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INFORME TECNICO FINAL EFECTO DEL ESTRÉS SOBRE LA PERMEABILIDAD E INFLAMACION
INTESTINAL EN RATAS Registro asignado por la CGPI: 20050397 Responsable: Dr Rafael Campos Rodríguez. ESM
ANTECEDENTES
Al estres físico y psicológico se les ha relacionado estrechamente con el curso clínico
de algunos cuadros intestinales agudos y crónicos. Es bien sabido que el estres físico
en traumas, quemaduras o cirugía mayor, es capaz de causar úlceras por estres,
disfunción orgánica múltiple, traslocación bacteriana e impermeabilidad intestinal
incrementada. La disfunción intestinal también se ha asociado con la depresión, y el
síndrome de colon irritable (IBS). En los modelos animales se ha demostrado la
influencia del estres psicológico y físico, en el desarrollo y cronicidad de la colitis, en la
modificación de la motilidad intestinal y como causa de la disfunción de la barrera
intestinal; todos factores que facilitan la entrada de material potencialmente nocivo.
Aunque se reconoce el papel del estrés en lo cuadros señalados, todavía no se
esclarecen todos los mecanismos participantes (Kiliaan et al 1998, Saunders et al
1994). La barrera intestinal además de ser una barrera fisiológica es una barrera inmunológica,
ya que con frecuencia, microorganismos y sustancias extrañas son una carga
antigénica. Alteraciones de la regulación de la respuesta inmune ocasionan la
disfunción de la barrera, que a su vez conduce a los cuadros inflamatorios intestinales
ya mencionados. En condiciones fisiológicas el balance se mantiene al disminuir la
respuesta inmune en el intestino (Maffei et al 2004).
En la barrera epitelial se valora su permeabilidad a varios “marcadores prueba o
sondas”; dicha valoración emplea una gran variedad de sondas, incluidas las sondas
proteicas. Una proteína frecuentemente empleada como sonda, es la peroxidasa de
rábano (HRP, PM 45); otras técnicas, emplean azúcares, en tanto otras más incluyen
mediciones del flujo agua y de iones de las asas intestinales. Otro factor que no debe
despreciarse, es el estrés resultante del manejo y transporte de los animales, ya que
modifica la barrera intestinal. Se aconseja un periodo de 1 a 2 semanas de reposo
después que los animales han sido cambiados de su ambiente, y antes de iniciar
cualquier estudio relacionado con estrés.
En el proceso inflamatorio de varios orígenes (estrés psicológico, quirúrgico) se ha
involucrado la participación de las citocinas, al NO (oxido nítrico) producido por la
NOS2 (oxido nitrico sintasa inducible) y la COX-2 (ciclooxigenasa 2). El NO se produce
en diferentes partes del tubo digestivo, y se le asocia tanto a estados fisiológicos como
patológicos. En modelos animales y humanos se ha demostrado su participación en los
eventos inflamatorios y en el desarrollo del IBS (Ebert EC 1995, Linehab J et al 2005;;
Lundbert JON, et al 1994).
La NOS2 suele expresarse en áreas preferentemente inflamadas, con grandes
cantidades de NO, y su regulación depende de las citocinas (Kolios G et al 1995,
Whittle BJ, 1995). Algunas citocinas pro-inflamatorias son IL-1, IL-8 TNF-�, IFN-�, que
inducen la producción de NO por las células epiteliales de la mucosa o bien por las
células del sistema inmune (Hirabayashi N et al 2005). Se considera que en los
procesos crónicos, las citocinas causan sobre-expresión de NOS2 (Rao CV 2004;
Vallance BA et al, 2004)
Las citocinas tienen un papel central en la modulación inmune de la patogénesis y
evolución de la respuesta del huésped frente a la invasión de microorganismos,
traumas, quemaduras o agentes estresantes. Se han detectado alteraciones en el perfil
intestinal de las citocinas en pacientes humanos con cuadros inflamatorios como la
enfermedad de Cröhn o colitis ulcerativa, tanto a nivel de proteínas como de RNA
mensajero. Por tanto su detección y el análisis de su producción son críticos en la
comprensión de la respuesta del huésped a una variedad de insultos de diferente origen
y durante el estrés (Kassper et al 2001, Ullett et al 2000, Yamamoto et al 2000).
El modelo experimental mas ampliamente usado, para medir la función intestinal
durante el estrés agudo, consiste en inmovilizar a roedores de manera mecánica, pero
suave, durante 30 minutos a 4 horas, y durante varios días. En otros modelos los
animales son también inmovilizados y colocados en ambiente frío (8° C), o bien
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inmovilizados y sumergidos en agua a 20° C de manera vertical hasta el apéndice
xifoides por periodos de 2 a 5 horas. Estos modelos involucran elementos de estrés
físico y psicológico y se ha demostrado que inducen cambios en la barrera intestinal.
Se considera que la metodología RT-PCR es suficientemente exacta y sensible para
analizar el patrón de la expresión génica temporal y específica, de citocinas y enzimas,
cuantificando los transcriptos de RNAm. Este método también se emplea porque la
cantidad de moléculas producidas es muy pequeña. Se aisla RNA total como molécula
inicial para conocer dicha expresión.
JUSTIFICACION
Se considera al estrés físico y psicológico como fuente del origen y evolución del curso
clínico en algunos cuadros agudos y crónicos intestinales en el paciente humano y en
modelos animales. Es un hecho también que el estrés a través de la liberación de CRF
(corticotropina) y GC (glucocorticoides), disminuyan la permeabilidad intestinal y su
acción protectora contra la entrada de antígenos potencialmente nocivos. El estrés
también induce cambios del perfil intestinal de las citocinas pro-inflamatorias, de NOS2
y COX-2, que participan en la patogénesis y evolución de la respuesta del huésped.
El presente estudio pretende demostrar en el intestino delgado en un modelo animal,
que el estrés al disminuir la función protectora de la mucosa intestinal, incremente su
permeabilidad, permita la entrada de antígenos proteicos y la consecuente modificación
en la producción de anticuerpos específicos locales (en bilis y liquido intestinal) y
generales (en suero). Se intenta también demostrar cambios en el patrón de la
expresión de algunas citocinas, de NOS2 y COX-2,
OBJETIVOS
I Cuantificar anticuerpos en líquido, suero y bilis de ratas inmunizadas por via oral
y sistémica.
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II Determinar de paso de moléculas de diferente peso molecular por la mucosa
intestinal.
III Determinar inflamación cuantificando neutrófilos y monocitos/macrófagos en
mucosa intestinal.
IV Determinar la expresión de NO2 y COX2 en mucosa intestinal.
V Determinar la expresión de genes para mieloperoxidasa, IL-1, TNF� e ICAM-1,
en mucosa intestinal.
MATERIAL Y METODOS
Animales. Se utilizaron ratas Wistar machos de 200-250g de peso, desparasitadas y
con alimentación ad limitum. Los animales se someten a estrés por inmovilización de
una a tres horas durante tres días, y posteriormente se les sacrifica para conocer los
cambios arriba mencionados, en la primera sección del duodeno.
Ciclos de estrés e inoculación del antígeno. Ratas seleccionadas al azar, después de un periodo de recuperación de 15 días, se
someten a estrés por inmovilización, introduciéndose en recipientes estrechos de
acrílico. La inmovilización dura de una a tres horas, por tres días consecutivos. Al
grupo de ratas LNI (diabetes insípida) se les aplicó ciclo de estrés de una hora durante
el mismo número de días.
Al final de cada sesión de estrés, se aplica una mezcla de antígenos (ovoalbúmina,
albúmina bovina, caseína, peroxidasa de rábano, lectina de soya) a concentración de
10 mg/ml en un volumen total de 1 ml de solución salina. Previo a la aplicación se
administró solución de bicarbonato. Se utilizan diferentes mezclas de antígenos en los
diferentes grupos.
Grupo 1 Ratas sanas Control positivo solo estrés Control negativo solo administración de antígenos Grupo problema estrés y administración de antígenos Antígenos lecitina de soya yHRP Grupo 2 Ratas sanas Control positivo solo estrés
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Control negativo solo administración de antígenos Grupo problema estrés y administración de antígenos Antígenos ovoalbumina, albumina bovina y caseína Grupo 3 Ratas sham Control positivo solo estrés Control negativo solo administración de antígenos Grupo problema estrés y administración de antígenos Antígenos ovoalbumina y caseína Grupo 4 Ratas sham Control positivo solo estrés Control negativo solo administración de antígenos Grupo problema estrés y administración de antígenos Antígenos lecitina de soya, HRP, ovoalbumina, albumina, bovina y caseína Grupo 5 Ratas con diabetes insípida (LN 1) Control positivo solo estrés Control negativo solo administración de antígenos
Grupo problema estrés y administración de antígenos. Inmovilización durante una hora,
cuatro días consecutivos Antígenos lectina de soya, HRP, ovoalbumina, albumina, bovina y caseína Grupo 6 Ratas con diabetes insípida (LN 2) Control positivo solo estrés Control negativo solo administración de antígenos
Grupo problema estrés y administración de antígenos. Inmovilización durante tres horas,
cuatro días consecutivos Antígenos lecitina de soya, HRP, ovoalbumina, albumina, bovina y caseína Grupo 7 Ratas hipofisectomizadas Control positivo solo estrés Control negativo solo administración de antígenos
Grupo problema estrés y administración de antígenos. Antígenos lecitina de soya, HRP, ovoalbumina, albumina, bovina y caseína. Obtención del material biológico.
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Intestino. Después del tercer día de tratamiento los animales se sacrifican por
anestesia con éter; se extrae el intestino delgado completo, del que se toman muestras
del segmento proximal de alrededor 5 cm de longitud. Una muestra de cada porción se
congela a –70°C; las muestras se almacenan para posteriormente exameninarlas. Otras
muestras se fijan por inmersión en formaldehído al 4% para posteriormente incluirlas
en parafina.
Liquido intestinal. Una vez tomadas las muestras de intestino, se realizan lavados con
5 ml de solución salina al 0.9% para obtener líquido intestinal; el liquido del lavado se
centrífuga y colecta el sobrenadante, que se almacena en congelación para
cuantificación de IgA mediante ELISA.
Obtención de bilis. A los tres días y bajo anestesia con Hidrato de cloral al 35%, los
animales se someten a cirugía para obtener el líquido biliar. Después de localizar el
duodeno se colectan aproximadamente 2ml de bilis de cada rata.
Inmunohistoquimicas
Las tinciones inmunohistoquímicas para identificación de diferentes poblaciones
celulares, se hacen en los cortes de 10 micras de espesor y montados en laminillas
previamente tratadas con Poli-L-Lysina al 7 %, y fijadas en acetona durante 15 minutos.
Previa a la tinción, la actividad de la peroxidasa endógena se bloquea incubando los
cortes en una solución de H2O2 al 0.3% y NaN3 al 0.1% en PBS, durante 10 min.
Los tiempos de incubación con los anticuerpos primarios es de 1 a 2 horas, y para la
estreptavidina de 1 hora; ambos incubados a temperatura ambiente. Después de cada
incubación se realizan lavados suaves con PBS.
La reacción de peroxidasa se reveló según el método de Karnovsky con DAB. Las
muestras se contra colorean con hematoxilina de Harris, se deshidratan y cubren con
resina sintética.
Para detectar las moléculas marcadas con fluoresceína (dextrana-FITC), se utiliza como
anticuerpo primario, un anticuerpo de conejo anti FITC y como secundario el anticuerpo
de cabra anti IgG de conejo marcado con peroxidasa.
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Una vez realizadas las tinciones de todos los grupos, en los cortes teñidos con H-E, se
mide el área total en μm2 de las placas de Peyer, en el que se emplea un micrómetro
de ocular. En los cortes con diferentes anticuerpos se cuentan las diferentes
poblaciones celulares en la lámina propia de 5 vellosidades elegidas al azar.
Posteriormente el número de células se ajusta a un área de 25 x 103 μm2.
Cuantificación de IgA en líquido intestinal e IgG en suero
La IgA se cuantifica por el método de ELISA. Las placas se cubren e incuban con 20
μg/ml de Igs de conejo anti-IgA de ratón por pozo, durante 18 h a 4 o C; después se
lavan tres veces con PBS-T (pH 7.2-0.05% tween 20). Posteriormente se bloquean con
PBS-leche descremada (Svelty) al 5%, durante 1h a 37 o C, y se lavan nuevamente con
PBS-T.
Para las muestras de líquido intestinal, ésas se diluyen 1:2 en PBS-T, e incuban
durante 2 h, a 37 oC; al término, las placas se lavan 5 veces con PBS-T y 5 veces con
PBS. Se incuban nuevamente durante 2 h a 37 o C con el conjugado de cabra anti IgA
de ratón (Serotec) diluido 1:2000 en PBS-T. Finalmente, las placas se lavan 3 veces
más con PBS-T y otras 3 veces con PBS. Después se adiciona el sustrato
(ortofenilendiamina). Luego de 15 minutos a temperatura ambiente, la reacción se
detiene con ácido sulfúrico al 2.5 M, y la absorbancia se determina a una longitud de
onda de 492 nm.
Para cuantificar IgG se utiliza suero de cabra marcado con peroxidasa específico para
cadenas gamma de rata.
RT-PCR
Se mencionó que la metodología RT-PCR es suficientemente exacta y sensible para
analizar el patrón de la expresión génica temporal y específica de las citocinas
cuantificando los transcriptos de RNAm. Se aisla RNA total para conocer dicha
expresión. La metodología comprende las siguientes etapas:
1. Extracción de RNA total 2. Transcripción de RNA a cDNA(RT) 3. Amplificación de cDNA (PCR) 4. PCR Semi-cuantitativa o cuantitativa
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1. Extracción de RNA
El RNA total se aisló por el método de Chomczynski y Sacchi, bajo condiciones libres
de RNAasas y de acuerdo al protocolo para RT-PCR (Chomczynski, 1987, 1993).
Dentro de los lineamientos más importantes para el manejo de RNA, es indispensable
observar las siguientes reglas:
i se requiere usar guantes a lo largo de todo el proceso.
ii la inactivación de RNasas del material de vidrio, puede conseguirse bien
esterilizándolo o bien sometiéndolo a l50°C durante 4h. Los viales de plástico o puntas
deben esterilizarse y estar completamente secos previo a su uso. Todas las soluciones
deben preparase con H2O estéril previamente tratada con DEPC (dietilpirocarbonato).
iii las micropipetas empleadas deben ser de uso exclusivo para RNA.
iv el reactivo de Trizol deberá manejarse estrictamente dentro de una campana con
extracción.
v el aislamiento del RNA requiere inactivar la liberación inmediata de las RNasas de los
compartimientos celulares procedentes de las muestras, de manera que éstas deben
procesarse rápida y cuidadosamente. La inactivación se logra al congelar
inmediatamente las muestras en nitrógeno líquido o bien al homogenizar los tejidos con
la solución de lisis de Trizol. Esta es una solución monofásica de fenol que se emplea
en el método conocido como de un solo paso con ácido guanidin tiocianato-fenol-
cloroformo (AGPC). El reactivo de Trizol GIBCO BRL se usa de acuerdo al método
desarrollado por Chomczynski y Sacchi.
La extracción del RNA comprende los siguientes pasos: homogeneización,
precipitación, lavado y solubilización.
Homogeneización, se usa un homogenizador PGC para viales de 1.5ml; durante la
homogenización y lisis, el reactivo mantiene la integridad del RNA. De no emplearse el
volumen suficiente se corre el riesgo de contaminar el RNA con DNA. Se requiere l ml
de Trizol por cada 50 a 100 mg de tejido; la muestra no debe exceder el 10% del
volumen empleado. Una vez homogenizados los tejidos se les deja incubar durante 5
minutos a temperatura ambiente para completar la disociación de las nucleoproteínas.
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Separación, al homogenizado se agregan 0.2 ml de Cloroformo por cada ml del
reactivo de Trizol empleado. Los viales se cierran y agitan fuertemente durante 30
segundos; se incuban durante 2 o 3 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se
centrifugan a 12 000 rpm durante 15 minutos a 4°C. La fase acuosa incolora contiene
el RNA y su volumen es alrededor del 60% del volumen inicial del reactivo empleado
para la homogenización. La fase acuosa se transfiere a un vial nuevo.
Precipitación, a la fase acuosa se agrega 0.5ml de Isopropanol (ISPP) por cada ml de
reactivo de lisis y se mantiene a -20°C durante toda la noche. Posteriormente las
muestras se centrifugan a 12 000 rpm durante 10 minutos a 4°C.
Lavado del RNA, el pellet de RNA se lava con 1 ml de etanol al 75%, por cada ml de
Trizol usado durante la homogenización. Centrifugar posteriormente a 7 500 rpm
durante 5 minutos a 4°C.
Solubilización del RNA, se emplean de 50 a 100�l de H2O tratada con DEPC. La
relación de la DO (A280/260) del RNA debe ser al menos 1.8, e indica el grado de pureza
del mismo. Las muestras se almacenan entre -20 y -80°C, lo que depende del plazo de
su uso. De preferencia se alícuota en muestras de volúmenes pequeños.
Detección del RNA
El método empleado para detectar RNAs, es separarlo de acuerdo a su tamaño por
electroforesis en gel de agarosa al 1%. El método puede emplear buffer
desnaturalizante con formaldehído, o bien TAE 1X. La electroforesis se corre entre 70 y
100 mV durante 90 minutos. Más tarde el gel se tiñe con bromuro de etidio 0.5 �g/ml
durante 90 minutos. Las bandas se visualizan por transiluminación UV a 254 �M, y son
analizados con software para análisis molecular (Lab Works UVP).
Eliminación de proteinglicanos y polisacáridos Estas modificaciones se hacen en la media del contenido de RNasas presentes, o de la
contaminación con algunos otros componentes celulares de los tejidos empleados.
Estos pueden ser DNA genómico, polisacáridos, proteinglicanos, o algún otro polianion
componente del mucus intestinal, con posible efecto inhibitorio de la retrotranscripción
(RT) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
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Después de homogenizar el tejido, el RNA en la fase acuosa se precipita combinando el
50% del volumen del ISPP y el 50% de una solución fuertemente salina. Esta última
contiene 1.2M de NaCl y 0.8 M de citrato de sodio (no se requiere ajustar el pH).
Posteriormente la muestra se centrifuga a l0 000 rpm durante 15 minutos. Los
proteinglicanos permanecen en solución y en el pellet no visible se halla el RNA
(Chomczynski et al 1995, Groppe et al 1993, Schick et al 1995).
Eliminación de DNA genómico
En los métodos para aislar RNA consistentemente hay contaminación con pequeñas
cantidades de DNA genómico, que interfieren con las reacciones RT- PCR, y que puede
ser eliminado con el empleo de DNasas. Es importante recordar que las DNasa I se
obtienen a partir del páncreas de bovino, y debe estar libre de RNasas que pueden
degradar el RNA que se trata de purificar. Las RNasas también pueden provenir del mal
manejo de los reactivos. Por tanto es indispensable emplear DNasa I libre de RNasas.
Después del tratamiento se requiere eliminarla la DNAasa I por calentamiento o con
EDTA 25 mM.
Otra manera de eliminar el DNA involucra una precipitación extra seguida a la lisis de
las células con el Trizol. Después de homogenizar, el RNA se precipita por la adición de
1/3 del volumen de etanol al 95%, seguidamente la mezcla se incuba en hielo durante
cinco minutos. Después de centrifugar durante 15 minutos, el sobrenadante se separa,
y el pellet que contiene el RNA se redisuelve en ½ volumen de reactivo de Trizol. El
resto del procedimiento es el mismo (Chomczynski 1992, 1993, Nadin-Davis et al 1982,
Noonbeg et al 1995).
2. RT (transcripción reversa)
Esta primera reacción tiene por objeto la conversión enzimática de RNA a cDNA de
una cadena, que es el templado que se usará en la PCR. Un primer,
oligodesoxiribonucleótido se hibridiza al RNA en presencia de una DNA polimerasa
dependiente de RNA para crear una copia de DNA (cDNA), que luego será amplificada
por PCR. Dependiendo del propósito del ensayo, el primer para la síntesis de cDNA,
puede hibridizarse a cualquier sección del RNAm, o bien usar un primer particular que
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se hibridiza a una sección específica del RNAm. A los controles negativos no se les
agrega la enzima (no RT). La reacción se corre en tubos Eppendorf de 200 �l
(Sambrook et al 2001).
En la tabla se muestran los reactivos señalando su volumen para de cada uno de ellos.
Todos los reactivos son para uso exclusivo de Biología Molecular Invitrogen.
Reactivos Volumen
RNA total 1-500 �g Oligo (dT) 12-18 1 �l d NTP 1 �l (mezcla de dATP, dGTP, dCTP y dTTP, 10 mM) H2O DEPC 12 �l Desnaturalizacion durante 10 minutos a 65°C, después colocar en hielo, mientras se agregan el resto de los reactivos Buffer 5x 4 �l DTT 2 �l *SS II (200 U) 1 �l Incubar durante 1 h a 42°C Inactivar por calentamiento durante 15 minutos a 70°C * SS II Super Script II Transcriptasa Inversa
3. PCR (reacción en cadena de la DNA polimerasa)
Una reacción típica de PCR incluye los reactivos y las condiciones en las cuales se
corre el ensayo. Los reactivos son: Taq DNA polimerasa, el cDNA que es el templado o
plantilla, los primers sense y anti-sense, iones Mg++, la mezcla de desoxiribinucleótidos,
el buffer de amplificación para PCR, y agua tratada con DPCE o agua para inyectables.
De acuerdo a los primers empleados la temperatura de hibridación varía entre 60 y
75°C; la reacción se corre un promedio de 25 ciclos. A continuación se muestra tabla de
los reactivos señalando volumen y concentración final de cada uno de ellos. La reacción
de PCR se corre por duplicado, en tubos Eppendorf de 200 �l (Sambrook et al 2001).
Todos los reactivos son para uso exclusivo de Biología Molecular Invitrogen.
Reactivo Volumen Conc final
Taq* DNA pol recombinante 0.2 �l 1 U c DNA 2.0 �l variable primer sense 4.0 �l 300 �� primer anti-sense 4.0 �l 300 ��
11
Mg++ 0.75 �l 1.5 mM d NTPs 0.75 �l 300 �� buffer 10X, amplificación 2.50 �l 1 X H2O DEPC 10.8 �l cbp Volumen total 25.0 �l * Taq DNA pol recombinante de Invitrogen
La ensayo de PCR debe incluir controles (positivo) que permitan detectar la
contaminación con DNA genómico que frecuentemente se halla al aislar RNA. La mejor
manera es agregar un tubo control “no RT” para cada muestra de RNA; esto es durante
la amplificación se usa una muestra de RNA que no se ha retrotranscrito en vez de
cDNA. Si el producto se amplifica, indica la presencia de DNA, que proviene de la
extracción de RNA. Es obligado agregar otro control (negativo) en donde el templado es
substituido por H2O para conocer si la contaminación proviene del resto de otros
reactivos. Lo anterior justificado por el hecho de que la enzima (Taq polimerasa) no
puede discriminar entre cDNA (proveniente de RT) o DNA genómico (Zhi-Wei et al,
1997).
Los parámetros del termociclador (Mastercycler Eppendorf 5331) empleados fueron:
95°C por 2 min., seguida por 25 ciclos con desnaturalización por 50s, hibridización del
primer y del templado 60°C por 50s, primera extensión 72° por 1 min. La extensión final
es a 72°C durante 10 min. Los productos de PCR se identifican por electroforesis en gel
de agarosa al 1%. La electroforesis se corre entre 70 y 100 mV durante 90 minutos;
más tarde el gel se tiñe con bromuro de etidio 0.5 �g/ml durante 90 minutos. Las
bandas se visualizan con transiluminación UV a 254 �M, y son analizados con software
para análisis molecular (Lab Works UVP). Se usa un marcador de DNA de 100 pb
(Gibco-BRL Life Technologies).
ANALISIS ESTADÍSTICO
Para la evaluación estadística de los resultados obtenidos se utiliza la prueba de
análisis de varianza (ANOVA).
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RESULTADOS I. Cuantificación anticuerpos en líquido, suero y bilis de ratas inmunizadas por vías intraperitoneal y parenteral. No se observa diferencia significativa en los niveles de IgA, ni en bilis ni en líquido
intestinal, cuando los diferentes antígenos son administrados por via intraperitoneal. Los
niveles de IgA en suero son significativamente diferentes cuando el antígenos se
administra por vía parenteral. Lo que confirma que los antígenos son inmunogénicos.
(Figuras 1,2 y 3)
II. Determinación del paso de moléculas de diferente peso molecular por la mucosa intestinal Con el objetivo de establecer si el estrés aumenta el paso de moléculas a través de la
luz intestinal de la mucosa, se administran por via intragástrica Dextrana-FITC de pesos
moleculares de 4000, 40,000 y 400,000 daltones, a ratas estresadas y sin estrés. Una
hora después se toman muestras que se procesan para el estudio inmunohistoquímico
utilizando anticuerpos anti FITC. En ninguna de las muestras se detecta el paso de las
moléculas a través de la mucosa intestinal. Los resultados demuestran que en estas
condiciones, el estrés no incrementa la permeabilidad,.
13
Figura 1. Niveles de anticuerpos IgA bilis de ratas inoculadas con mezcla de antígenos por vía sistémica.
Figura 2. Niveles de anticuerpos IgA en bilis de ratas inoculadas con mezcla de antígenos por vía sistémica.
Figura 3. Niveles de anticuerpos IgA en líquido intestinal de ratas inoculadas con mezcla de de antígenos por vía sistémica
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III. Determinación el grado de inflamación por cuantificación de neutrófilos y monocitos/macrofagos en mucosa intestinal Para determinar el grado de inflamación se cuantifica el número de neutrófilos y
monocitos/macrófagos presentes en la mucosa intestinal de ratas, sin y con estrés de 1
y 3 horas. El estrés durante una hora, no causa inflamación ya que el número de
neutrófilos es el mismo para ambos grupos de ratas. Sin embargo, el estrés durante 3
horas si causa reducción significativa en el número de monocitos, quizá por disminución
en su migración. (Figura 4).
11
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100No estresEstres 1hEstres 3 h
No
célu
las
/ 104 μ
2
Neutrofilos Monocitos
*
Figura 4. Número de neutrófilos y macrófagos en mucosa intestinal de rata. Los neutrófilos y monocitos se identifican mediante tinción con anticuerpos específicos: anti-CD15 (neutrófilos), anti F4/80 (monocitos). Cada barra representa la media +/- la desviación estándar, n=5 (* P< 0.05)
IV. Determinación de la expresión de sintasa de NOS2 y COX-2 en mucosa intestinal Empleando el método de RT-PCR se cuantifica el proceso inflamatorio de la mucosa
intestinal, a través de la expresión relativa de los genes para NO2 y COX-2 (Figuras 5 y
6). No hubo diferencias significativas en la expresión relativa de COX-2 y NOS-2. Lo
que indica que el estrés, bajo las condiciones citadas, no afecta la expresión de esos
genes.
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Figura 5. Expresión de NOS2 y COX-2 en mucosa intestinal de ratas.
0
2
4
6
8
10
0
2
4
6
8
10No estresEstres 1hEstres 3 h
Exp
resi
ón re
lativ
a
COX-2 NOS-2
Figura 6. Expresión relativa de NOS2 y COX-2 en mucosa intestinal de ratas.
V. Determinación mediante RT-PCR de la expresión de genes para
mieloperoxidasa, IL-1, TNF-α e ICAM-1
Para confirmar que el estrés de corta duración no causa inflamación de la mucosa
intestinal de ratas, se cuantifica la expresión relativa de los genes de mieloperoxidasa
que se encuentra en neutrófilos, así como de genes de citocinas pro-inflamatorias como
IL-1 y TNF� y de molécula de adhesión ICAM-1, que suelen incrementarse durante los
procesos inflamatorios. Como se observa en la figura 7, no hay incremento en la
expresión de ninguno de esos genes en ratas estresadas durante 1 o 3 horas.
13
0
5
10
15
20
25
30
0
5
10
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20
25
30
No estresEstres 1 hEstres 3 h
Expr
esió
n re
lativ
a
MPO IL-1 TNF-a ICAM-1
Figura 7. Expresión relativa de MPO, citocinas pro-inflamatorias e ICAM-1.
CONCLUSIONES
El aspecto más relevante del proyecto es que se demuestra que el estrés por
inmovilización, con las condiciones establecidas, no incrementa la entrada de antígenos
de la luz intestinal a la lámina propia y consecuentemente no se induce la producción de
anticuerpos contra esos antígenos.
En animales estresados y sin estrés, inoculados por vía intragástrica con Dextrana-
FITC de diferentes pesos moleculares, muestran que el estrés no incrementa la
permeabilidad de las moléculas en las condiciones citadas.
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La producción de anticuerpos en las ratas estresadas y no estresadas, se comporta de
forma similar, lo que indica que las ratas no responden a los antígenos, o que los
antígenos no son inmunogénicos por vía oral.
La concentración de anticuerpos anti-albúmina y anti-ovoalbúmina, en el grupo sham y
de ratas normales bajo estrés e inmunizadas, es menor al compararlo con el grupo no
inmunizado; esto indica que la respuesta basal disminuye en el estrés, probablemente
debido a la liberación de glucocorticoides.
En las ratas que carecen de hipófisis y por lo tanto de la influencia de glucocorticoides
no hubo disminución de la producción basal de anticuerpos, confirmándose que los
glucocorticoides interfieren con la producción de anticuerpos.
La cuantificación del número de neutrófilos y monocitos/macrófagos en mucosa
intestinal, no causa inflamación en animales estresados y sin estresar. Sin embargo el
estrés de 3 horas causa reducción significativa en el número de monocitos, tal vez por
disminución en su migración.
El estrés tampoco causó cambios significativos en la expresión de los genes NOS2,
COX-2, ni en la expresión de las citocinas pro-inflamatorias IL-1, ��F�, así como la
molécula ICAM-1.
Probablemente la falta de respuesta sea debida al tiempo al que los animales fueron
sometidos a estrés; quizá dicho tiempo deba ser incrementado.
BIBLIOGRAFIA Chomczynsky P and Sacchi. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium
thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987, 16:156-159
Chomczynsky P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic
Acids Research 1992, 20:3791-3792.
Chomczynsky P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and
Proteins from cell and tissue samples. Biotechniques 1993, 15:532-537.
15
Chomczynski P and Mackey K. Modification of the TRI reagent procedure for isolation
of RNA from polysaccharide and proteoglycan rich sources. Short Technical
Reports. BioThecniques 1995, 19:942-945.
Ebert EC. Human intestinal intraepitheliallymphocytes have potent chemotactic actividy.
Gastroenterology 1995, 109: 1154-1159
Groppe J C and Morse D E. Isolation of full-length RNA templates for reverse
transcription from tissues rich in RNase and proteoglycans. Analytical
Biochemistry 1993, 210:337-343.
Hirabayashi N, Tanimura H and Yamaue H. Nitrite/nitrate oxide and cytokines changes
in patients with surgical stress. Dig Dis Scie 2005, 50: 893-897
Kassper LH and Buzoni-Gatel D. Minireview: Ups and Downs of Mucosal cellular
immunity against protozoan parasites. Infection and Immunity 2001, 69:1-8.
Kiliaan AJ, Saunders PR, Bijlsma PB, Berin MC, Taminiau JA, Groot J and Perdue MH.
Stress stimulates transepithelial macromolecular uptake in rat jejunum. Am J
Physiol Gastrointest Liver Physiol 1998, 275:G1037-G1044.
Kolios G, Brown Z, Robson RL, Robertosn DAF and Westwick J. Inducible nitric oxide
synthase activity and expression in human clonic epithelial cell line, HT-29. Br J
Pharmacol 1995, 116: 2866-2872.
Linehan JD, Kolios G, Valatas V, Robertson DAF and Westwick J. Effect of
corticosteroids on nitric oxide production in inflammatory bowel disease: are
leukocytes the site of action? Am J Physiol Gastrointest Liver PHYsiol 2005, 288:
G261-G267.
Lundberg JON, Hellstrom PM, Lundberg JM and Alving K. Greatly increased luminal
nitric oxide in ulcerative colitis. Lancer 1994, 344: 1673-1674.
Maffei CM, Mirels LF, Sobel RA, Clemons KV and Stevens DA. Cytokine and inducible
Nitric oxide synthase mRNA expression during experimental murine Cryptococcal
meningo encephalitis. Infection and Immunity 2004, 72:2338-2349.
Monstein HJ, Nylander AG and Chen D. RNA extraction from gastrointestinal track and
pancreas by a modified Chomczynski and Sacchi method. Biotechniques 1995,
19:340-344.
16
Nadin-Davis S and Mezl VA. Optimization of the ethanol precipitation of RNA from
formamide containing solutions. Preparative Biochemistry 1982, 12:49-56.
15
Noonberg S B, Scott G K and Benz C C. Effect of pH on RNA degradation during
guanidinium extraction. BioTechniques 1995, 19:731-733.
Rao CV. Nitric oxide signaling in colon cancer chemoprevention. Mutant Res 2004, 555:
107-119
Sambrook J and Russel DW. Molecular cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Vol 1,2 y
3. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 2001
Saunders PR, Kosecka U, McKay DM and Perdue MH. Acute stressors stimulate ion
secretion and increase epithelial permeability in rat intestine. Am J Physiol
Gastrointest Liver Physiol 1994, 267:794
Schick B P and Eras Jennifer. Proteoglycans partially co-purify with RNA in TRI reagent
and can be transferred to filters by Northern Blotting. BioTechniques 1995, 18:
575-578.
Siebert P D and Chenchik A. Modified acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform
RNA extraction method which greatly reduces DNA contamination. Nucleic Acids
Research 1993, 21:2019-2020.
Ullett GC, Ketheesan N and Hirst RG. Cytokine gene expression in innately susceptible
Balb/c mice and relatively resistant C57BL/6 mice during infection with virulent
Burkholderia pseudomallei. Infection and Immunity 2000, 68:2034-2042.
Vallance BA, Dijkstra G, Qiu B, Van de Waaij LA, Van Goor H, Jansen PLM,Mashimo H
and Collins SM. Relative contributions of NOS isoforms during experimental
colitis: endothelial-derived NOS maintains mucosa integrity. Am J Physiol
gastrointest Liver Physiol 2004, 287: G865-G867
Whittle BJR. Nitric oxide in physiology and pathology. Histochem J 1995, 27: 727-737.
17
Yamamoto M, Yoshizaki K, Kishimoto T and Ito H. IL-6 Rquired for the development of
Th1 Cell-mediated murine colitis. The Journal of Immunology 2000, 164:4878-
4882.
Zhi-Wei L, Hundeiker C,Gleichmann and Esser C. “Primer-dropping method” Cytokine
gene expression during ontogeny in murine thymis on activation of the aryl
hydrocarbon receptor for 2,3,7,8 tetrachloridibenzo-dioxin. Molecular Pharmacol
1997, 52:30-37.
18