 P467L S A/A 34.24 9 R468Q S PC/PN 37.04 9 R468L M PC/A 37.04 9 R468W S PC/A 37.04 9 P469H M PC/PC 39.65 9 Q474Term M PN/ 35.20 9 W475Term M A/ 34.43 9 D478Y S PC/PN 38.25 9 P480R S A/PC 44.65 9 L482Term S A/ 44.43 9 I485R S A/PC 9 I485K S A/PC 9
A=Alifático, PN=Polar neutro, PC=Polar cargado, M=Moderado, S=Severo, h=Hélice, S=Hoja plegada.
110
Efecto de las Mutaciones Estudiadas Sobre la Estructura Terciaria de la IDSh
Sobre el modelo de estructura terciaria se realizaron cada una de las 118 mutaciones
puntuales, empleando el programa spdbv versión 3.7. Las estructuras mutadas fueron
sometidas a ciclos de minimización y se calculó el RMS. Las diferencias encontradas
para mutaciones responsables de fenotipos severos variaron entre 0.09 y 0.16 Å,
mientras que en el caso de fenotipos moderados las diferencias estuvieron entre 0.05 y
0.09 Å.
111
DISCUSIÓN
El presente trabajo se encuentra enmarcado en la línea de investigación de TRE para
mucopolisacaridosis que adelanta el EIM y que persigue implementar protocolos de
TRE para la enfermedad de Hunter. El mismo, incluyó dos partes, una experimental y
otra computacional empleando herramientas bioinformáticas. Con relación a la parte
experimental se empleó como metodología de determinación de proteínas la técnica de
Lowry (139), la cual en este caso, mostró un rango de detección dentro de los límites
establecidos para la misma.
Con el propósito de mejorar las pruebas de determinación de actividad enzimática de la
IDShr, se implementó el uso de una prueba fluorométrica (140), con el empleo del
sustrato MU-αIdoA-2S. Esta técnica, más sensible y menos laboriosa, reemplazó a la
prueba radiométrica empleada hasta entonces en el laboratorio. Puesto que fue diseñada
para muestras humanas como fibroblastos, leucocitos y plasma, tuvo que adelantarse un
proceso de adaptación para su uso con muestras procedentes de los cultivos de E. coli y
P. pastoris. Teniendo en cuenta que el fabricante del sustrato recomienda el uso de 150
y 100 µg/dL de proteína total, para leucocitos y fibroblastos, se estableció un rango de
concentración de proteína total entre 100 y 200 µg/dL para nuestro caso. Además, se
cambió el buffer de parada recomendado por el protocolo del fabricante y se empleó
buffer carbonato/bicarbonato con glicina 1.7 M pH 11.0, el cual es el buffer usado
corrientemente, en nuestro laboratorio, para otras pruebas enzimáticas que emplean
sustratos fluorométricos con base en el metil umbeliferil (MU) y se empleó puesto que
los dos detienen la reacción por elevación del pH. Los valores de actividad máximos
alcanzados en las fermentaciones realizadas se presentaron en los cultivos M-7 y M-13
(Tabla 6) y respectivamente, fueron 29.36 y 25.4 nnmol/h/mg de proteína total a las
35 y 47 horas de cultivo. Sin embargo, descendieron notablemente para el final de la
fermentación. Este producto final fue el utilizado para los ensayos de purificación.
Estos resultados de actividad sugieren que las fermentaciones deben adelantarse
solamente hasta las 35-47 horas de cultivo. El plasma humano empleado como control
en la prueba de actividad sufre un deterioro progresivo que se traduce en disminución de
112
la actividad IDSh, producto de los procesos de congelación-descongelación (Tabla 2) y
aunque no se realizaron experimentos de este tipo con las muestras procedentes de
cultivos de los microorganismos empleadas en este trabajo, es factible que las
disminuciones en la capacidad catalítica de la IDShr, presente en dichas muestras sufra
un deterioro progresivo de las mismas magnitudes.
Con el fin de obtener para su uso en los procesos de purificación, específicamente en
cromatografía de afinidad, se preparó un anticuerpo policlonal anti-IDShr en conejos.
Como antígeno se emplearon concentraciones de 100 y 50 µg/kg de IDShr pura (TKT)
y se inmunizaron dos conejos. Los resultados (Tabla 3), sugieren que la primera
concentración de antígeno resultó más efectiva para generar respuesta inmune y los
anticuerpos procedentes del primer conejo presentaron una mayor sensibilidad para
reconocer la enzima. El patrón electroforético de las IgG obtenidas (Figura 6), permitió
comprobar que fueron purificadas. El anticuerpo policlonal reconoció específicamente
la IDShr purificada por TKT (Figura 7) e IDShr presente en el retentato del cultivo M-
13 de P. pastoris e igualmente en sobrenadantes de E. coli (Figura 8).
El anticuerpo policlonal fue utilizado para la elaboración de una columna de afinidad,
la cual reconoció y retuvo IDShr presente en un sobrenadante del cultivo M-13 de P.
pastoris (Figura 9). Los datos obtenidos en este experimento de separación de la IDShr
permitieron deducir que hay un aumento de la actividad específica de más de cuatro
veces en ese paso de la purificación (Tabla 4).
Fueron adelantados una serie de experimentos conducentes a obtener información sobre
los porcentajes de recuperación de proteínas y la tabla 7 resume los resultados de uno de
estos experimentos. Con base en esta información se puede señalar que menos del 7%
de proteínas de los sobrenadantes se recuperan durante la ultrafiltración y son las que se
encuentran entre 30 y 100 KDa, es decir, el rango dentro del cual, según los reportes de
la literatura (58-61), existen las formas activas de la enzima.
El patrón electroforético de un sobrenadante de P. pastoris muestra la presencia de
proteínas en un rango entre 20 y 120 KDa (Figura 10). Los reportes de la literatura
113
señalan que P. pastoris, secreta al medio de cultivo bajas cantidades de proteínas
nativas y la mayoría de las proteínas secretadas corresponden a la proteína heteróloga
(92,96,97). Esta información permitía pensar en que la mayoría de las proteínas
presentes en los sobrenadantes (Figura 10), correspondían a la IDS recombinante, sin
embargo, en nuestro caso, la cromatografía de afinidad solo permitió recuperar
alrededor del 0.22% del total de proteínas y menos del 2% de la actividad total (Tabla
11). La cuantificación por ELISA señaló que menos del 1% corresponde a IDShr
recuperada en el proceso de ultrafiltración (Tabla 12).
Con el propósito de retirar iones o sales de fosfatos y sulfatos que pudieran afectar la
actividad de la IDShr (114), se dializaron las diferentes fracciones de las etapas del
proceso de separación. En las fracciones no sometidas a este paso, previo a la
determinación de actividad IDShr, se presentaron disminuciones y aunque menores al
10% (Tabla 8), son importantes dado los bajos niveles de actividad presentados. Lo
anterior sugiere la necesidad de adicionar este paso como parte del proceso de
separación.
Para concentrar bajos volúmenes no existió dificultad empleando centricones, sin
embargo, volúmenes mayores requieren el uso de una metodología más rápida y
eficiente, considerando la necesidad de conservar estable los bajos volúmenes de
enzima separados, expuestos a la acción de proteasas (175,176). Los resultados (Tabla
9), demuestran que aunque la liofilización concentró, afecta en forma considerable la
actividad de la enzima, posiblemente como consecuencia de alteración de la estructura
tridimensional de la molécula. En el caso del retentato, la disminución en la actividad
IDShr fue menor, posiblemente debido a que las proteínas diluidas son más susceptibles
de verse afectadas por cambios físicos y el retentato era la fracción más concentrada de
las utilizadas en este experimento (Tabla 9).
La metodología de separación de la IDShr se diseño en tres etapas, respondiendo a las
características conocidas de la enzima humana (114) y la información generada por
predicción computacional. Este diseño persigue disminuir a solo tres etapas el proceso
de separación de la IDS, el cual corrientemente consta de siete (113). Después de
114
centrifugados los cultivos, los altos volúmenes de los sobrenadantes fueron
concentrados por ultrafiltración. Puesto que la literatura reporta formas desde 39 hasta
100 KDa se utilizó un sistema de empleo secuencial de dos membranas de celulosa
para excluir proteínas de 100 y 30 KDa y obtener de esa forma una fracción concentrada
de proteínas entre 30 y 100 KDa. A sabiendas que la IDS es una enzima lisosomal y
que la predicción computacional señala que el punto isoeléctrico es pH 5.1, el buffer de
mantenimiento y corridas cromatográficas fue acetato 0.1 M pH 5.0. Los procesos de
centrifugación de los cultivos y ultrafiltración, se realizaron a 4°C, inmediatamente
finalizadas las fermentaciones. Esto con el propósito mantener la estabilidad de la
enzima recombinante, disminuir los niveles actividad proteolítica (175,176), que
afectaran la proteína expresada y evitar procesos de congelación y descongelación que
disminuyeran la actividad catalítica de la IDShr obtenida in vitro.
Los cromatogramas de retentatos de los sobrenadantes de cultivos de P. pastoris
GS115 pPIC9-IDS/28 (Figuras 11y 12), mostraron cambios de absorbancia a 280 nm
muy leves, producto de las bajas concentraciones de proteína en las muestras, lo que
sugiere un bajo nivel de expresión de la proteína recombinante. A pesar de los bajos
porcentajes de recuperación del sistema de separación, los escasos niveles de la enzima
heteróloga (Tabla 12) corresponden a IDShr con actividad catalítica. En este sentido, la
tabla 10 detalla los resultados de cinco procesos de separación, en donde la fracción
final presentó actividad IDShr hasta de 58.78 nmol/h/mg, es decir, más de cuatro veces
el valor de referencia del laboratorio del IEIM para IDSh plasmática que es de 12.41
nmol/h/ml y más de nueve veces el valor de referencia para leucocitos que es de 6.96
nmo/h/mg. Aunque este nivel de actividad enzimática no ha sido alcanzado en la
mayoría de los procesos anteriores de purificación reportados en la literatura
(60,61,102-113), no responde a los valores esperados y solo constituye un punto de
referencia para continuar en la búsqueda de optimización del sistema de expresión y
purificación que actualmente desarrolla el IEIM. Estos niveles de actividad se
presentaron fundamentalmente en muestras del cultivo M-13. Este cultivo presentó una
alta concentración de proteínas y sólo se detectaron 2.36 unidades de actividad
proteolítica (144). Lo anterior, sugiere que a diferencia de otras fermentaciones, la alta
concentración de proteína extracelular y la baja actividad proteolítica son responsables
115
de una mayor cantidad de IDShr y como consecuencia de esto, los valores de actividad
observados. Las cantidades de IDShr expresadas en este sistema de producción de
proteínas heterólogas no responden a las expectativas con miras a obtener enzima
recombinante para ser empleada clínicamente como medida terapéutica para la
enfermedad de Hunter. En este sentido es conocido que actualmente los pacientes
tratados con TRE reciben dosis semanales de enzima recombinante de 0.5 mg/kg de
peso (49). Implementadas las técnicas y con resultados que sugieren que tanto el
sistema de expresión como el de purificación deben ser mejorados, se replantearon
algunos de los propósitos iniciales y como meta fundamental dentro del estudio, mejorar
la producción de la enzima, empleando nuevas metodologías u optimizando las
existentes.
En esa búsqueda de soluciones experimentales, recientemente, se estandarizó una
prueba de ELISA simple para cuantificar IDShr, que constituye una metodología de
mucha utilidad pues permite contar con una prueba alterna, a la determinación de
actividad, para monitorear la presencia de la IDShr durante los procesos de expresión y
purificación, aunque haya perdido su actividad. En este sentido, para las diferentes
fases del proceso de ultrafiltración se determinó la cantidad de IDShr presente (Tabla
12). Los resultados señalan que menos del 1% de la proteína corresponde a la enzima
recombinante y que gran parte de ella, se encuentra en el ultrafiltrado final, es decir, en
una fracción menor a 30 KDa. Estas fracciones presentan actividad enzimática (Tablas
8 y 9), lo que sugería dos posibilidades, que podrían existir formas activas de menor
peso molecular a lo indicado en la literatura (58-61) o que eran fragmentos de la
proteína, originados por proteolisis. En el primero de los casos, se puede concluir la
necesidad de utilizar una membrana de 10 KDa para concentrar esos fragmentos o
formas de la enzima recombinante y en el segundo establecer controles del pH
(175,176) o uso de inhibidores de proteasas para contrarrestar la actividad proteolítica.
Surgieron como alternativas de trabajo, la revisión de la construcción genética de la
cepa recombinante, un análisis computacional de la enzima y la expresión de la IDShr
en E. coli, considerando obtener una proteína no glicosilada, con la posibilidad de
glicosilarla in vitro (87).
116
El análisis teórico de tipo genético indicó que en la región del promotor dr la IDS no se
encuentran secuencias del tipo cajas TATA o CAAT, sin embargo, se hallan dos
secuencias consenso GC, esto es consistente con la característica de dicho gen de
presentar bajos niveles de transcripción (13), lo cual explicaría en parte los bajos niveles
de actividad IDShr obtenidos en este trabajo.
En nuestro laboratorio, ya se había expresado la IDShr a pequeña escala en E. coli con
actividades del orden de 1,5 nmol/h/mg (115). Se trabajo en este sentido y se encontró
que la cinética de expresión a nivel de 100 ml presentó un máximo de actividad de
0.54 nmol/h/mg de proteína a las ocho horas de cultivo. Tomando como referencia
esta hora se escaló a 500 ml y luego a 1000 ml, aumentándose los niveles de actividad
a 0,75 y 1,91 nmol/h/mg (Tabla 13). En este sentido, es importante resaltar que la
comprobación de expresión de la IDShr en forma activa en este modelo biológico,
constituye la ratificación que, específicamente para nuestro caso, las glicosilaciones no
son necesarias para que la enzima sea activa. Los resultados obtenidos en la separación
de la IDShr señalan que los niveles de expresión son bajos (Tablas 13-16), igual que en
P. pastoris, a tal punto que las concentraciones de proteína recombinante no estuvieron
en el umbral mínimo de reconocimiento del anticuerpo policlonal de la columna de
afinidad y se diluyeron durante la corrida cromatográfica (Tabla 15). El proceso se
adelantó sólo hasta la exclusión molecular y el porcentaje de recuperación estuvo por
debajo del 1% (Tabla 16). Aunado a los bajos niveles de expresión de la proteína se
hizo notoria la expresión transiente de la IDShr en este modelo bacteriano. Esto como
consecuencia que el pUC13-IDS es un plásmido de mantenimiento y transporte del
cDNA de interés, en nuestro caso el de la IDSh. Esto último, orientó la investigación
hacia el empleo de un nuevo plásmido, pero esta vez de expresión. En este sentido, se
utilizó el plásmido de expresión pGEX 3X como parte de sistema de expresión GST en
E. coli. El nuevo constructo pGEX 3X-IDS se clonó en la cepa JM109 y en el lisado
celular se detectó IDShr no activa en concentración de 17.28 ng/mg de proteína total. La
IDShr expresada en este caso lleva una cola de glutatión-S-transferasa, que permite su
purificación por cromatografía de afinidad empleando una columna de sefarosa-
glutatión. La presencia de esta cola debe constituir un impedimento conformacional
para la formación del complejo enzima-sustrato. El paso siguiente lo constituye la
117
purificación de la enzima recombinante por cromatografía de afinidad y la proteína
recombinante eluída será sometida a la acción del factor Xa para clivar la cola de
glutation-S-transferasa.
La otra alternativa en busca de información de utilidad para mejorar el sistema de
expresión de proteínas heterólogas lo constituyó el análisis computacional de varios
aspectos de la enzima. Sabemos que existen un gran número de programas de
computación que han sido desarrollados para el estudio de las biomoléculas. Mediante
ellos es posible hacer predicciones en cuanto a estructura y función. Estos programas
utilizan para sus predicciones algoritmos estadísticos, neurales y genéticos, teniendo
como referencia la información acumulada en las bases de datos de Gen Bank,
ExPASy, EMBL y otras. Los programas de computación se han convertido en
herramientas útiles porque al lograr tener conocimiento de aspectos relativos a la
estructura y por consiguiente el comportamiento de una molécula, facilitan el diseño de
experimentos y permiten el ahorro de energía, tiempo y dinero que de otra manera no
sería posible. Dichas herramientas son de fácil acceso y aunque son laboriosas en su
uso, no son complicadas en su manejo. Con el empleo de este tipo de herramientas, una
revisión bibliográfica profunda y análisis teóricos se obtuvieron resultados que serán de
gran utilidad en la expresión y potencial uso IDShr en TRE para pacientes con el
Síndrome de Hunter. Se llevaron a cabo análisis computacionales a nivel de estructura
primaria y elaboración de modelos computacionales para las estructuras secundaria,
terciaria y sitio activo. De estos aspectos no existen reportes en la literatura. Con
relación al primer nivel podemos señalar que los resultados obtenidos para la
predicción del perfil de accesibilidad sugieren que la IDSh es una molécula con un alto
porcentaje de zonas de alta accesibilidad (Figura 16), lo cual está de acuerdo con el alto
porcentaje de estructura terciaria en coil (Figuras 26 y 27). Aunque 160 residuos son de
tipo hidrofóbico (Figura 14), solo la región correspondiente al peptido señal y los
siguientes 10 aminoácidos, presentan altos valores de hidrofobicidad (Figura 15), lo
que se explica por la naturaleza de las secuencias de los peptidos señal (122). También,
este bajo perfil de hidrofobicidad en gran parte de la molécula esta acorde con el alto
porcentaje de zonas expuestas en la estructura terciaria (Figura 26). El perfil de
118
flexibilidad (Figura 17), sugiere que la enzima es una molécula altamente flexible, lo
que se explica por su naturaleza de enzima, ya que esto facilita su actividad catalítica.
Computacionalmente se determinaron valores de 5.15 para el punto isoeléctrico (pI) y
de 58.479 KDa para el peso molecular. Experimentalmente se han determinado valores
similares en cuanto al pI (58), sin embargo, en la determinación del peso molecular por
métodos variados, se han reportado valores entre 43 y 49 KDa para la proteína madura
en diferentes tipos celulares (110-113). Esta diferencia en el peso molecular se debe
posiblemente a que los patrones de glicosilación en la proteína nativa no son
considerados en la predicción computacional y que las formas maduras de la IDSh han
perdido en el procesamiento un fragmento de 18 KDa (12). El conocimiento del pI y el
peso aproximado de la forma madura de la enzima fueron considerados en el
establecimiento de los protocolos de purificación de la enzima recombinante,
concretamente en la selección de los poros de las membranas de ultrafiltración, la
selección del buffer de mantenimiento y el uso de cromatografía de exclusión
molecular.
En la secuencia de la IDSh existen 26 sitios potenciales de fosforilación en treoninas,
tirosinas o serinas con alta probabilidad de ocurrencia y aunque existen 61 residuos
más factibles de fosforilarse las probabilidades en estos casos son muy bajas (Figura
18). Se ha postulado (59-61), que la enzima puede estar fosforilada, sin embargo, los
autores no presentan evidencias que permitan dilucidar si esta fosforilación es a nivel
del péptido o en la parte glicosídica, en donde también cabría la posibilidad, sabiendo
que esta enzima es lisosomal y para poder llegar a los lisosomas requiere estar
fosforilada en residuos de manosa (128). Esta alta probabilidad de fosforilación permite
pensar que algunas de las múltiples isoformas tejido-específicas de la enzima humana
sean por niveles diferentes de fosforilación. Estudios de espectrometría de masas con la
proteína purificada permitirán comprobar los reales niveles de fosforilación de la IDS,
tanto en la humana nativa como en la proteína recombinante.
En cuanto a las glicosilaciones sabemos que pueden ser fundamentalmente de dos tipos
N y O-glicosilación (125). Por su naturaleza de enzima lisosómica, la IDSh sufre una
119
serie de modificaciones postranslacionales, dentro de las cuales el proceso de
glicosilación es uno de los más importantes. Este proceso de glicosilación se realiza
entre el retículo endoplásmico y el complejo de Golgi (129-131) y las glicosilaciones
fundamentalmente son del tipo N-. El componente computacional nos indica que
existen en el péptido precursor ocho potenciales sitios de adición de azucares a residuos
de asparagina (Figura 14), el primero es eliminado al escindirse el péptido señal y los
dos últimos se pierden al eliminarse el fragmento de 18 KDa (12). Cinco de estos sitios
tienen probabilidades de glicosilarse entre el 65 y 80%, dos con probabilidades entre 50
y 60% y el último con niveles probabilísticos del 52% (Figura 20). Se ha demostrado
(60), que todos los sitios de glicosilación estan ocupados por glicósidos de
aproximadamente 2 KDa cada uno. El modelo computacional propuesto (Figuras 28 y
29) muestra que estos potenciales sitios de N-glicosilación están expuestos, lo que
facilita su ocupación por glicósidos. De los 62 potenciales sitios de O-glicosilación,
ninguno supera el 50% de probabilidad de ocurrencia, lo cual no permite considerarlo
como predicción (Figura 19).
Del total de proteínas codificadas por los 30000 genes humanos (138), un buen
porcentaje de estructuras terciarias han sido obtenidas por la industria farmacológica,
sin embargo, gran parte de ellas no se encuentran reportadas en PDB (135). De las
25000 secuencias presentes en esta base de datos solo 5100 se consideran de buena
calidad y de ellas 1100 corresponden a proteínas humanas. Sin embargo, la gran
mayoría son simplemente fragmentos o dominios. Atendiendo a esto último, menos del
1% del total de proteínas tienen estructura terciaria determinada experimentalmente
(138,178). Además, cerca del 20% de los dominios del total de proteínas son reportados
como producto de la predicción computacional por homología (138,178). En resumen se
tiene conocimiento de menos del 10% del total de proteínas. Sin embargo, como
alternativa existe la posibilidad de obtener información sobre estructura y
comportamiento de proteínas gracias al modelaje homólogo que permiten las
herramientas computacionales.
La mayoría de las estructuras tridimensionales de PDB han sido obtenidas por
cristalografía, resonancia magnética nuclear (NMR) o modelaje teórico (138,178,179)
120
Los mencionados procedimientos experimentales con frecuencia presentan limitaciones,
tales como la distorsión de algunas regiones de la estructura durante la cristalización,
debido a contacto entre moléculas cercanas en el cristal y puesto que se utilizan cristales
altamente hidratados, en ocasiones no se tiene certeza si un átomo corresponde a la
proteína o a una molécula de agua. Los cristales deben ser perfectos y esta parte del
proceso se constituye en muchos casos en la limitante del procedimiento. De otro lado,
la NMR permite determinar estructuras de proteínas en solución, sin embargo, se limita
a moléculas menores a 30 KDa, es el método de preferencia para proteínas pequeñas
que no son fáciles de cristalizar, sin embargo los resultados de la NMR son
ensamblados en modelos alternativos, en contraste con un modelo único de
cristalografía y no resultan tan exactos como los obtenidos por cristalografía. Los dos
procedimientos requieren técnicas y equipo altamente sofisticado, lo que se traducen
en altos costos para procedimientos que en muchas ocasiones implican gran inversión
de tiempo y no siempre arrojan los resultados esperados. En el caso de proteínas
humanas las fuentes de obtención es otro aspecto a considerar, puesto que son bien
conocidos los riesgos infecto-contagiosos de fluidos humanos, de los cuales con
frecuencia las cantidades de proteína separada son bajas. Ante las dificultades
anteriormente señaladas, la predicción por modelaje homólogo (138,177), ofrece la
posibilidad de tener buenas aproximaciones a la estructura tridimensional de una
proteína de interés y la aplicación de este conocimiento al diseño de experimentos y la
explicación de resultados, como es nuestro caso.
La literatura no tiene reportes acerca de sus estructuras secundaria y terciaria de la
IDSh y solo se conoce la secuencia primaria deducida conceptualmente (12). La IDSh
pertenece a las sulfatasas, las cuales son un grupo de enzimas que catalizan reacciones
de hidrólisis de esteres de sulfato de una amplia variedad de sustancias, desde moléculas
complejas como glicosaminoglicanos, glicoproteínas y glucolípidos hasta esteroides
sulfatados (103). Se considera que los genes de esta familia de enzimas, evolutivamente
están altamente conservados desde procariotes hasta humanos (103-106). Está bien
establecido que proteínas homólogas han evolucionado de un ancestro común que
conservan su función a través de la escala biológica y adoptan una estructura
tridimensional similar. Estas proteínas corrientemente tienen secuencias similares en
121
cerca del 20%, mientras que proteínas análogas llegan a tener alrededor del 10% de
similaridad (138). Dado que las secuencias similares decrecen tanto en proteínas
homólogas distantes como en análogas, el reconocimiento de homologías y analogías
es importante para una aproximación a la estructura tridimensional. Los alineamientos
de la IDSh con las ARSA y ARSB humanas, las dos únicas sulfatasas con estructura
tridimensional establecida mediante cristalografía (104, 172), mostraron similaridades
del 24 y 26% (Figuras 21 y 22), es decir, valores dentro de los rangos establecidos para
considerar una predicción con una alta probabilidad de ocurrencia (138).
El dogma central que motiva la predicción computacional señala que “la estructura
tridimensional de una proteína es determinada por su secuencia independientemente de
los factores extrínsecos” (138). Sin embargo, algunos autores consideran que debe
tenerse en cuenta el papel de los factores ambientales. Aunque es conocido que
moléculas chaperonas e intercambiadores de puentes disulfuro participan de
mecanismos de plegamiento, evidencias experimentales demuestran que estas moléculas
solamente asisten y no determinan el estado nativo final. Lo anterior permitió abordar
desde esa óptica los algoritmos estadísticos y neurales de los programas
computacionales de predicción de estructura proteica de la IDSh a nivel secundario y
terciario. En este orden de ideas, la predicción de las estructuras secundaria y terciaria,
constituyen modelos computacionales de la estructura de la enzima, inexistente hasta
ahora.
El perfil de antigenicidad (Figura 34), muestra regiones potencialmente antigénicas y
sugiere que el diseño de péptidos a emplear para la producción de anticuerpos deben
encontrarse en estas regiones. La figura 35 presenta la ubicación de los péptidos
diseñados para la producción de IgY anti-IDSh y su nivel de accesibilidad dado por
su grado de exposición. El anticuerpo generado por el péptido 2, el de mayor exposición
fue el de mayor titulo, seguido por los anticuerpos producidos como respuesta a los
péptidos 3 y 1, mientras que el último presentó el menor nivel de reconocimiento
antigénico porque su secuencia se encuentra en la última zona de la molécula que
corresponde al fragmento de 18 KDa que se elimina durante el procesamiento de la
enzima.
122
Un análisis teórico y computacional de la comparación de estructura y función de otras
sulfatasas (103-106, 172), permitió proponer un modelo para el sitio activo de la IDSh.
El hallazgo en dos pacientes, de niveles normales de sulfatasas que no presentaban
actividad catalítica, orientó los estudios para localización y mecanismo catalítico de este
grupo de enzimas (106). La enfermedad sufrida por estos pacientes es originada por un
error innato del metabolismo y se conoce como deficiencia multiple de sulfatasas. Se
ha postulado que la maquinaria bioquímica responsable de esta oxidación, reconoce una
secuencia altamente conservada en las sulfatasas, desde procariotes hasta humanos que
constituyen el motivo reconocido para la modificación postranslacional mencionada.
En la IDSh el residuo de cisteína que sufre la oxidación hasta formilglicina corresponde
a la cisteína en posición 84. Por homología con las ARSA y ARSB (Tabla 18), se
ubicaron los residuos conservados que componen el sitio activo en el modelo de
estructura terciaria y se propone un modelo de organización del sitio catalítico para la
IDSh (Figura 30). El modelo de sitio activo, incluye la propuesta de un átomo de
manganeso como el catión divalente necesario para la actividad catalítica de la IDSh,
puesto que la presencia del catión incrementa los niveles de actividad de la enzima
(114). Su posible localización dentro del centro activo se muestra en la figura 33.
El modelo de estructura terciaria fue comparado mediante el RMS con las estructuras
experimentales de las ARSA y ARSB, encontrándose diferencias no significativas
(menores de 1.0 Å), lo que sugiere que la estructura propuesta constituye un modelo
con un alto porcentaje de posibilidad de presentarse en la naturaleza, dado que se
considera que un modelo altamente comparativo presenta RMS ≤ 2.0 (135).
La expresión de proteínas humanas heterólogas en levaduras es favorecida cuando se
utilizan péptidos señales de otras levaduras, esto contribuye al correcto procesamiento
de la proteína, la interacción con las proteínas auxiliares del retículo endoplásmico para
la formación de puentes disulfuro, el plegamiento y transporte por la vía de secreción
(174), además que la recuperación de la molécula del medio de cultivo representa un
primer paso en el proceso de purificación (92). La señal de secreción empleada con
mayor frecuencia es el péptido α-Factor (α-MF) de S. cerevisiae (94). En el caso de P.
123
pastoris varias proteínas recombinantes han sido secretadas eficientemente, utilizando el
péptido señal nativo y han mostrado rendimientos dos o tres veces superiores cuando
utilizan un péptido señal de levadura como el α-MF (92). Aunque la secuencia líder α-
MF es propia de S. cerevisiae, es reconocida por la maquinaria bioquímica de P.
pastoris, lo que indica que las diferencias en el mecanismo de secreción de proteínas en
estas dos levaduras son mínimas. Incluso los niveles de proteína expresada con el α-MF
han sido superiores al compararse con los obtenidos utilizando el péptido señal de la
fosfatasa ácida (PHO1), enzima nativa de P. pastoris (180,181). Del cDNA que se
inserta en el plásmido es eliminada la secuencia señal nativa, lo que significa que el
constructo de expresión codifica solamente la secuencia madura de la proteína de
interés. La presencia del péptido señal y el α-MF ha tenido efecto sobre el
procesamiento de la proteína y consecuentemente pérdida de la actividad enzimática
(182). Existe un mecanismo de control de calidad del plegamiento de las glicoproteínas
a nivel del retículo endoplásmico (126), mediante el cual las que no presentan un
plegamiento correcto son retenidas y luego trasladadas al citoplasma y degradadas en
los proteosomas (127). Esto significa que una fracción de las proteínas destinadas a la
secreción es retenida y degradada y el procesamiento en Golgi y posterior secreción se
restringe a las proteínas plegadas correctamente o aquellas que escapan al mecanismo
de control, por saturación del mismo o por un mecanismo aun no conocido.
La presencia de la secuencia señal nativa puede estar afectando los niveles de expresión
de la IDShr y esto podría dar explicación al porque de las bajas concentraciones de
IDShr activa en la mayoría de las 20 fermentaciones realizadas. Evidentemente la
conformación de la IDShr expresada en los modelos biológicos empleados en este
trabajo está afectada por las alteraciones conformacionales que sufre la proteína al
mantener una región adicional altamente hidrofóbica que, sin duda, genera cambios en
la conformación tridimensional, que se traducen en una proteína mal plegada,
posiblemente retenida y luego degradada intracelularmente (126). Puesto que se asume
que el modelo esta diseñado para secretar la proteína heteróloga, se trabajó
fundamentalmente con los sobrenadantes. Para explorar la posibilidad surgida de
permanencia de proteína mal plegada al interior del retículo endoplásmico, complejo de
Golgi o aun que haya podido ser enviada a los lisosomas, se procedió a la ruptura de
124
células P. pastoris del cultivo M-13' y los niveles de actividad de hasta 4.24 nmol/h/mg
de proteína, sugieren que cerca del 50% de la enzima no es secretada. Más
recientemente, se detectó por Western blot (figura 42), la presencia de IDShr en lisados
celulares del cultivo M-22 de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/10 (Sosa A y Barrera LA,
comunicación personal).
La secuencia completa del α-MF consta de 85 aminoácidos, los primeros 19 residuos
corresponden al péptido señal y los siguientes 66 a la región denominada prosecuencia.
En condiciones normales a nivel del retículo endoplásmico la peptidasa señal hidroliza
en el caso de la IDSh en células humanas los primeros 25 residuos y se conservan los
ocho de la prosecuencia que contribuyen al progreso del glicopéptido a través del
retículo y del complejo de Golgi. En el caso del α-MF, los primeros 19 aminoácidos y
se conservan los restantes que son fundamentales para el transporte hasta las vesículas
de secreción en donde Kex2 hidroliza esta secuencia (174).
El análisis de la información obtenida presenta las siguientes posibilidades:
1. La peptidasa señal I (E.C. 3.4.21.89) encargada del reconocimiento del α-MF,
equívocamente reconoce el péptido señal de la IDShr y al hidrolizarlo, se pierde el
pro-péptido del α-MF. El alineamiento de los péptidos líder de la IDSh y del α-MF
no mostraron identidades significativas, lo cual disminuye la potencialidad del
evento. En este caso la enzima no sería secretada por la falta de la ayuda del α-MF
y sería probable que la proteína siga su direccionamiento hasta el lisosoma. Los
resultados del experimento de ruptura química de células de P. pastoris del cultivo
M-13' y los encontrados en M-22 (Figura 42), sugieren que parte de la enzima
permanece intracelularmente. El paso siguiente es localizarla y cuantificarla.
Igualmente, estos resultados sugieren que los niveles de actividad observados en los
sobrenadantes pueden constituir únicamente el 50% del total expresado en este
sistema.
2. La peptidasa señal I hidroliza correctamente el α-MF y la enzima pasa por el
retículo endoplásmico y llega a Golgi. Una vez allí, la endoproteasa Kex2
(3.4.21.61) de P. pastoris reconoce equívocamente la pro-secuencia nativa de la
125
IDShr, lo que traería consigo la secreción correcta de la proteína recombinante. Este
fenómeno químico tiene poca posibilidad de ocurrencia puesto que en el análisis de
la secuencia del pro-peptido de la IDSh, no se encontraron secuencias K-R ni R-R,
que son los motivos para el corte proteolítico de Kex2.
3. La peptidasa señal I hidroliza el α-MF y una vez dentro del retículo endoplásmico el
plegamiento incorrecto de la IDShr no le permite ser guiada a Golgi y por tanto
podría ser degradada a nivel de los proteosomas.
4. El reconocimiento de Kex2 es adecuado sobre la pro-secuencia de α-MF. En este
caso se podría secretar una proteína recombinate con un plegamiento inadecuado
como consecuencia de una región hidrofóbica de 25 residuos y una región
hidrofílica de 8 aminoácidos (pro-secuencia) correspondiente al péptido líder nativo
de la IDSh. Por consiguiente tendríamos una proteína probablemente inactiva.
Se procedió a elaborar el modelo computacional de la estructura terciaria de la IDSh
adicionándole el péptido señal y los ocho residuos del propéptido (Figura 36), donde se
observa claramente que los mencionados 33 residuos afectan la estructura de la enzima,
pues parte de esta secuencia se encuentra cubriendo la entrada al bolsillo de la proteína
recombinante y la restante hélice se dobla buscando acomodarse dentro de un espacio
existente en la molécula, lo cual evidentemente debe alterar la conformación de la
estructura terciaria de la enzima. Es bien claro que el bloqueo de la entrada al sitio
activo constituye un impedimento para la formación del complejo enzima sustrato. Otro
aspecto importante a considerar es la ganancia en flexibilidad de la molécula con los 33
residuos adicionales (Figura 41), lo que permite pensar en la posibilidad de
desplazamientos parciales de toda o parte de esta región como producto de interacción
con el sustrato, los cuales permitirían la unión del sustrato al sitio activo. Esto estaría
explicando porque aun con una proteína sin la conformación natural, se han encontrado
niveles de actividad.
De otro lado, cabe la posibilidad de pensar en asociaciones de tipo hidrofóbico entre los
25 aminoácidos del péptido señal de distintas moléculas IDShr, que se asociarían
rehuyendo la fase hidrofílica. Estas interacciones como fuerzas de Van der Waals
126
mantendrían unidas dos o más moléculas y nos permitiría explicar la constante
presencia de actividad IDShr en fracciones de peso molecular mayor de 100 KDa
(Tabla 9). Asociaciones como estas podrían explicar en gran medida la presencia de
una bandas de 120 KDa detectadas por Western blot en E. coli (Figura 8) y en lisados
de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/10. Así mismo esto podría dar explicación a la
presencia de varias bandas de mayor peso detectadas en los sobrenadantes con relación
a los lisados en cultivos de E. coli (Figura 4) y las de alto peso molecular detectadas en
sobrenadante de cultivo de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 (Figura 5). La presencia de
bandas de bajo peso molecular, sería responsabilidad de la actividad de proteasas
(175,176).
Con relación a la variabilidad fenotípica de la enfermedad de Hunter, es claro que la
misma es reflejo de la heterogeneidad mutacional de la IDSh. Sin embargo, los niveles
de actividad enzimática no se correlacionan con la variabilidad fenotípica, puesto que
las pruebas de detección no tienen poder de discrimación (33,34). En estos ensayos
resultan limitantes las bajas concentraciones de sustrato y las condiciones in vitro que
pretenden simular las condiciones del microambiente lisosomal. Está bien establecido
que no son capaces de detectar actividades residuales en el caso de pacientes con
presentación moderada de la enfermedad (29,33,37). Además, existen otros factores que
hacen que dos pacientes tengan los mismos niveles de actividad enzimática y la misma
mutación, pero fenotipos diferentes. En consecuencia no existe un índice patrón para el
diagnóstico de la severidad de la enfermedad y la diferenciación en formas severa,
intermedia y moderada en la mayoría de los casos conlleva un gran componente de
subjetividad. Generalmente se asocia a la forma severa el retardo mental y el grado de
expresión de los otros síntomas y los pacientes diagnósticados con la forma moderada
no presentan compromiso del SNC y sintomatología menos marcada que en la
presentación severa. Por consiguiente, la forma intermedia abre un rango de
posibilidades fácilmente influenciados por el evaluador. Sin duda, el diagnóstico de la
forma intermedia no resulta fácil de realizar y es aun más compleja la apreciación en
pacientes jóvenes. Desde hace bastante tiempo se ha hecho evidente la necesidad de
uniformizar los criterios de evaluación para el diagnóstico de la enfermedad y en esa
búsqueda de soluciones autores como Bunge en 1993 (29), propusieron criterios para
127
establecer los tres tipos de presentación de la enfermedad. Karsten en 1998 (21),
propuso la evaluación de 32 características para diferenciales en el diagnóstico y aun
así, 9 de 32 pacientes estudiados quedaron sin ubicación en uno de los tres grupos.
Varios autores para sus reportes consideran la clasificación de Neufeld en 1995 (1), la
cual considera como característica diferencial el retardo mental para la forma severa y
alguna dificultad de aprendizaje para la forma intermedia. Producto de todo lo anterior,
la literatura sobre este aspecto del síndrome de Hunter deja la posibilidad abierta a
clasificaciones diferentes para la misma mutación. Ya existen casos como L41P y
C184F que se reportan como severas y moderadas (24,33) o no llegan claramente
definidas como el reporte de H138D (33) en donde señalan que la mutación es de
moderada a intermedia., y es factible que a futuro se sigan develando mas de estas
situaciones. Dos ejemplos de la literatura demuestran claramente las discrepancias en
el fenotipo clínico. En una familia tres de los hijos que tienen la mutación R468L, que
corresponde a una zona caliente para las mutaciones y en donde las mismas
corresponden a presentaciones severas, padecen el síndrome de Hunter en su forma
moderada. El menor de ellos tiene 34 años y es PhD en economía, el otro paciente
cursa con una forma leve y tiene un IQ > 75 (31). El establecer criterios uniformes para
el diagnóstico es fundamental para el establecimiento de terapéuticas. En este trabajo se
buscó encontrar una relación genotipo-fenotipo y para ello se consideraron varios
aspectos como localización de la mutación por exón, grado de exposición en la
estructura terciaria, zonas conservadas y no conservadas en las sulfatasas, carga y
estructura de los aminoácidos implicados en la mutación y distancia de la misma a la
cisteína 84 como punto referencial al sitio activo. En el primer intento de análisis
considerando las tres presentaciones de la enfermedad, no se observó ninguna
tendencia. Par un análisis posterior, considerando lo anteriormente señalado para la
clasificación de severidad en tres tipos y asumiendo como criterio diferencial el
compromiso del SNC se adoptaron solo dos tipos de severidad, es decir, moderado y
severo. Algunos autores (27), han considerado que mutaciones en zonas evolutivamente
conservadas en las sulfatasas siempre expresan fenotipo severo y las presentes en
zonas no conservadas corresponden a presentaciones moderadas. Si bien se cumple para
varios casos no es válido para otros. Mutaciones en zonas conservadas como S491F,
E341K y G336, son de presentación severa y H342Y y D334N resultan clínicamente
128
moderadas. Igualmente mutaciones en regiones únicas en la IDSh como Y108S y
N265I son clínicamente moderadas, en tanto que otras G224E, C432Y y K347 son
fenotípicamente severas (28,31,33). A diferencia de lo encontrado en el análisis
computacional de la GALANS (183), la distancia como único factor no mostró una
relación clara entre cercanía al sitio activo y severidad. Tampoco se pudo establecer una
única relación entre severidad y tamaño del aminoácido o naturaleza química por grupo
(hidrofóbicos, polares no cargados, polares cargados). Considerando aminoácido por
aminoácido, carga, tamaño y distancia a la cisteína 84 permitió proponer algunos
criterios para establecer la correlación genotipo-severidad (Tabla 19). Las nuevas
interacciones locales por cambios electrostáticos y de estructura generados por los
cambios de residuos cargados o aromáticos generalmente resultan en variaciones
drásticas en la estructura de la proteína mutada, causando que la misma pierda o vea
disminuida su capacidad catalítica, lo que explicaría los fenotipos severos. En el caso de
las presentaciones clínicas moderadas, las proteínas mutadas no deben sufrir cambios
muy drásticos, por ejemplo, cambio de un aminoácido hidrofóbico por otro de la misma
naturaleza. La distancia a la cisteína 84, como referencia del centro activo, puede
aminorar los cambios locales, de tal manera que el efecto sobre la funcionalidad de la
enzima puede afectarse de forma mínima. Independientemente del tipo de residuo que
se mute y sea mutado, las mutaciones presentes en zonas cercanas al sitio activo
siempre resultan en fenotipos severos. En el caso de la prolina, un residuo de tipo
hidrofóbico y aromático, cualquier residuo mutado por éste se traduce en un cuadro
clínico severo. Este tipo de cambio severo ya ha sido observado con frecuencia en otras
proteínas (184-188).
Con el propósito establecer el efecto de las mutaciones sobre la conformación
tridimensional de la IDSh se compararon 50 de las estructuras mutadas con la normal
calculando el RMS, para todos los casos las diferencia encontradas no fueron
significativas, lo que sugiere que los cambios de estructura causados por las mutaciones
no pueden ser evidenciados por esta metodología y se requiere buscar otros
procedimientos más sensibles para tal fin.
129
Si bien, en este momento los esfuerzos investigativos del IEIM (2,102,115-
120,144,183), en gran medida están dirigidos a la búsqueda de alternativas terapéuticas
para la MPS II y otras mucopolisacaridosis, tanto el sistema de expresión de proteínas
humanas recombinantes para uso terapéutico, como los trabajos en la línea de
investigación en TRE constituyen modelos en desarrollo, los cuales al consolidarse van
a permitir no solo ofrecer una terapéutica para la enfermedad de Hunter, sino también
abordar, bajo esos esquemas implementados, otras enfermedades. Es muy factible que
puedan ser estudiadas muchas de las 50 enfermedades de depósito lisosomal. De igual
manera el tipo de estudio computacional que se ha llevado a cabo, constituirá una parte
integral de ese gran modelo de estudio para esas enfermedades potenciales de investigar
en la búsqueda de alternativas terapéuticas para ellas.
130
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1. Se comprobó inequívocamente que es activa la IDShr expresada en P. pastoris y
E. coli, mediante el uso de una prueba fluorométrica adaptada para detectar la
actividad catalítica de la IDShr en estos modelos biológicos.
2. Con el propósito de mejorar el sistema de purificación de la IDShr se produjo un
anticuerpo policlonal anti-IDShr.
3. Con el fin de mejorar el sistema de purificación se implementó una metodología
que reduce de siete a tres fases, que es lo corriente para separar IDS.
4. La enzima recombinante presentó niveles de actividad de hasta 4 y 9 veces los
presentes en plasma y leucocitos humanos, sin embargo esto no es lo óptimo
para obtener cantidades clínicamente útiles. Lo que significa que deben
mejorarse los sistemas de expresión y purificación.
5. Con el propósito de mejorar el sistema de expresión se clonó el cDNA de la
IDSh en el plásmido pGEX 3X y se expresó la IDShr en E. coli JM109 con el
empleo del sistema GST.
6. Se propone un modelo computacional de estructura tridimensional de la IDSh
que presenta 33.3% en hélice, 7.2% en hoja plegada y 59.5% en coil.
7. El modelo computacional de la IDSh presenta expuestos los cinco sitios
potenciales de N-glicosilación, zonas de alta antigenicidad, una entrada al
bolsillo que contiene los aminoácidos que componen el sitio activo y en el cual
encaja el sustrato heparán sulfato. Cuando se comparó con las ARSA y ARSBA
se obtuvieron valores de RMS de 0.78 y 0.86 Å, respectivamente.
8. El modelo computacional permitió: el diseño de péptidos específicos para la
producción de anticuerpos IgY anti-IDShr; explicar los bajos niveles de
actividad de la IDShr en el sistema que se emplea actualmente; la presencia de
bandas de diferente tamaño en los sobrenadantes de P. pastoris y E. coli, la
actividad en fracciones procedentes de ultrafiltración con peso menor a 30 KDa
y contribuir a establecer una relación genotipo/severidad de la enfermedad de
Hunter.
131
En cuanto a las recomendaciones se sugiere:
1. Realizar estudios de inmunomicroscopía electrónica para monitorear la localización
intracelular de la proteína humana recombinate.
2. Adelantar estudios conducentes a la mejorar el sistema de expresión, para lo cual se
recomienda extraer el DNAc de IDSh a partir del plásmido pUC13-IDS a través de
un corte doble, combinando alguna de las enzimas Bse 118I, BsrFI, BssAI, Crf 1OI,
CpoI, CspI, Rsr 2I, Rsr II con EcoRI. Con lo cual se obtendrá el cDNA maduro de la
IDSh sin el péptido señal nativo. Clonar el fragmento aislado en los plásmidos
pPIC9 y/o pHIL-S1 con miras a su expresión en P. pastoris. Estos plásmidos portan
las señales de secreción del α-factor (S. cerevisiae) y PHO1 (P. pastoris),
respectivamente y realizar un estudio comparativo de la expresión en IDShr en P.
pastoris con las nuevas construcciones genéticas.
3. Continuar con los estudios de expresión de la IDShr en E. coli con el sistema GST
4. Realizar estudios para mejorar las condiciones de fermentación. Entre estas el pH,
con el propósito de disminuir la actividad proteolítica.
5. Incrementar la productividad del sistema para obtener cantidades suficientes de
IDShr y realizar su cristalización, lo cual permitirá comprobar experimentalmente la
validez de los modelos computacionales.
132
BIBLIOGRAFIA
1. Scriver CR, Beaudet A, Sly W, Valle D. (Eds). The metabolic and molecular bases of inherited disease. 8th Ed. Edit. Mc Graw-Hill. New YorK. 6329 p.
2. Barrera LA, Sáenz H, Cuéllar Y, Ospina S, Garzón K, Cabrera M, Márquez W, Torres AL. (2004). Manual de enfermedades metabólicas. Panamericana editores SA. Bogotá. 280 p.
3. Cohn RM, Roth KS. (1983). Metabolic disease. A guide to early recognition.
Saunders Co. Philadelphia. 442 p. 4. Rummelt V, Meyer HJ, Naumann GO. (1992). Light and electron microscopy of
the cornea in systemic mucopolysaccharidoses type I-S (Scheie syndrome). Cornea 11:86- 92.
5. Pronicka E, Tylki-Szymanska A, Kwast O, Chimielik J, Maciejko D, Cedro A
(1988). Carpal tunnel syndrome in children with mucopolysaccharidoses: Needs for surgical tendons and median nerve release. J Ment Defic Res 32:79-82.
6. Fawcett WD. (1986). Tratado de histología. 11ª. Ed. McGraw Hill-Interamericana Mexico. 1026 p.
7. Bunge S, Stegli C, Beck M, Rosenkranz W, Schringer E, Hopwood JJ. (1992). Mutation analysis of the iduronate 2-sulfatase gene in patients with mucopolysaccharidoses type II (Hunter syndrome). Hum Mol Genet 2:5-10
8. Schaap T, Bach G. (1980). Incidence of mucopolysaccharidoses in Israel:
Hunter disease a jewish disease. Hum Genet 56:221-223. 9. Young ID, Harper PS. (1982). Incidence of Hunter’s syndrome. Human Genet 60:
391-392. 10. Nelson J, Crowhurst J, Greed L. (2003). Incidence of the mucopolysaccharidoses
in western Australia. Am J Med Genet 123:310-313.
11. Lowry RB, Applegarth DA, Toone JR., Macdonald E, Thunem NY. (1990). An Update on The frequency of mucopolysaccharide syndrome in British Columbia. Human Genet 85:389.
12. Wilson PJ, Morris CP, Anson DS, Occhiodoro T, Bielicki J, Clements PR, and
Hopwood JJ. (1990). Hunter sindrome: isolation of an iduronate 2-sulfatase cDNA clone and analysis of patients DNA. Proc Natl Acad Sci USA 87: 8531-8535.
133
13. Wilson PJ, Meaney CA, Hopwood JJ, Morris CP. (1993). Secuence of the human iduronate 2-sulfatase. Genomics 17:773-775.
14. Flomen RH, Green EP, Green PM, Beutley DR, Gianelli F. (1993). Determination
of the organization of coding sequences within the iduronate sulphate sulphatase (IDS) gene. Human Mol Genet 2:5-10.
15. Rathmann M, Bunge S, Steglich C, Schwinger E, Gal A. (1995). Evidence for an iduronate-sulfatase pseudogene near the functional Hunter syndrome gene in Xq27.3-q28. Hum Genet 95:34–38.
16. The Human Gene Mutation Database at the Institute of Medical Genetics in
Cardif. (HGMD). (2005). http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html. 17. Gort L, Chabas A, Coll J. (1998). Hunter disease in the spanish population:
molecular analysis in 31 families. J Inher Metab Dis 21:655-661. 18. Vafiadaki EA, Cooper LE, Heptinsall, Hatton CE, Thornley M, Wraith JE.
(1998). Mutation analysis in 57 unrelated patients with MPS II (Hunter's disease). Arch Dis Child 79:237-241.
19. Filocamo M, Bonuccelli G, Corsolini F, Mazzotti R, Cusano R And Gatti R.
(2001). Molecular analysis of 40 italian patients with mucopolysaccharidosis type II: New mutation in the iduronate-2-sulfatase (IDS) gene. Hum Mutat. Mutation in Brief # 433. Online.
20. Cudry S, Tigaud I, Froissart R, Bonnet V, Maire I, Bozon D. (2000). MPS II in
females : Molecular basis of two different cases. J Med Genet 37:1-4. 21. Karsten S, Voskoboeva E, Tishkanina S, Pettersson U, Krasnopolskaja
X, Bondenson M. (1998). Mutational spectrum if the iduronate-2-sulfatase (IDS) gene in 36 unrelated russian MPS II patients. Hum Genet 103:732-735.
22. Li P, Bellows A, Thompson J. (1999). Molecular basis of iduronate-2-sulphatase
gene mutation in patients with mucopolisaccharidosis type II (Hunter syndrome). J Med Genet 36:21-27.
23. Bunge S, Rathmann M, Steglich C, Bondeson ML, Tylki-Szymanska A, Popowska
E, Gal A. (1998). Homologous nonallelic between the iduronate-sulfatase gene and pseudogene cause various intragenic deletions and invertions in patients with mucopolysaccharidose type II. Eur J Hum Genet 6:492-500.
24. Rathmann M, Bunge S, Beck M, Kresse H, Tylki-Szymanska A, Gal A. (1996).
Mucopolysaccharidosis Type II (Hunter Syndrome): Mutation "hot spots" in the Iduronate-2-Sulfatase Gene. Am J Hum Genet 59:1202-1209.
134
25. Silva M, Froissart R, Marques dos Santos H, Caseiro C, Maire I, Bozon D. (2001). molecular basis of mucopolysaccharidosis type II in Portugal: Identification of four novel mutations. Clin Genet 60:316-318.
26. Kim CH, Hwang HZ, Song SM, Paik KH, Kwon EK, Moon KB, Yoon JH, Han
CK, Jin D. (2003). Mutational Spectrum of the Iduronate 2 Sulfatase Gene in 25 Unrelated Korean hunter Syndrome Patientes: Identification of 13 Novel Mutations. Hum Mutat. Mutation in Brief 599. Online.
27. Isagai K, Sukegawa K, Tomatsu S, Fukao T, Song X-Q, Yamada Y, Fukuda S,
Orii T, Kondo N. (1998). Mutation Analysis in the Iduronate-2-Sulphatase Gene in 43 Japonese Patientes with Mucopolisaccharidosis Type II (Hunter Disease). J Inher Metab Dis 21:60-70.
28. Li P, Thompson JN. (1996). Detectioin of Four Novel Mutation in the Iduronate-
2-Sulphatase Gene by Single-Strand Conformation Polymorphism Analysis of Genomic Amplicons. J Inher Metab Dis. 19:93-94.
29. Bunge S, Steligch C, Zuther C, Beck M, Morris CP. (1993). Iduronate 2-sulfatase
gene mutations in 16 patients with mucopolysaccharidosis type II. Hum Mol Genet 2:335-339.
30 Vallance H, Bernard L, Rashed M, Chiu D, Le G, Toone J,
Applegarth D, Coulter-Mackie M. (1999). Identification of 6 Novel Mutation in the Iduronate Sulfatase Gene. Hum Mutat. Mutation in Brief 233. Online.
31. Villani GRD, Balzano N, Grosso M, Salvatore F, Izzo P, Di Natalie P. (1997).
Mucopolysaccharidosis Type II: Identification of Six Novel Mutation in Italian Patients. Hum Mutat 10:71-75.
32. Bonucelli G, Di Natale P, Corsolini F, Villani G, Regis S, Filocamo M. (2001).
The effect of four mutations on the expression of iduronate 2-sulfatase in mucopolysaccharidosis type II. Biochim Biophys Acta 1537 : 33-238.
33. Froissart R, Millat G, Maire I, Cudry S, Birot A-M, Bouton O, Bozon D. (1998).
Identification of iduronate sulfatase gene alteraciones in 70 unrealated Hunter patients. Clin Genet 53:362-368.
34. Parkinson EJ, Muller V, Hopwood JJ, Brooks DA. (2004). Iduronate 2-sulphatase
protein detection in plasma from mucopolysaccharidosis type II patients. Mol Genet Metab 81:58–64.
35. Hopwood JJ, Bunge S, Morris CP, Wilson PJ, Steglich C, Beck M, Schwinger E,
Gal A. (1993). Molecular bases of mucopolysaccharidosis type II: mutations in the iduronate-2-sulphatase gene. Hum Mutat 2(6):435-42.
135
36. Schroder W, Wulff K, Wehnert M, Seidlitz G, Herrmann FH. (1994). Mutations of the iduronate-2-sulfatase (IDS) gene in patients with Hunter syndrome (mucopolysaccharidosis II). Hum Mutat 4(2):128-31.
37. Sukegawa K, Tomatsu S, Fukao T, Iwata H, Song XQ, Yamada Y, Fukuda S,
Isogai K, Orii T. (1995). Mucopolysaccharidosis type II (Hunter disease): identification and characterization of eight point mutations in the iduronate-2-sulfatase gene in Japanese patients. Hum Mutat 6(2):136-43.
38. Jonsson JJ, Aronovich EL, Braun SE, Whitley CB. (1995). Molecular diagnosis of
mucopolysaccharidosis type II (Hunter syndrome) by automated sequencing and computer-assisted interpretation: toward mutation mapping of the iduronate-2-sulfatase gene. Am J Hum Genet 56(3):597-607.
39. Olsen TC, Eiken HG, Knappskog PM, Kase BF, Mansson JE, Boman H, Apold J.
(1996). Mutations in the iduronate-2-sulfatase gene in five norwegians with Hunter syndrome. Hum Genet. 97(2):198-203.
40. Coppa GV, Gabrielli O, Cordiali R, Villani GR, Di Natale P (1999). Bone marrow
transplantation in Hunter patient with P266H mutation. Int J Mol Med 4:433-6 41. Vellodi A, Young E, Cooper A, Lidchi V, Winchester B, Wraith JE. (1999). Long-
term follow-up following bone marrow transplantation for Hunter disease. J Inherit Metab Dis 22:638-48.
42. McKinnis EJ, Sulzbacher S, Rutledge JC, Sanders J, Scott, CR. (1996). Bone
marrow transplantation in Hunter syndrome. J Pediatr 129:145-148.
43. Kaye EM. (2001). Lysosomal Storage Diseases. Curr Treat Options Neurol 3:249- 256.
44. Brown FR, Hall CW, Neufeld EF, Muñoz LL, Braine H, Andrzejewsky S, Camargo
EE, Mark SA, Richard JM, Moser HW. (1982). Administration of iduronate sulfatase by plasma exchange to patients with Hunter syndrome: A clinical study. Am J Med Gen 13: 309-308
45. Dean M.F, Stevens RL, Muir H, Benson PF, Button LR, Anderson RL, Bolyston
A, Mowbrady J. (1979). Enzyme replacement therapy by fibroblast transplantation: Long-term biochemical study in three cases of Hunter’s syndrome. J Clin Invest 63:138-145.
46. Cantz. M, Chrambach A Bach G and Neufeld F. (1972). The Hunter corrective
factor. purification and preliminary characterization. J Biol Chem 247: 5456-5462.
47. Muenzer J, Neufeld EF, Constantopoulos G, Caruso RC, Kaiser-Kupfer MI, Pikus A, Danoff J, Berry RR, McDonald HD, Thompson JN. (1992). Attempted enzyme
136
replacement using human amnion membrane implantations in mucopolysaccharidoses. J Inherit Metab Dis 15:25-37.
48. Isoyama K, Ohnuma K, Ikuta K, Toyoda Y, Nakajima F, Yamada K, Nishihira H.
(2003). Unrelated cord blood transplantation for second hemopoietic stem cell transplantation. Pediatr Int. 45:268-74.
49. Muenzer J, Lamsa JC, García A, Dacosta J, Trecco DA. (2002). Enzyme
replacement therapy in mucopolysaccharidosis type II (Hunter syndrome): a preliminar report. Acta Paeditr Suppl 439: 98-92.
50. Braun, SE, Aranovich, EL, Anderson RA, Crotty PL, McIvor RS, Whitley CB.
(1993) Metabolic correction and cross-correction of mucopolysaccharidosis type II (Hunter syndrome) by retroviral-mediated gene transfer and expression of human iduronate 2- sulfatase. Proc Nat Acad Sci USA 90:11830–11834
51. Pan D, Shankar R, Stroncek DF, Whitley CB. (1999). Combined ultrafiltration-
transduction in a hollow bioreactor facilitates retrovirus-mediated gene transfer into peripheral blood lymphocytes from patients with mucopolysaccharidosis type II. Hum Gen Ther 20:10(17):2799-810.
52. Stroncek DF, Hubel A, Shankar RA, Burger SR, Pan D, McCullough J, Whitley
CB. (1999). Retroviral transduction and expansion of peripheral blood lymphocytes for the treatment of mucopolysaccharidosis type II, Hunter' syndrome. Transfusion 39:343-50.
53. Hubel A, Darr TB, Norman JA. (1999). Freezing characteristics of genetically
modified lymphocytes for the treatment of MPS II. Cell Transplant 8:521-30. 54. Dao P, Jonsson JJ, Stephen E, Braun R, McIvor S, Whitley C.B (2000).
Supercharged cells for delivery of recombinant human iduronate. Mol Genet Metab 70:170–178.
55. Gutiérrez MA, Cerón F, García F, Barrera LA. (2001). Construcción y
evaluación de un vector de expresión episomal conteniendo el cDNA de la IDS para corregir la deficiencia enzimática en fibroblastos de paciente con síndrome de Hunter. III Congreso Latinoamericano de Errores Innatos del Metabolismo y Pesquisa Neonatal. Octubre 21-24. Cartagena, Colombia.
56. Danielli A, Tomanin R, Villani GR, Zacchello F, Scarpa M, Di Natale P. (2002).
Uptake of recombinant iduronate 2-sulfatase into neuronal and glial cells in vitro. Biochim Biophys Acta 1588:203-209.
57. Sáenz H, Gutiérrez MA, Barrera LA. (2004). Terapia génica con vectores virales
para el tratamiento de mucopolisacaridosis y otras enfermedades genéticas. Universitas Médica 45:22-31
137
58. Bielecki J, Hopwood J, Wilson P, Anson S. (1993). Recombinant human iduronate 2-sulphate sulphatase: Correction of mucopolysaccharidosis type II fibroblastes and characterization of the purified enzyme. Biochem J 289:241-246.
59. Froissart R, Millat G, Mathiu M, Bozon D, Maire I. (1995). Processing of
iduronate 2-sulphatase in human fibroblasts Biochem J 309:425-430 60. Millat G, Froissart R, Maire I, Bozon D. (1997). Characterization of iduronate
sulphate sulphatase mutants affecting N-glycosilations sites and cysteine–84 residues. Biochem J 326:243-247.
61. Millat G, Froissart R, Maire I, Bozon D. (1997). IDS transfer from overexpressing
cell to IDS-deficient cell. Exp Cell Res 230:362-367. 62. Sáenz H. (2003). La terapia de reemplazo enzimático en el tratamiento de
enfermedades genéticas Universitas Scientiarum 8:31-42.
63. Desnick RJ. (2004). Enzyme replacement and enhancement therapies for
lysosomal diseases. J Inherit Metab Dis 27:385-410.
64 Genzyme (1999). A rare kind of care. Committed to life-enhancing therapeutic solutions for patients with rare genetic diseases worldwide. Genzyme Corporation. Cambridge MA.
65. Hilman BC, Sorensen RU. (1994). Management options: SCIDS with adenosine
deaminase deficiency. Ann. Allergy 72:395-402. 66. Grabosky GA, Barton NW, Pastores G, Dambrosia JM, Banerjee TK, Makee MA,
Parker C, Schiffmann R, Hill SC, Brady RO. (1995). Enzyme therapy in type I Gaucher’s disease: Enzyme replacement therapy in Gaucher’s disease comparative efficacy of mannose-terminated glucocerebrosidase from natural and recombinant sources. Ann Intern Med 22: 3-39.
67. Grabosky GA, Lesli N, Wenstrup R. (1998). Enzyme therapy for Gaucher disease:
The First 5 years. Blood Rev 12:115-133. 68. Brady RO, Schiffmann R. (2000). Clinical features of and recent advances in therapy
for Fabry disease. JAMA. 284: 2771-277. 69. Ioannov YA, Zeidner KM, Gordon RZ, Desnick RJ. (2001). Fabry disease:
preclinical studies demonstrate the effectiveness of alpha-galactosidase A replacement in enzyme deficient mice. Am J Hum Genet 68:14-25.
70. Kakkis EV, Muenzer J, Tiller G, Waser L, Belmont J, Neufeld F. (2001). Enzyme
Replacement Therapy in Mucopolysaccharidosis I. N Engl Med 344: 182-8.
138
71. Wraith J.E., Clarke L.A., Beck M. (2004). Enzyme replacement therapy for mucopolysaccharidosis I: a randomized, double-blinded, placebo-controlled, multinational study of recombinant human alpha-L-iduronidase (Laronidase). J Pediatr 144: 581-588.
72. Amalfitano A, Bengur AR, Morse RP. (2001) Recombinant human acid alpha-
glucosidase enzyme therapy for infantile glycogen storage disease type II: results of a phase I/II clinical trial. Genet Med 3:132-138.
73. Van den Hout JM, Kamphoven JH, Winkel LP. (2004) Long-term intravenous
treatment of Pompe disease with recombinant human alpha-glucosidase from milk. Pediatrics 113:448-457.
74. Miranda SR, He X, Simonaro CM. (2000). Infusion of recombinant human
acid sphingomyelinase into Niemann Pick disease mice leads to visceral, but not neurological, correction of the pathophysiology. FASEB J 14:1988-1995.
75. Du H, Schiavi S, Levine M, Mishra J, Heur M, Grabowski GA. (2001). Enzyme
therapy for lisosomal acid lipase deficiency in the mouse. Hum Mol Genet 10:1639-1648.
76. Sands MS, Vogler CA, Ohlemiller KK. (2001). Biodistribution, kinetics, and
eficacy of highly phosphorylated and non-phosphorylated beta-glucuronidase in the murine model of mucopolysaccharidosis VII. J Biol Chem 276:43160-43165.
77. Vogler C, Levy B, Galvin NJ. (1999). Enzyme replacement in murine
mucopolysaccharidosis type VII: neuronal and glial response to beta-glucuronidase requires early initiation of enzyme replacement therapy. Pediatr Res 45:342-348.
78. Auclair D., Hopwood JJ., Brooks DA., Lemontt JF., Crawley AC. (2003).
Replacement therapy in Mucopolysaccharidosis type VI: advantages of early onset of therapy. Mol Genet Metab 78:163-74.
79. Harmatz P, Whitley CB, Waber L. (2004). Enzyme replacement therapy in
mucopolysaccharidosis VI (Maroteaux-Lamy syndrome). J Pediatr 144:574-580. 80. Byers S, Crawley A, Brumfield LK, Nuttal JD, Hopwood JJ. (2000).
Enzyme replacement therapy in a feline model of MPS VI: Modification of enzyme structure and dose frequency. Pediatr Res 47:745-749.
81. Nousia-Arvanitakis S. (1999). Cystic fibrosis and the pancreas: recent scientific
advances. J Clin Gastroenterol 29:138-142. 82. Desnick R.J and Graboswski G.A., (1981). Advances in the treatment of inherited
diseases. Adv Hum Genet 11:281-369.
139
83. Herhsfield MS, Chaffe S. (1991). PEG-Enzyme replacement therapy for adenosine deaminase deficiency. In: Desnick R. (Ed). Treatment of genetic diseases. pp 169-182.
84. Takasaki S, Murray GJ, Furbis S, Brady RO, Barranger JA, Kobata A. (1984).
Structure of N-Asparagine-linked oligosaccharides units of human placental β-glucocerebrosidase J Biol Chem 250:10112-10117.
85. Horn IR, Birgit MM, Van Der Berg P, Van Der Metjden HP, Van Zonneveld AJ.
(2004). Lipoprotein receptor binding, cellular uptake and lysosomal delivery of fusion between the receptor associated protein (RAP) and alpha-L-iduronidase or acid alpha-glucosidase. J Biol Chem (in press manuscript M 402630200).
86. LeBowitz JH, Grubb JH, Maga JA, Schmiel DH, Vogler C, Sly WS. (2004).
Glycosylation-independient targeting enhances enzyme delivery to lysosomes and decreases storage in mucopolysaccharidosis type VII mice. Proc Natl Acad Sci USA 1001: 3083-3088.
87. Sears P, Chi-Huey W. (2001). Toward automated synthesis of oligosaccharides and
glycoproteins. Science 291:2344-2350. 88. Baneyx F. (1999). Recombinant Protein Expression in Escherichia coli. Curr Opin
Biotechnol 10:411-421. 89. Sorensen HP, Mortensen KK. (2004). Advanced genetic strategies for
recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol 115:113–128. 90. Sorensen HP, Mortensen KK. (2005). Soluble expression of recombinant proteins
in cytoplasm of Escherichia coli. Microbial Cell Factories 4:1. http://www. Microbialcellfactories.com/content/4/1/1.
91. Gellisen G. (2000). Heterologous Protein production in methylotrophic yeasts.
Appl Microbiol Biotechnol 54:441-450. 92. Romanos M. (1995). Advances in the use of Pichia Pastoris for high-level gene
expression. Curr Opin Biotechnol 6:527-533. 93. Cregg JM, Vedvick TS, Raschke WC. (1993). Recent advances in the expression
of foreign genes in Pichia Pastoris. Biotechnology 11:905-910. 94. Cereghino GP, Cregg JM. (1999). Applications of yeast in biotechnology:
Protein production and genetic analysis. Curr Opin Biotechnol 10:422-427. 95. Hieter P. (1998). The yeast genome and clinical genetics. Clin Genet 54:113-
116.
140
96. Cregg JM, Madden KR, Barringer KJ, Thill GP, Stillman CA. (1989). Funcional characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia Pastoris. Mol Cell Biol 9:1316-1323.
97. Higgins D, Cregg JM. (1998). Pichia Protocols. Humana Press. Totowa. 268 p. 98. Montesinos R, Nimtz M, Quintero O, García R, Falcón V, Cremata J. (1999).
Characterization of the oligosaccharides assembled on the Pichia Pastoris-expressed recombinant aspartic proteasa. Glycobiology 9: 037-1043.
99. Trimble RB, Atkinson PH, Tschopp JF, Townsend RR, Maley F.
(1991). Structure of oligosaccharides on Saccharomyces SUC2 Invertasa secreted by methylotrophic yeast Pichia Pastoris. J Biol Chem 266:22807-22817.
100. Clare JJ, Rayment FB, Ballantine SP, Sreekrishna K, Romanos M. (1991).
High-level expression of tetanus toxin fragment C in Pichia Pastoris strains containing multiple tandem integrations of the gene. Bio/Technology 9:455-460.
101. Sáenz H, Reyes E, Lareo, Barrera LA. (2002). Predicción computacional de las
estructuras secundaria y terciaria de la iduronato 2-sulfato sulfatasa (IDS). Modelo de su sitio activo. XXVII Congreso Nacional de Genética Humana. Veracruz, México. Noviembre 20-23.
102. Lareo L, Garzón K, Poutou R, Sáenz H, Barrera LA. (2001). Influencia de las
mutaciones puntuales en la predicción de la estructura secundaria de la IDS y su posible efecto sobre la severidad de la enfermedad de Hunter. III Congreso Latinoamericano de Errores Innatos del Metabolismo y Pesquisa Neonatal. Cartagena, Colombia. Octubre 21-24.
103. Parenti G, Meroni G, Ballabio A. (1997). The sulfatasa gene family. Curr Opin
Genetic Dev 7:386-391. 104. Bond CS, Clements PR, Ashby SJ, Collyer CA, Harrop S, Hopwood JJ, M.
Guss. (1997). Structure of human lysosomal sulfatase. Structure 5:277-289. 105. Smidt B, Selmer T, Ingendoh A, Von Figura K. (1995). A novel aminoacid
modification in sulfatases that is defective in múltiple sulfatase deficiency. Cell 82:271-278.
106. Dierks T, Lecca MR, Schotterhose P, Schmidt B, Von Figura K. (1999).
Sequence determinants directing conversion of cysteine to formylglycine in Eukaryotic sulfatases. The EMBO J 18:2084-2091.
107. Weaston A, Neufeld EF. (1982). Iduronate of human plasma. Methods Enzymol
83:573-578.
141
108. Archer IM, Harperp S and Wusteman FS. (1982). Multiple forms of iduronate 2-sulphate sulphatase in human tissues and body fluids. Biochim Biophys Acta 708:134-140.
109. Lissens W, Zenati A, Liebaers I. (1984). Polyclonal antibodies against iduronate
2-sulfatase from human urine. Biochim Biophys Acta 801:365-371. 110. Di Natale P, Ronsisville L. (1981). Identification and partial characterization of
two enzymes forms of iduronate sulfatase from human placenta. Biochim Biophys Acta 661:106-111.
111. Yutaka T, Fluharty A. Stevens R, Kihara H. (1982). Purification and some
properties of human liver iduronate sulfatase. J Biochem (Tokyo) 91:433-441. 112. Di Natale P, Daniele A. (1985). Iduronate sulfatase from placenta. Biochim
Biophys Acta 839:258-261. 113. Bielicki J, Freeman C, Clements PR, Hopwood JJ. (1990). Human liver iduronate
2-sulfatase. Purification, characterization and catalytic Properties. Biochem J 271:75-86.
114. http://www.brenda.uni-koeln. 115. Landázuri P, Delgado J, Torres A.L, Poutou R, Gunturiz M.L, Gomez L, Sáenz
H, Echeverri OY, Barrera LA. (2002). Expresión transiente de la iduronato 2-sulfato sulfatasa humana funcionalmente activa en Escherichia coli. Revista de Asociación Colombiana de Ciencias Biológicas 15:33-42
116. Landázuri P, Delgado J, Poutou R, Gunturiz ML, Gomez L, Sáenz H, Echeverri
OY, Barrera LA. (2002). Expresión of human iduronate sulfatase (hrIDS) in the yeast Pichia pastoris. Annual World Symposium on Lysosomal Storage Disorders. Baltimore, USA. Octubre 14-15.
117. Poutou RA, Cordoba H, Quevedo B, Landazuri P, Echeverry OY, Sáenz H, Vanegas
A, Acero J, Gonzalez A, Herrera J, Algesira N, Caicedo L, Barrera LA. (2005). Expresión de iduronate 2-sulfato sulfatasa humana recombinante (IDShr) en Pichia pastoris. Universitas Scientiarum 10:75-96.
118. Córdoba H, Poutou RA, Acero J, Echeverri OY, Sáenz H, Herrera J, Algecira N,
Barrera LA (2003). Estudio preliminar de la producción a baja escala de una sulfatasa humana recombinante (IDShr) en Pichia pastoris. IV Congreso Latinoamericano de Errores Innatos del Metabolismo y Pesquisa Neonatal. Iguazú, Argentina. Octubre 26-29.
119. Peña O, Sosa C, Sáenz H, Barrera LA. (2005). Producción de anticuerpos
policlonales contra la proteína iduronato 2-sulfato sulfatasa y desarrollo de un Sistema de Deteccion para la IDS humana Recombinante. Biomédica 25:181-184.
142
120. Sosa AC, Barrera LA (2004). Producción de anticuerpos policlonales (IgY) en huevo
de gallina contra la proteína IDS y su aplicación en el desarrollo de una técnica ELISA “sandwich”. Informe de actividades Programa Jóvenes Investigadores. COLCIENCIAS. Bogotá, Colombia.
121. Gahmberh CG, Tolvanen M. (196). Why mammalian cell surface protein are
glucoprotein. TIBS 21:308-311. 122. Lodish H. (2000). Molecular cell biology. W.H. Freeman and Co. 4th edition. New
York. 1084 p. 123. Hersovics A. (1999). Importance of glycosidases in mammalian glycoprotein
biosintesis. Biochim Byophys Acta. 1473:96-107. 124. Preuss D, Mulholland J, Kaiser CA, Orlean P. (1991). Structure of the yeast
endoplasmic reticulum: localization of ER proteins using inmunofluorescence and inmunoelectron microscopy. Yeast 7:891-911.
125. Trent G, Trimble R. (1999). Overview of N- and O-linked oligosaccharide structures
found in various yeast species. Biochim Byophys Acta 1426:227-237. 126. Parodi A. (2000). Role of N-oligosaccharide endoplasmic reticulum processing
reactions in glycoprotein folding and degradation. Biochem J 348:1-13. 127. Plemper R, Wolf D. (1999). Retrograde protein translocation: Eradication of
secretory proteins in health and disease. TIBS 24:266-270. 128. Robert DL, Weix DJ, Dahms N, Kim JP. (1998). Molecular basis of lysosomal
enzyme recognition: three-dimensional structure of the cation-dependent mannose-6-phosphate receptor. Cell 93:639-648.
129. Hersovics A, Orlean P. (1993). Glicoprotein biosynthesis in yeast. FASEB J 7:540-
550. 130. Helenius A, Aebi M. (2001). Intracellular functions of N-linked glycans. Science
291:2364-2369. 131. Imperiali B, O'Connor S. (1999). Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide
and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol 3:643-649. 132. Feinberg H, Park-Snyder S, Kolatar AR, Heise CT, Taylor ME. (2000). Structure of
C-type carbohydrate recognition domain from the macrophage mannose receptor. J Biol Chem 275:21539-21548.
133. Wells L, Vosseller K, Hart G. (2001). Glycosylation of nucleocytoplasmic proteins:
signal transduction and O-GlcNAc. Science 291:2376-2377.
143
134. Sagt CM, Kleizen B, Verwaal R, De Jong DMD, Muller WH, Visser C, Boonstra J,
Verkleij AJ, Verrips CT. (2000). Introduction of an N-glycosilation site increases secretion of heterologous proteins in yeast. Appl Env Microbiol 66:4940-4944.
135. Lareo LR. (2002). Estructura de macromoléculas. Curso para estudiantes de
postgrado. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá-Colombia.
136. http://www.ncbi.nlm.nih.gov 137. http://www.expasy.ch 138. Sternberg MJ. (1996). Protein structure prediction. IRL Press. Oxford. 298 p. 139. Lowry OH, Rosebrough, NJ, Randall, RJ. (1951). Protein measurement with folin
phenol reagent. J Biol Chem 193:265-275. 140. Vozny V, Keulemans JL, Van Diggelen OP. (2001). A fluorometric enzyme
assay for the diagnosis of MPS II (Hunter Disease). J Inherit Metab Dis 24: 675-680.
141. Hubner, U. 1993. Production of alkaline serine protease subtilisin calsbreg by
Bacillus licheniformis on complex medium in a stirred tank reactor. Appl Microbiol Biotechnol 40:182-188.
142. Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins uring the assembly of the
head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685. 143. Rosenbeg L. (1996). Protein analisis and purification. Birkhauser. Boston 434 p. 144. Córdoba H. (2004). Estudio de la producción a nivel de laboratorio de la enzima
iduronato 2-sulfato humana recombinante (IDShr) en Pichia pastoris. Tesis de Maestría. Facultad de Ingeniería Química. Universidad Nacional. Bogotá. 110 p.
145. Sreenkrishna K, Kropp K. (1996). Pichia Pastoris. In: Nonconventional yeast in
biotechnology. A handbook. Wolf K. (Ed). Springer. Berlín. pp. 203-250. 146. Millard C, McHenry L. (1990). Preparation of extracts from prokaryotes. In:
Guide to protein purification. Methods Enzymol 82: 147-148. 147. AmershamBiosciences (2003). GST fusion system handbook. 109 p. 148. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. (1989). Molecular cloning: A laboratory
manual. 2th Ed. Cold Spring Harbor Laboratory press. New York. pp 1-110.
144
149. Aususbel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K. (1994). Short protocols in molecular biology. Fourth Edition. Chapter 10: Analysis of proteins. Wiley Inc. New York. 223 p.
150. Promega (2002). Protocols and aplications on molecular biology. Thiird Edititon.
404 p. 151. Poutou R A, Amador E, Candelario M. (1994). Banco de células primario
(BCP): Caracterización y papel en la producción de proteínas recombinantes. Biotechnol Aplic 11:55-59
152. Gasteiger E, Hoogland C, Gattiker A, Duvaud S, Wilkins MR, Appel RD, Bairoch
A. (2005). Protein identification and analysis tools on the ExPASy Server. In: John M. Walker (ed): The proteomics protocols handbook. Humana Press. pp 571-607.
153. Bjellqvist B, Hughes GJ, Pasquali Ch, Paquet N, Ravier F, Sanchez J, Frutiger S,
Hochstrasser DF. (1993). The focusing positions of polypeptides in immobilized pH gradients can be predicted from their amino acid sequences. Electrophoresis 14:1023-1031.
154. Blom N, Gammeltoft S, Brunak S. (1999). Sequence-and structure-based
prediction of eukaryotic protein phosphorylation sites. J Mol Biol: 294:1351-1362. 155. Julenius K, Molgaard, Gupta R, Brunak S. (2005). Prediction, conservation
analysis and structural characterization of mammalian mucin-type O-glycosylation sites. Glycobiology 15:153-164.
156. Blon N, Ponten T, Gupta R, Brunak S. (2004). Prediction of post-translational
glycosilation and phosphorylation of proteins from aminoacid sequence. Proteomics 4:1633-49.
157. Frith MC, Spoge JL, Hansen V, Weng Z. (2002). Statiscal significance of clusters
of motifs represented by position specific scoring matrices in nucleotide Sequences. Nucleic Acids Research 30:3214-24.
158. Hopp, TP, Woods, KR. (1981). Prediction of protein antigenic determinants from
amino acid sequences. Proc Natl Acad Sci USA 86:152-156. 159. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ.
(1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search program. Nucleic Acids Research 25:3389-3402.
160. Garnier J, Gibrat JF, Robson B, Doolittle RF. (1996). GOR secondary structure
prediction method version IV. Methods Enzymol 266:540-553.
145
161. Cuff JA, Clamp ME, Siddiqui AS, Finlay M, Barton G J. (1998). Jpred: A consensus secondary structure prediction server. Bioinformatics 14:892-893.
162. Kneller DG, Cohen FE, Langridge R. (1990). Improvements in protein secondary
structure prediction by an enhanced neural network. J Mol Biol 214:171-182. 163. Jones DT. (1999). Protein secondary structure prediction based on position-
specific scoring matrices. J Mol Biol 292:195-202. 164. Pollastri G, Przybylski D, Rost B, Baldi P. (2002). Improving the prediction of
protein secondary structure in three and eight classes using recurrent neural networks and profiles. Proteins 47:228-235.
165. Shindyalov IN, Bourne PE. (2000). Improving alignments in HM protocol with
intermediate sequences. In: Forth meeting on the critical assessment of techniques for protein structure prediction. p. A-92.
166. Guez N, Peitisch MC. (1997). SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An
environment for comparative protein modeling. Electrophoresis 18:2714-2723. 167. Combet C, Jambon M, Deléage G, Geourjon C. (2002). Geno3D: Automatic
comparative molecular modelling of protein. Bioinformatics 18:213-214. 168. Lambert C, Leonard N, De Bolle X, Depiereux E. (2002). ESyPred3D: Prediction
of proteins 3D structures. Bioinformatics 18:1250-1256. 169. Lund O, Nielsen M, Lundegaard C, Worning P. (2002). CPHmodels 2.0: X3M a
computer program to extract 3D models. (Abstract). CASP5 conference A 102. 170. Muñoz V, Serrano L. (1994). Elucidating the folding problem of a-helical
peptides using empirical parameters, II. Helix macrodipole effects and rational modification of the helical content of natural peptides. J Mol Biol 245: 275-296.
171. Sayle RA, Milner-White EJ. (1995). RasMol: Biomolecular graphics for all.
Trends in Biochem Sci 20:374-376. 172. Waldow A, Schmidt B, Dierks T, von Bulow R, von Figura K. (1999). Amino
acids residues forming the active site of arylsulfatase A. J Biol Chem 274: 12284-12288.
173. Web Lab, Moleculas Simulation. (2000). Web Lab Viewer Pro. Getting Starting. Ca,
USA. 174. Kjeldsen T, Frost Pettersson A, Hach M. (1999). The Role of Leaders in
Intracellular Transport and Secretion of the Insulin Precursor in the Yeast Saccharomyces cerevisiae. J Biotechnol 75:195-208
146
175. Sinha J, Plantz BA, Inam M, Meagher MM. (2005). Causes of proteolytic degradation of secreted recombinant proteins produced in methylotropic yeast Pichia pastoris: Case study with recombinant ovine interferon-t. Biotechnol Bioeng 59:102-112.
176. Van den Hazel B, Kielland-Brand MC, Winther JR. (1996). Review: Biosynthesis
and function of yeast vacuolar proteases. Yeast 12:1-16. 177. Voet D, Voet JG. (2004). Biochemistry. 3th ed. Wiley international edition. USA. pp
66-67. 178. Chothia C, Lesk A M. (1986). The relation between the divergence of sequence and
structure in proteins. EMBO J 5:823-826. 179. Baker D, Sali A. (2001). Protein Structure Prediction and Structural Genomics.
Science 294: 93-96. 180. Murasugi A, Tohma-Aiba Y. (2001). Comparison of Three Signals for Secretory
Expresión of Recombinant Human Midkine in Pichia pastoris. Biosc Biotechnol Biochem 65:2291-2293.
181. Murasugi A, Tohma-Aiba Y. (2003). Production of Native Recombinant Human
Midkine in the Yeast, Pichia pastoris. Prot Expres Purific 27:244-252. 182. Pham C, Thomas D, Mercer J, Ley T. (1998). Production of Fully Active
Recombinant Murine Granzyme B in Yeast. J Biol Chem 273 (16):1629-1633. 183. Peña OM, Reyes E, Barrera LA (2003). Análisis computacional de la N-acetil-
galactosamina-6-sulfato sulfatasa (GALNS) y quince mutaciones causantes del síndrome de Morquio-A. IV Congreso Latinoamericano de Errores Innatos del Metabolismo y Pesquisa Neonatal. Iguazú, Argentina. Octubre 26-29.
184. Weyand M, Schlichting I, Herde P, Marabotti A, Mozzarelli A. (2002). Crystal
structure of the beta Ser178--> Pro mutant of tryptophan synthase. A "knock-out" allosteric enzyme. J Biol Chem 277(12):10653-60.
185. Lee ES, Moon HK, Park YH, Garbern J, Hobson GM. (2004). A case of complicated spastic paraplegia 2 due to a point mutation in the proteolipid protein 1 gene. J Neurol Sci 224(1-2):83-7.
186. Loo TW, Clarke DM. (1993). Functional consequences of proline mutations in
the predicted transmembrane domain of P-glycoprotein. J Biol Chem 268(5):3143-9.
187. Pagano L, Salzano AM, Carbone V, Iannelli D, Viola A, Pollio F, Prossomariti L,
David O, Ricco G, Pucci P. (2004). Hb Cardarelli [beta86(F2)Ala-->Pro]: a new
147
unstable and hyperaffine variant in association with beta(+) thalassemia. Hemoglobin 28(2):103-15.
188. Yang M, Lei M, Huo S. (2003). Why is Leu55-->Pro55 transthyretin variant the
most amyloidogenic: insights from molecular dynamics simulations of transthyretin monomers. Protein Sci 12(6):1222-31.