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IDENTIFICACIÓN DE MICROSATÉLITES POLIMÓRFICOS POR AMPLIFICACIÓN
CRUZADA EN ANADARA SIMILIS (MOLLUSCA: ARCIDAE)
Julián Andrés Gil Saavedra
Universidad del Valle, Apartado Áereo 25360, Cali, Colombia
Correo electrónico: julian.gil.saavedra@correounivalle.edu.co
Jaime Cantera Kintz (Director)
Universidad del Valle, Apartado Áereo 25360, Cali, Colombia.
Correo electrónico: jaime.cantera@correounivalle.edu.co
RESUMEN
Los microsatélites son marcadores moleculares usados con frecuencia en estudios de genética de poblaciones,
aunque su desarrollo es un proceso costoso y prolongado. Un método que permite ahorrar tiempo y dinero es la
amplificación cruzada, que consiste en amplificar el ADN de una especie determinada (especie objetivo) utilizando
cebadores diseñados para una especie cercana (especie fuente). Usando este método se evaluó en Anadara similis el
contenido informativo de 24 loci microsatélites, desarrollados en Anadara tuberculosa. Para ello, se estandarizó la
extracción de ADN de A. similis y se probaron diferentes protocolos de amplificación en PCR. Los resultados fueron
observados en geles de poliacrilamida, analizados con el software UVIpro versión 12.4 y GenAlEx 6.5. Cinco
cebadores resultaron adecuados para amplificar consistentemente microsatélites polimórficos en A. similis. Los loci
polimórficos mostraron un promedio de 22,8 alelos por locus, una heterocigosidad esperada (He) entre 0,855 y
0,964, una heterocigosidad observada (Ho) entre 0,346 y 0,800. Solo se encontró un locus en Equilibrio Hardy-
Weinberg (EHW). Estos resultados muestran la utilidad de la amplificación cruzada con estos cebadores para futuros
estudios de genética poblacional en esta especie.
Palabras clave: Anadara, microsatélite, diversidad genética.
ABSTRACT
Microsatellites are molecular markers frequently used in population genetic studies despite of the high cost, and long
time involved in developing them. One method to save money and time is cross-amplification, which is the DNA
amplification of the target species using primers developed for a closely related species. Using this method, the
information content of 24 microsatellite loci developed from Anadara tuberculosa to amplify microsatellite regions
of Anadara similis was evaluated. To that end, DNA extraction was standardized in A. similis samples and different
PCR amplification protocols were tested. Results were observed in polyacrylamide gels, analyzed with software
UVIpro version 12.4 and GenAlEx 6.5. Five primers showed consistent amplification and were polymorphic in A.
similis. The polymorphic loci showed an average of 22, 8 alleles per locus, an expected heterozygosis (He) between
0,855 and 0,964, an observed heterozygosis (Ho) between 0,346 and 0,800. Only found one locus in Hardy-
Weinberg Equilibrium (HWE).These results point out the usefulness of cross-amplification with these primers for
future population genetics studies in this species.
Keywords: Anadara, microsatellite, genetic diversity.
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INTRODUCCIÓN
Los marcadores moleculares corresponden a
una amplia gama de herramientas para
análisis directo e indirecto del ácido
desoxirribonucleico (ADN), las cuales han
sido implementadas en las últimas décadas,
generando desarrollo de la genómica
estructural (Astorga, 2008). Estos
marcadores permiten visualizar o indicar la
presencia de variantes alélicas, producto de
algún tipo de mutación establecida en las
poblaciones a través del tiempo evolutivo;
dicha variación genética detectada es
conocida como polimorfismo y es la que
permite separar grupos, poblaciones, cepas,
especies o grupos taxonómicos mayores,
identificar las poblaciones fuentes, estimar
divergencias poblacionales e identificar el
flujo génico entre bancos naturales o
semilleros. La aplicación de estas
herramientas ha impactado diversos ámbitos
de la biología incluyendo la biología marina
y la acuicultura, la cual ha sido revisada por
diferentes autores (Liu & Cordes 2004,
Wilson et al. 2005, Saavedra & Bachere
2006, Dupont et al. 2007). Para efectuar este
tipo de estudios en especies de las cuales no
se conoce su genoma, se han empleado
diversos marcadores moleculares
dominantes como los RAPDs, RFLP y la
secuenciación de regiones altamente
variables, sin embargo, los tipos de
marcadores más adecuados debido al alto
nivel de variabilidad detectada corresponden
a los AFLP y microsatélites (Astorga 2008).
Los microsatélites, SSR (Simple sequence
repeats) o STR (Short Tandem Repeats)
consisten en unidades de 2 a 5 nucleótidos
repetidas en tándem. Las regiones
adyacentes a estas zonas generalmente son
conservadas, por lo cual es posible diseñar
cebadores que permitan obtener miles de
copias de estas zonas mediante
amplificación por PCR (Polymerase Chain
Reaction). Los resultados de este análisis
pueden ser visualizados mediante gel de
agarosa de alta resolución o mediante lectura
automatizada en un secuenciador de ADN.
El polimorfismo de los microsatélites se basa
en la variación en el número de repeticiones
en tándem de los alelos de un locus. Estos
han llegado a ser muy utilizados por su alta
abundancia en el genoma, alta variabilidad
debida a su elevado número de alelos por
locus y por su forma de herencia
codominante, lo que permite aplicar una
variedad de análisis estadísticos
poblacionales (Astorga 2008). Aunque los
microsatélites se usan habitualmente en
estudios de genética de poblaciones su
desarrollo es un proceso caro y que requiere
mucho tiempo. Una estrategia que permite
ahorrar tiempo y dinero es la llamada
amplificación cruzada que consiste en
amplificar el ADN de una especie
determinada (especie objetivo) usando
cebadores que han sido diseñados para una
especie diferente (especie fuente) (López-
Vinyallonga, et al. 2011). Últimamente, y
cada vez con mayor frecuencia, se intenta la
amplificación cruzada con cebadores de una
especie en otra distinta, obteniéndose en
algunos casos resultados positivos
(Schlötterer et al. 1991, Kijas et al. 1995,
Kayser et al. 1996, González 2003, Strecker
2006, Chan 2007, Chang et al. 2008, Küpper
et al. 2008, Lin et al.2008).
Esta investigación se centra, en la
identificación de polimorfismos en Anadara
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similis (Adams 1852) (especie objetivo), a
partir de amplificación cruzada de
microsatélites de A. tuberculosa (Sowerby
1833) (especie fuente) los cuales fueron
diseñados previamente por Quesada et al.
2014. Estos moluscos bivalvos poseen una
amplia distribución en la costa del Pacífico
Oriental. A. similis se distribuye desde
Corinto en Nicaragua hasta Tumbes en Perú
(Keen 1971), se encuentra enterrada
generalmente dentro del lodo de manglares,
sobre fondos blandos de la zona sublitoral,
entre 15 y 50 cm de profundidad (Fisher et
al. 1995). El sustrato apropiado para su
desarrollo normal es limo-arcilloso (Mora
1990).
En Colombia, esta especie se encuentra en
los bosques de manglar de la costa Pacífica
que comprende alrededor de 35 municipios
situados en los departamentos de Chocó,
Valle del Cauca, Cauca y Nariño (Borda &
Cruz 2004). En estas zonas estos bivalvos
son los más explotados y de ellos se
benefician las comunidades que habitan esta
región. Sin embargo, actualmente el recurso
además de ser utilizado para consumo y
comercio local, está siendo comercializado
al vecino país del Ecuador, lo que ha
aumentado sus niveles de explotación
llevándola a ser incluida en el Libro Rojo de
Invertebrados Marinos de Colombia en
categoría de vulnerable (Ardila et al. 2002),
por la alta probabilidad de sobreexplotación.
La información existente en Colombia sobre
el estado actual de A. similis es reducida.
Además, de los pocos artículos relacionados
con la piangua, ninguno investiga sobre
aspectos genéticos de la especie,
encontrándose solamente estudios sobre
aspectos biológicos (Borrero 1982, Herrán
1983, Lucero 2007), aspectos económicos y
ecológicos (Squires et al. 1975, Betancourt
& Cantera 1978, Cantera 1978, Rodríguez
1985, Prahl et al. 1990) e información
pesquera del recurso (MacKenzie 2001,
Borda & Cruz 2004, Silva & Carrillo 2004).
Dada la ausencia actual de datos e
investigaciones genéticas relacionadas con la
piangua, la creciente explotación y la acción
antrópica en la costa pacífica colombiana,
resulta de gran pertinencia efectuar estudios
sobre la genética de A. similis en la costa
Pacífica colombiana, como una herramienta
que amplíe el conocimiento sobre esta
especie para futuros estudios de conectividad
y diferenciación genética entre poblaciones.
Esta información tendrá un gran valor en
posteriores estrategias de recuperación de las
poblaciones silvestres que impliquen la
preservación del proceso natural de
repoblamiento mediado por la dispersión
larval y el establecimiento de medidas que
garanticen la conservación y uso sostenible
de estas especies (Cantera & Lucero 2007).
MÉTODOS
1. Zona de estudio, colecta y
almacenamiento.
Las muestras de tejido de A. similis para este
estudio corresponden al pie del molusco y
provienen de individuos colectados durante
la investigación titulada “Potencial
productivo de las poblaciones naturales de
la piangua A. tuberculosa y A. similis dentro
de una perspectiva espacio-temporal en la
costa Pacífica colombiana”, realizada por
INVEMAR-UNIVALLE-WWF-UEASPNN-
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ASCONAR-COLCIENCIAS. La colecta se
efectuó entre febrero-julio de 2009 y se
empleó el método manual tradicional de
“concheo” a lo largo de transectos de 50 m²
(10x5 m) desde la línea de marea baja, por
triplicado, en cuya área se extrajeron todos
los individuos encontrados por 2 mujeres
“piangüeras” en una hora durante la marea
baja, haciendo un barrido del área hasta una
profundidad de 30 cm.
Figura 1. Zona de estudio en Costa Pacífica
Colombiana (CPC). De norte a sur:
Buenaventura, Juanchillo, Mosquera y
Nerete.
Las muestras fueron depositadas en el Banco
de Tejidos del Instituto de Investigación de
Recursos Biológicos Alexander von
Humboldt (IAvH), Palmira-Valle,
preservadas en etanol 96% y solución
tampón de colecta (Tris HCL 0,1M, EDTA
0,1M, NaCl 0,01M, SDS 0,5%) a -20ºC. De
estas, se escogieron aleatoriamente muestras
de individuos pertenecientes a cuatro
localidades de la Costa Pacífica Colombiana
(Buenaventura, Mosquera, Nerete,
Juanchillo) hasta obtener un total de 30
individuos (Fig. 1).
2. Extracción y cuantificación del ADN
total
Se realizó la extracción de ADN a partir de
25 mg del pie del molusco empleando dos
protocolos: CTAB y kit DNeasy Blood &
Tissue (QIAGEN Inc., California), para
establecer cuál ofrecía un mejor rendimiento
en términos de calidad, cantidad, tiempo y
costos. La concentración de ADN extraído
se estimó por medio del espectrofotómetro
Nanodrop 2000 (Termo Scientific, EE.UU.)
a una longitud de onda de 260 nm (debido a
que las bases púricas y pirimidínicas del
ADN tienen la propiedad de absorber la luz
UV a esta longitud de onda) y comparando
con un blanco que fue en este caso agua
destilada. El protocolo de extracción
finalmente utilizado en este trabajo fue el
método de extracción CTAB, con el cual se
obtuvieron concentraciones de ADN entre
300 y 800 ng/µL.
3. Amplificación por PCR usando
microsatélites cruzados.
Se probaron 24 pares de cebadores aislados
por Quesada et al. (2014), a partir de una
5
librería genómica de A. tuberculosa. Las
reacciones de amplificación fueron
programadas en un termociclador CFX96
Touch™ (BioRad). Se estandarizó partiendo
del protocolo de PCR de Sekino et al.
(2010). Mediante varios ensayos se buscó
optimizar la PCR para cada par de
cebadores, variando lo siguiente: (i)
concentración final de componentes del
premix (dNTPs, MgCl2, cebador, Taq
polimerasa, ADN), (ii) la temperatura de
hibridación o anillamiento de los cebadores.
Para el caso (i), se probaron varios
volúmenes y concentraciones de los
componentes hasta obtener resultados
óptimos (Tabla 1).
Tabla 1. Volúmenes y concentraciones de la
solución de amplificación o Premix de
reacción óptimas para amplificación de los
loci microsatélites: STR10, STR13, STR15,
STR19, STR24.
En el caso (ii), se utilizaron diferentes
protocolos con gradientes de temperatura y
“touchdown” hasta escoger para cada
cebador, temperaturas de alineamiento
óptimas (Tabla 1.1). Para monitorear
posibles problemas por contaminación en las
corridas de amplificación se incluyeron
controles negativos. El proceso de
comprobación de amplificación se realizó
por electroforesis en geles de poliacrilamida
al 6.5% con un marcador de peso de 25 pb
(Bioline), a 150 voltios de pre-corrida por 15
minutos y 300 voltios de corrida por 1 hora y
40 minutos. Cada gel se llevó a un volumen
final de 7µL (2µL de buffer + 5µL de ADN
amplificado). Los geles fueron teñidos con
nitrato de plata y se aplicó una solución
reveladora para visualizar los patrones de
bandeo.
La amplificación cruzada fue considerada
exitosa sólo cuando se generaron fragmentos
claros y específicos luego de varias
reacciones de PCR independientes, y dentro
del intervalo de 100 a 500 pares de bases,
que eran los tamaños de los fragmentos
esperados a partir del diseño de los
iniciadores (Fig. 2).
Figura 2. Ejemplo de patrón de bandeo que
se obtuvo en las amplificaciones cruzadas
exitosas vistas en geles de poliacrilamida al
(imagen modificada a blanco y negro). E=
escalera alélica, MP= Marcador de peso.
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Tabla 1.1 Condiciones óptimas de
Amplificación en PCR para los loci
microsatélites: STR10, STR13, STR15,
STR19, STR24.
4. Identificación del nivel de polimorfismo
Una vez se estandarizaron las condiciones de
PCR y se separaron los loci microsatélite
que mostraron una amplificación exitosa, se
estimó el tamaño de los alelos a partir de las
fotografías de los geles utilizando el
software UVIPro versión 12.4.
5. Análisis Genéticos
Para realizar los análisis genéticos, se
construyó una matriz de datos con las 30
muestras escogidas de las poblaciones de A.
similis de las Costa Pacífica Colombiana en
estudio y los loci microsatélites que
amplificaron exitosamente. La matriz de
datos contenía la información de los patrones
de bandas obtenidos a partir del tamaño o
longitud del fragmento en pares de bases
(pb), asignándose a cada individuo dos
valores por locus, dependiendo de su
genotipo (homocigoto o heterocigoto).
Cuando ambos valores por locus fueron
similares en tamaño, se tomó como
homocigoto y para valores diferentes como
heterocigotos. Luego se realizaron los
análisis de los datos habilitando los macros
de GenAlex 6.2 en Microsoft Excel 2010 y
se modificó la matriz original para poder
realizar los cálculos como se requiere con el
primer programa (Peakall y Smouse, 2006).
Se estimó el número de alelos, la frecuencia
alélica por locus, la heterocigosidad esperada
(He) y observada (Ho), el numero efectivo
de la población (Ne). Se probó el equilibrio
Hardy-Weinberg, y se llevó a cabo una
estimación del flujo génico entre
poblaciones con el método de alelos
privados y alelos comunes (Barton & Slatkin
1986, Slatkin 1994) (Fig. 3).
RESULTADOS
De los 24 pares de cebadores evaluados, sólo
cinco permitieron una amplificación óptima:
STR10, STR13, STR15, STR19, STR24.
Estos cebadores fueron adecuados para que
la ADN polimerasa amplificara regiones
polimórficas (i.e. aparición de varios alelos o
bandas) en las muestras bajo estudio (Tabla
2). Los 19 cebadores restantes se descartaron
porque simplemente no amplificaron en
ninguno o en la mayoría de los individuos,
otros generaron un patrón de bandas
nucleotídicas que no permitió su lectura y no
se logró eliminar totalmente las bandas
inespecíficas.
A partir de las corridas electroforéticas de
los 30 individuos y luego de determinar cada
uno de los genotipos de los 5 microsatélites
con el software correspondiente, se obtuvo
un rango alélico entre 107-504 pb y un
promedio de 22,8 alelos/locus (Tabla 3 y 4).
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Tabla 2. Secuencias de cebadores y motivos repetidos de 24 loci microsatélites probados para
amplificación cruzada en A. similis. En color gris, aparecen señalados los loci que amplificaron
exitosamente, siendo polimórficos en los individuos analizados.
Loci Motivo repetido Forward 5'-3' Reverse 5'-3' Resultado
STR1 ATTTT(70) TTCAGAGCAAAGATCGAAATCC AAACAGTTAATTGTGATACATCAGTACG amplificación
nula
STR2 ATCT(60) TCCTAAGTTTATGTGAAAGATGGG AGAATAAACCAAGGATCGTATGC amplificación
nula
STR3 ATAC(52) TTTCATAATTAAAGACAGGAAACAGG CTTGAGAAATATTATCCTATTTAAAGCCG amplificación
nula
STR4 AAAT(52) CCAACGTAACAGAAACAAGCG AAGATTCGAAACCAGACACCG amplificación
nula
STR5 AAGT(52) TCACGCAGTCACACAACACC ATACCACTTTAATAAGAGCCTTACTTGC Bandas
inespecíficas
STR6 ATCT(52) TCAGGGATTCATATTAAGTCAAATGG CTGATAACATCGAGGTCGCC amplificación
nula
STR7 AAAT(48) TGGGTATTTAGAAGGCAACCG GTGTACTTGAATCATATCATGAAACCG amplificación
nula
STR8 AAAT(48) TTAGGATGTTATCAGTCTCTTATTCACG AAACTTACCATTTCTGGGTGGC amplificación
nula
STR9 AAAT(48) GCCACCTAAAGTGATCTAGCCG AGGATATTTATTGTTCAGGTGGTCC amplificación
nula
STR10 ATCT(48) TGTCTGTGAATGGCCAAAGC CAACAAATATGGCACTAATAAATCACC Polimórfico
STR11 ATCT(48) AAACTCAGGCGTGTGATGG AAGTAAATATTGTACCTTCGTAAAGAGG amplificación
nula
STR12 AGTG(48) CGGTTGGTCGGTCAGTCG GGGCTTTCCTCTGAGCTGC amplificación
nula
STR13 AATC(48) TTCACTCATCAAACAGTTGGC AAACTCCAGACTGAAGACCCG Polimórfico
STR14 ATCT(48) TCTCGAAATGTCAAATACAGGG CAATTCTAATATTCTTCATTGAGAAGGG amplificación
nula
STR15 ATCT(48) TTTCGGAAGGTTAACGACAGG CGCCATACCGAGAGATAGACG Polimórfico
STR16 ATCT(48) AAGTGGTATGACCTTGACTGTAGACC TTGAAGGCGCTCATACATCC Bandas
inespecíficas
STR17 ATCT(48) AAACGGTTAACCTTATAGACAGGC AAGATTCTTTCACTTATACCGAGGG amplificación
nula
STR18 ATCT(48) GGAGTAATGGTGTTTATCGCCG TCCTACCGTACCATCCCAGG Bandas
inespecíficas
STR19 AAAT(48) GCAAGCTTAGAAGACCTAAGCCC AGAAAGCACAGAAGAAACCTGC Polimórfico
STR20 ATCT(44) GGTTTGGTCTTTCCAGTGATCC GGCAACTAAGAACGGGAAACG amplificación
nula
STR21 ATCT(44) TTGACGATGGAGAACATTTGC GGTTGTTGTCCTGTGTGTCACC amplificación
nula
STR22 ATCT(44) GGAAGATTCCATAGTGCCCG CAAGCGTTTGATACCATCCC amplificación
nula
STR23 AAAT(44) TGTATCTGTGCTCTTACTTCTGATAGGG TGTCCACCCTTCAAACATGG Bandas
inespecíficas
STR24 ATAC(44) GCATTAATCCACCATTACATTAAACG GGTACTAATGCCGGACATGC Polimórfico
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Tabla 3. Análisis de amplificación cruzada de cinco loci microsatélites en A. similis. Ta =
Temperatura de alineamiento; N = Número de muestras; Na = Número de alelos; Ae= Número
efectivo de alelos, Ho= Heterocigosidad observada; He = Heterocigosidad esperada, HWE =
Equilibrio Hardy-Weinberg, p: valor de significancia.
Loci
Rango
alélico (pb)
Ta
(°C) N Na Ae Ho He F
HWE
(p < 0.05)
STR10 129-361 58 26 32 28,167 0,385 0,964 0,601 No
STR13 287-504 58 30 21 8,182 0,800 0,878 0,089 Equilibrio
STR15 107-197 58 25 21 17,123 0,360 0,942 0,618 No
STR19 207-329 58 28 14 6,877 0,536 0,855 0,373 No
STR24 193-268 58 26 26 14,857 0,346 0,933 0,629 No
Total 114
Figura 3. Patrones alélicos y valores
promedio entre poblaciones (Na=Número de
alelos; Ne=Número efectivo,
He=Heterocigosidad esperada).
Los cebadores STR10 y STR24 presentaron
un número alto de alelos, además de tener
una secuencia repetida perfecta, por lo que
pueden ser considerados como buenos
marcadores en estudios de genética de
poblaciones de esta especie. En todos los
loci bajo estudio, la Heterocigosidad
esperada (He) fue mayor que la observada
(Ho), lo que muestra un déficit de
heterocigotos en todos los loci que se
amplificaron exitosamente (Tabla 3). Lo
anterior puede ser explicado por la presencia
de alelos nulos. Los alelos nulos se presentan
cuando existe una mutación en la secuencia
nucleotídica adyacente a los microsatélites,
impidiendo que los cebadores se unan a la
secuencia molde (Chapuis & Estoup 2007).
A diferencia del alelo ausente la ocurrencia
del alelo nulo no se da al azar, lo que se
obtiene es una falta de consistencia en la
amplificación. A partir de los loci
microsatélites, se compararon los análisis
genéticos respectivos en todas las
poblaciones bajo estudio (Fig. 1).
9
Tabla 4. Número de muestras escogidas aleatoriamente para cada una de las 4 poblaciones en
estudio y los respectivos alelos encontrados para cada loci microsatélite que amplificaron con
éxito. Los valores iguales en cada locus para cada muestra representan los individuos
homocigotos para dicho locus, mientras que los valores diferentes representan a los
heterocigotos. Total muestras N= 30 (AL= Alelo, STR= loci).
STR15 STR19 STR24 STR10 STR13
Muestra Población AL#1 AL#2 AL#1 AL#2 AL#1 AL#2 AL#1 AL#2 AL#1 AL#2
1 BUENAVENTURA 131 131 0 0 200 244 284 320 356 363
2 BUENAVENTURA 181 181 308 308 260 260 309 309 356 367
3 MOSQUERA 0 0 304 304 260 260 0 0 363 371
4 MOSQUERA 135 148 221 206 212 212 236 236 363 375
5 MOSQUERA 0 0 312 329 255 255 0 0 356 386
6 MOSQUERA 161 161 321 325 212 204 0 0 356 356
7 MOSQUERA 127 127 321 321 208 208 255 255 352 367
8 MOSQUERA 139 153 329 329 0 0 284 284 356 378
9 MOSQUERA 197 197 304 304 223 223 294 294 367 386
10 MOSQUERA 165 194 321 325 208 208 297 361 356 363
11 MOSQUERA 162 158 227 214 248 256 182 248 371 405
12 NERETE 131 139 321 321 206 206 190 272 352 390
13 NERETE 0 0 227 210 208 208 229 229 300 363
14 NERETE 107 107 308 321 0 0 129 129 287 308
15 NERETE 157 157 308 321 197 251 233 340 363 367
16 NERETE 127 127 304 325 208 208 166 240 363 367
17 NERETE 173 173 325 325 251 256 247 247 363 370
18 NERETE 144 140 0 0 268 268 225 240 367 367
19 NERETE 144 144 317 317 202 208 186 212 367 367
20 JUANCHILLO 169 169 321 321 201 198 256 256 374 393
21 JUANCHILLO 139 139 304 325 0 0 194 267 374 374
22 JUANCHILLO 165 165 321 325 216 245 202 202 363 382
23 JUANCHILLO 153 153 325 325 235 235 238 238 356 356
24 JUANCHILLO 148 148 231 231 0 0 0 0 363 375
25 JUANCHILLO 0 0 304 321 239 239 198 198 356 401
26 JUANCHILLO 0 0 308 317 236 236 194 162 356 360
27 JUANCHILLO 115 115 239 239 260 260 190 190 349 367
28 JUANCHILLO 144 144 321 321 227 227 196 196 356 356
29 JUANCHILLO 148 189 304 329 193 193 193 193 363 386
30 JUANCHILLO 135 135 321 325 243 259 252 252 374 504
10
DISCUSIÓN
En este estudio de A. similis se consideró
exitosa la amplificación cruzada de cinco
loci. Con relación al resto de los loci, en
algunos no se logró amplificación y otros no
se alcanzó la estandarización. Una de las
explicaciones de que no se haya logrado la
amplificación de algunos microsatélites en
estudio (Tabla 4), se debió quizás, a que el
diseño de los cebadores no fue el mejor, o
coincidió con una región de tasa de mutación
elevada en uno de los cebadores diseñados
en el organismo usado como fuente de ADN
(A. tuberculosa). Por otra parte, la aparición
de bandas inespecíficas que no lograron
limpiarse en algunas de las amplificaciones,
puede deberse a que los cebadores no se
diseñaron específicamente para la especie y
es probable que en ocasiones se hibridicen
en regiones del ADN de A. similis diferentes
a la región flanqueante del microsatélite
(Vissuet et al. 2008). Los 5 loci
microsatélites analizados en las 30 muestras
fueron polimórficos y el número de alelos
por locus varió de 14 en STR19 hasta 32
alelos en STR10. Cabe aclarar que varios
loci microsatélite amplificaron, pero no con
patrones de bandas estables que permitieran
su medición, por lo que se dejaron fuera de
la estandarización. No obstante, Hamill et al.
(2007) mencionan que es posible continuar
variando la temperatura de anillamiento y las
concentraciones del cloruro de magnesio,
junto con otros parámetros de la PCR para
conseguir amplificaciones exitosas.
Aunque este estudio no es un trabajo
poblacional (debido al N muestral) sino más
bien un trabajo de investigación exploratorio
que buscaba marcadores para ser utilizados
en posteriores estudios poblacionales en A.
similis, se realizaron algunas estimaciones a
partir de este tamaño de muestra con el fin
de comparar con otros estudios,
obteniéndose diversidades genéticas (He)
similares para las diferentes poblaciones
analizadas, entre 0,85 y 0,96. Pero al
comparar esta diversidad con la
heterocigosidad observada (Ho), se encontró
deficiencia de heterocigotos en todos los loci
bajo estudio (Tabla 3). No obstante, el
déficit de heterocigotos es una característica
comúnmente observada en moluscos
marinos (Crassostrea gigas y Buccinum
undatum) (Hedgecock et al., 2004,
Weetman et al., 2005) y otros moluscos
bivalvos (Crassostrea virginica, Venerupis
pullastra y Macoma balthica) (Reece et al.
2004, Becquet et al. 2009, Pereira et al.
2009). En estudios poblaciones este déficit
de heterocigotos, suele deberse al efecto
Wahlund, el cual se refiere a la reducción de
heterocigocidad en una población causada
por una estructura subpoblacional o mezcla
de poblaciones (Tripp-Valdéz et al. 2010).
Mientras tanto, al comparar otros estudios
donde se presenta sobreexplotación de
especies, el déficit de heterocigotos se basa
en dicha sobre explotación que directamente
aumenta la deriva génica (Benzie &
Williams 1998). Cabe señalar que los efectos
de explotación no solo afectan los sitios
donde se realiza sino que también podrían
causar un efecto a largo plazo sobre los
patrones de reclutamiento larvario en sitios
de explotación lejanos (Zamora et al. 2011).
Este déficit de heterocigotos sigue siendo un
aspecto importante a considerar, ya que
ninguno de los loci analizados (excepto el
STR13) se encontró en equilibrio de Hardy-
11
Weinberg (HWE) (Tabla 3), fundamento
básico en el análisis de la estructura genética
poblacional. Estas desviaciones del
equilibrio HWE, pueden ser atribuidas a
factores como la endogamia a consecuencia
de la sobre explotación pesquera. Además,
los valores de heterocigosidad observados,
se corresponden con el índice de fijación (F),
cuyos valores fueron relativamente altos en
casi todos los loci analizados, lo cual indica
que se pueden estar fijando alelos en la
población de estudio.
Otro aspecto importante y frecuente que
también se debe considerar durante la
caracterización de microsatélites, son los
errores durante la amplificación de los loci
en los individuos, ocasionando falsos
homocigotos (alelos nulos) (Li & Kijima
2005). Los alelos nulos en los marcadores
tipo microsatélite, se dan por mutaciones
puntuales en las regiones flanqueantes, que
es donde se alinean los cebadores, lo cual
disminuye la capacidad de reconocimiento
de estos últimos durante la amplificación del
fragmento por PCR (Callen et al. 1993,
Reece et al. 2004). La presencia de alelos
nulos en los estudios de genética de
poblaciones trae consigo la ausencia de
equilibrio de Hardy-Weinberg debido a un
déficit de heterocigotos (Callen et al. 1993,
Li et al. 2003) y múltiples alelos nulos hacen
confusos los análisis de estructura
poblacional (Reece et al. 2004, Li et al.
2009).
Se debe tener en cuenta además, que
organismos que producen gran número de
gametos, como algunos moluscos marinos,
tienen un mayor número de ciclos celulares,
por lo tanto se incrementa la posibilidad de
mutaciones a nivel de la replicación del
ADN (Foltz 1986, Beckenbach 1994), y se
ha observado que las especies con
espermatozoides planctónicos muestran
alelos nulos y desviaciones al HWE, en
comparación con especies de menor
frecuencia copulatoria, y menor producción
de espermatozoides como los decápodos en
el cual la presencia de alelos nulos es rara
(Jensen & Bentzen 2004).
Se debe tener en cuenta, que aunque esta
técnica denominada amplificación cruzada,
ha demostrado alta eficiencia para varias
especies de peces (Rico et al. 1996, Takagi
et al. 1997), su eficiencia en bivalvos es
bastante pobre, incluso para los EST–SSR,
los cuales deberían estar aún más
conservados ya que provienen de regiones
codificantes (Zhan et al., 2005). Sin
embargo, al comparar con otros estudios en
bivalvos (Ibarra et al. 2006, Petersen et al.
2009) la amplificación cruzada de
microsatélites reportados para la almeja
Nodipecten subnodosus mostró baja
eficiencia cuando se realizó en especies de
diferente género, pero presentó un mayor
porcentaje de loci amplificados cuando se
probó en una especie del mismo género.
Teniendo en cuenta lo anterior y los
resultados de esta investigación, se hace
oportuno revaluar la cercanía filogenética de
las especies fuente y objetivo (A.
tuberculosa y A. similis, respectivamente) y
el uso de esta técnica de amplificación
cruzada en el caso de las especies en estudio,
siendo necesario realizar una librería
genómica de A. similis para identificar
marcadores microsatélites propios de la
especie.
12
CONCLUSIONES
1. La estrategia de amplificación cruzada
fue considerada exitosa y reproducible en
cinco de los marcadores microsatélites
probados.
2. Aunque 5 de los 24 loci microsatélites
fueron informativos, se considera una
proporción baja con respecto a estudios
de amplificación cruzada realizados en
otras especies (Schlötterer et al. 1991,
Kijas et al. 1995, Kayser et al. 1996,
González 2003, Strecker 2006, Chan
2007, Chang et al. 2008, Küpper et al.
2008, Lin et al.2008).
3. Los resultados no mostraron un patrón
claro sobre el éxito de la amplificación
cruzada y la relación filogenética entre las
especies origen y objetivo en este estudio.
SUGERENCIAS
1. Seguir variando las condiciones de PCR
y la metodología de estandarización,
sobre todo para aquellos loci que aunque
amplificaron en las diferentes muestras,
no se lograron limpiar de la presencia de
bandas inespecíficas al final de este
estudio.
2. Para estudios futuros, se recomienda
hacer una librería genómica para A.
similis y posteriormente identificar
marcadores moleculares tipo
microsatélite, para aumentar el número
de loci útiles y mejorar así los estudios
poblacionales de dicha especie.
Adicionalmente, utilizar otros tipos de
marcadores moleculares.
3. Aumentar el número de la muestra en las
diferentes localidades así como el
número de loci, para robustecer la
información y poder iniciar análisis
poblacionales, que en un futuro puedan
llevar a la búsqueda de loci de caracteres
cuantitativos y planes de conservación en
esta especie.
AGRADECIMIENTOS
Este estudio se encuentra enmarcado en el
proyecto “Conectividad genética de
poblaciones naturales de la piangua (A.
tuberculosa y A. similis) en la costa Pacífica
colombiana a partir de marcadores
moleculares”, desarrollado por el Instituto
de Investigaciones Marinas y Costeras
(INVEMAR) y contó con la cofinanciación
de la Universidad del Valle.
Agradezco al Banco de Tejidos del Instituto
de Investigación de Recursos Biológicos
Alexander von Humboldt (IAvH) por el
suministro de los tejidos utilizados en este
estudio. También agradezco el apoyo de la
Universidad del Valle (sede Cali) por el
préstamo de laboratorios y equipos.
Agradecimientos al profesor y director Jaime
Cantera, al profesor Heiber Cárdenas y la
bióloga Fanny Gonzáles por su contribución
en la fase experimental y tutoría. También al
biólogo Ronny Fernando Orobio, por sus
valiosas sugerencias para solucionar
situaciones durante este trabajo, así como al
evaluador que contribuyó con sus
comentarios a mejorar este documento.
Finalmente, a mi familia y amigos por todo
su apoyo durante mi carrera.
13
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