Post on 07-Jan-2015
Hospital San Juan de Dios
Microbiologia I semestre 2008
Lang, Rodríguez-Vargas, Rezvani
Técnicas Moleculares
Características:
Altamente sensibles y específicas.
Fáciles.
Rápidas.
Técnicas Utilizadas
PCR:
1-Hot Start 6-RT-PCR 1 1-Multiplex
2-Touch Down 7-PCR-SSP 12-QPCR
3-PCR larga 8-PCR –SSO 13-Real Time
4-in situ PCR 9-PCR-ARMS
5-PCR anidada 10-PCR-RFLP
Genotipaje
Secuenciación
Importancia Clínica De Las Técnicas Moleculares
1) Permite la extracción de material genético (ARN-ADN) de la muestra incógnita para su posterior amplificación detección y cuantificación de la misma.
2) Se pueden detectar mutaciones en el material genético extraído permitiendo analizar la resistencia a medicamentos presentes en los genes virales relevantes.
.
3)Se identifica si hay fallas terapéutica por lo que se hace cambio de esquema de tratamiento a otros medicamentos con un mayor juicio.
4)El tratamiento estaría dirigido más específicamente al conocer su genotipo.
Importancia Clínica De Las Técnicas Moleculares
Rxn cadena de la Polimerasa
Técnica que permite replicar entre cientos de miles y millones de veces, pequeñas cantidades de ADN en el transcurrir de pocas horas in vitro.
Ha permitido el aislamiento y caracterización de decenas de miles de genes de microrganismos, animales y plantas
Historia
1955 : Se descubre ADN polimerasa ( Arthur Komberg).
En 1986, Kary Mullis, un investigador de la Corporación Cetus, inventó un método para lograr la multiplicación in vitro de fragmentos definidos de ADN.
Su uso se extendió rápidamente a miles de laboratorios.
Se trata del PCR: Polymerase Chain Reaction.
No! Historia no!
Polimerasas
Existen varios tipos de polimerasas α, β, γ, δ
Leen de 51 a 31
Escriben de 31 a 51
Para el PCR se utiliza la Taq ADN polimerasa, proviene de arquibacteria Thermus Aquaticus.
Receta para el PCR.
ADN a amplificar.
Primers que se unan a este ADN Los cuatro nucleotidos: A, C, G, T Polymerasa del ADN
Nota: Si es un ARN virus se agrega una retrotranscripatasa antes del PCR.
Pasos del PCR:
La muestra se calienta hasta separar las dos cadenas que constituyen el ADN: desnaturalización.
Luego se agregan segmentos de ADN de cadena simple, sintetizados en el laboratorio y diseñados de manera tal que permiten definir los límites del tramo de ADN que se desea replicar: “iniciadores o primers”
Pasos del PCR:
La temperatura se reduce para permitir el "apareamiento“ con los primers.
Extensión: Luego, se utiliza la ADN polimerasa, que activada por la secuencia codificadora de inicio que son ahora los primers, continua replicando el segmento de ADN al cual se unió el primer. Se trabaja a la temperatura optima de la enzima.
Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalización, apareamiento, extensión) el tramo de ADN elegido se ha duplicado.
Se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo..
50
60
70
80
90
100
TA
Doble Cadena de ADN
El principio de la PCR
50
60
70
80
90
100
94ºC
Denaturation
Desnaturalización.
50
60
70
80
90
100
55°C
Apareamiento.
Unión de los Primers
Extensión.
50-72ºC
Pol
Pol
Extensión
50
60
70
80
90
100
ADN Duplicado
50
60
70
80
90
100
50-72°C
Todo queda duplicado
Y si es ARN?
En este caso (VIH-1 y VIH-2) se utliza una retrotranscriptasa que forma un ADNc a partir del ARN
PCR en Costa Rica
Carga Viral
Numero de copias de ARN o ADN que se encuentran en una muestra de plasma.
Se utiliza para: VIH Hepatitis B y C Citomegalovirus
Se utiliza la técnica de PCR Real time
Limites de Cuantificación
Se busca que la carga viral, de los valores mínimos posibles Ej:
VIH 40-10000 copias Para valores de menos de 40 el tratamiento esta atacando
efectivamente al virus por lo que es indetectable a la prueba Valores altos representan resistencia del virus al fármaco o
falta de tratamiento
PCR en Tiempo Real
La PCR en Tiempo Real permite el monitoreo del producto recién generado durante el proceso de la PCR a través de nucleótidos marcados con fluorescencia.
El cálculo de los resultados es automático e inmediato.
PCR Real time
A cada copia de ADN creada por el PCR, la polimerasa la marca con fluorescencia
La maquina mide la cantidad de ADN por esta fluorescencia
Genotipaje
Medida cualitativa del virus Lee la secuencia completa del virus base
por base Identifica mutaciones puntuales y analiza la
resistencia del fármaco a esa mutación Semejante al la farmacogenómica
Detección VIH
PCR y SSRs
PCR y SSRs
El equipo!
Muchas Gracias