[

FINANCIACIÓNprOYECTO (CYCYT REN 2003-02185) finançat pel MCYTDiversidad funcional y ecofisiología de las bacterias transformadoras de nitrógeno y aplicación a la gestión de un sistema de humedales de tratamiento (EDAR-Empuriabrava)

Interaccions planta-microorganisme, mecanismes útils per a la eliminació de nitrogen en

sistemes de llacunatge

Institut d’Ecologia AquàticaUniversitat de Girona

[ El cicle del nitrogen

Francis et al. 2007. ISME Journal 1:19-27

Transformacions microbianes del Nitrogen en l’aigua

[ El cicle del nitrogen

Transformacions microbianes del Nitrogen en l’aigua. Interaccions de les plantes

Part aèria: Accumulació N en teixits vegetals (També a altres parts de la planta)

Part submergida: Formació de biofilms microbians, nitrificació (?), desnitrificació(?), fixació de N2 (?)

Part sediment: interacció amb les arrels, nitrificació, desnitrificació, fixació de N2, amonificació

[ SAC-Empuriabrava

Àrea

(m2)

Profunditat promig (m)

Longitud max. (m)

Cel·la tractament 1 8,214 0.5 162.1

Cel·la tractament 2 8,278 0.5 145.2

Cel·la tractament 3 8,226 0.5 173.5

Llac Europa 44,802 0.2

Figueres

Girona

A

CELL 1

CELL 2

CELL 3

Recieving Lagoon

Empuriabrava-WWTPSettlers

Maturatio

n ponds Efflu

ent

N-NH4+

monitori

zation

Empuriabrava-FWS-CW

Ruiz-Rueda et al. 2007. Int Microbiol 10:253-260

[

Year 2005

may jun jul ago sep oct nov

Co

nce

ntr

atio

n(p

pm

)

0

10

20

30

40

50

N-NH4+ (ppm) N-NO

2— (ppm) N-NO

3— (ppm)

Year 2008

jun jul ago sep oct nov

Con

centr

ation (

ppm

)

0

2

4

6

8

10

12

14

SAC-Empuriabrava

Dinàmica d’entrada de nitrogen als SACF

low

(m

3/d

ay)

3000

6000

[ SAC-Empuriabrava

N-N

H4

+ (p

pm

)

0

5

10

15

20

25

30

Year 2005

may jun jul ago sep oct nov

N-N

O3

— (

pp

m)

0

2

4

6

8

Cell 1 Cell 2 Cell 3

% reductionMay 86.2June 88.6July 92.2August 76.6September 18.6October 55.1

Eficiències d’eliminació

Eficiència de la reduccióde N en el SAC

[ SAC-Empuriabrava

Distribució de la vegetació

1 2 3

Cobertura (m2) 3322 2744 3143

Typha (%) 67.0 70.4 37.5

Phragmites (%) 21.9 10.6 62.5

Dades obtingudes I modificades de l’Institut Cartogràfic Catalàwww.icc.es

Phragmites australis Typha sp. Mixed populations

50 m

Inlet canal

Cell 1Cell 2Cell 3

1

2

3

4

5

6

7

Inc

8

9

10

11

1213

14 21

2019

18

17

16

15

Inc

Inc

Inc

Inc

Inc

[ SAC-Empuriabrava

Variació de la concentració de nitrat (����) i amoni (����) (ppm)

Cell 1Cell 2Cell 3

[ Desnitrificació potencial. Assajos al laboratori

MostresÀrees sense vegetació (NV)0 a 3 cm fondària3 a 5 rèpliques

Vegetació (Rhizosfera)Extracció directe de plàntulesNeteja del sediment3 a 5 rèpliques

Activitat potencial de reducció de nitrat

~10 g pes fresc sediment o rizosfera● 1/5 dilució amb solució isotònica● Addició de materia orgànica● Addició de nitrat (2 mM)

• Quantificació de NO3 i NO2 (HPLC)• Quantificació de N2O (GC)

[ Desnirificació potencial. Assajos al laboratori

July

_200

5

Jun

e_200

6

Au

gust_

200

6

Sep

tem

be

r_200

6

NO

2

— +

NO

3

— r

ed

uction

(µ

gN

/gD

W/h

)

0

25

50

75

100

200

250

July

_2005

June_

2006

Augu

st_

2006

Septe

mber_

2006

July

_2005

June_

2006

Augu

st_

2006

Septe

mber_

2006

NO

2

— +

NO

3

— re

du

ctio

n (µ

gN

/gD

W/h

)

0

25

50

75

100

200

250

Desnitrificació potencial (reducció nitrat+nitrit)

Bulk Phragmites sp. Typha sp.

a a a ab

b

cc

c

bc

ab

bc

d

[ Nitrificació potencial. Assajos al laboratori

MostresÀrees sense vegetació (NV)0 a 3 cm fondària3 a 5 rèpliques

Vegetació (Rhizosfera)Extracció directe de plàntulesNeteja del sediment3 a 5 rèpliques

Activitat nitrificant

~10 g pes fresc sediment o rizosfera● 1/5 dilució amb solució isotònica● Addició d’amoni (2 mM)• Condicions aeròbiques

• Quantificació de NO3 i NO2 (HPLC)• Quantificació de N2O (GC)

[ Nitrificació potencial. Assajos al laboratori

July

_200

5

Jun

e_200

6

Au

gust_

200

6

Sep

tem

be

r_200

6

NO

3

— p

rod

uctio

n (

µgN

/gD

W/h

)

0

2

4

6

8

15

20

July

_2005

June_

2006

Augu

st_

2006

Septe

mber_

2006

July

_2005

June_

2006

Augu

st_

2006

Septe

mber_

2006

NO

3

— p

rod

uctio

n (µ

gN

/gD

W/h

)

0

2

4

6

8

15

20

Nitrificació potencial

Bulk Phragmites sp. Typha sp.

a

b b

bc

bcc c

bc

bb

c

d

[ Activitats in situ

Muntatge de sistemes experimentals

Característiques• Acer inoxidable• Volum d’aigua 6,8 litres• Superfície de sediment 0,049 m2

in out

[ Activitats in situ

Muntatge de sistemes experimentals

Comprovació temps per a agitació sobre mostres de sediment.Addició de 10 ml d’àcid HCl. Mesura en continu.Temps d’estabilització <6 min

Comprovació de la difusió cap al sediment.

Addició de tartrazina com a colorant soluble.

Mesura del colorant a les 3 h.<3% de pèrdua en sediment lliure.De 7 a 9 % de pèrdua en sediment

amb vegetació

[ Activitats in situ

Cell 3

May_2008

August_2008

March_20090

20

40

60

80

May_2008

August_2008

March_20090

20

40

60

80

May_2008

August_2008

March_20090

20

40

60

80

Desnitrificació activitat in situ (mg N/h/m2)

May_2008

August_2008

March_20090

20

40

60

80

May_2008

August_2008

March_20090

20

40

60

80

May_2008

August_2008

March_20090

20

40

60

80

[ Activitats in situ

Cell 3

May_2008

August_2008

March_20090

2

4

6

8

10

May_2008

August_2008

March_20090

2

4

6

8

1013,01

May_2008

August_2008

March_20090

2

4

6

8

10

May_2008

August_2008

March_20090

2

4

6

8

10

May_2008

August_2008

March_20090

2

4

6

8

10

May_2008

August_2008

March_20090

2

4

6

8

10

Amonificació activitat in situ (mg N/h/m2)

[ Activitats in situ

Cell 3

Activitat epífits (?)

Activitat

desnitrificant

(µgN/h/cm2

fulla)

EntradaSortida

-0,03

-0,02

-0,01

0,00

0,01

0,02

0,03

EntradaSortida

-0,03

-0,02

-0,01

0,00

0,01

0,02

0,03

Maig_2008

[ Activitats in situ

Cell 3

Activitat epífits (?)

EntradaSortida

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

EntradaSortida

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

Activitat

desnitrificant

(µgN/h/cm2

fulla)

Agost_2008

[ Conclusions

1) L’activitat potencial de nitrificació i desnitrificació en condicions de laboratori és significativament major en mostres de rizosfera.

2) La normalització dels valors d’activitat per unitat d’àrea redueix significativament el paper de les arrels de les plantes en les activitats mesurades.

3) Les activitats estimades a partir de mesures in situ, ens mostren que no hi ha diferències significatives entre les zones amb vegetació i les lliures de vegetació. Aquests valors són sensiblement més alts als estimats a partir de les determinacions al laboratori.

4) L’amonificació pot arribar a representar entre un 5 i un 20 % de la reducció total de nitrat i nitrit en àrees confinades de sediment.

5) L’activitat dels epífits és important, tant des del punt de vista de la nitrificació, com de la desnitrificació.

[ Estructura de la comunitat. Desnitrificants

Bacteris desnitrificants. Gen nosZ

Group I

June samples

Clone TJ73 (21)Clone PJ41 (20)

Clone PJ14 (18)Clone TJ70 (21)Clone PJ71 (18)Clone TJ5 (19)Clone TJ75 (20)Clone PJ2 (13)Clone TS8 (8)

Clone TJ59 (20)Clone PJ31 (13)Clone PJ4 (18)

Clone PJ6 (20)Clone PJ65 (21)

Clone PJ8 (28)Clone PJ34 (8)Clone TJ80 (18)Clone TJ10 (19)Clone TS2 (18)

Clone TJ34 (18)Clone PJ29 (18)

Clone TJ17 (18)Clone TS23 (30)

Clone TS51 (11)Clone TS92 (13)

Thiobacillus denitrificans CP000116.Azospirillum largimobile AY072228

Burkholderia pseudomallei CP000572.Clone PS36 (28)

Clone TJ74 (22)Ralstonia eutropha X65278Ralstonia eutropha X65278.

Clone TJ26 (30)Clone PJ25 (30)

Clone PJ87 (17)Clone TJ22 (18)Clone PJ33 (28)

Clone PJ21 (18)Clone TJ16 (18)

Clone TS32 (30)Clone TJ36 (20)

Clone TJ37 (16)Clone TJ71 (21)Clone PJ7 (30)

Clone TJ2 (19)Clone TJ40 (25)

Clone PJ68 (18)Clone TJ64 (18)Clone PJ13 (18)Clone PJ1 (18)Clone PJ50 (18)

Clone TS4 (4)Clone TS22 (30)

Pseudomonas aeruginosa X65277.Clone TS46 (36)Clone PS100 (30)

Clone TS79 (36)Clone PS111 (30)

Clone TJ4 (7)Clone TS3 (22)

Clone TS43 (22)Sinorhizobium meliloti AE007253.1Sinorhizobium meliloti U47133

Clone TS12 (15)Brucella suis NC 004311.

Clone PS11 (9)Bradyrhizobium japonicum AJ002531.Clone TS37 (30)

Clone PS74 (5)Clone TS20 (12)Achromobacter xylosoxidans AY072227

Silicibacter pomeroyi CP000032.Clone TJ47 (25)

Clone TS81 (35)Clone TS24 (30)Clone TS62 (22)

Clone TS53 (8)Rhodobacter sphaeroides AF125260

Clone PJ61 (8)P.denitrificans X74792.1|

Achromobacter cycloclastes Y15161Clone TS9 (20)Clone TS33 (20)

99

99

99

99

91

99

99

63

52

50

99

99

94

95

7366

61

57

52

54

52

50

53

93

84

99

9961

66

84

99

98

95

77

88

85

19

79

99

0.05

Group II

September samples

Deduced amino-acid sequences (145 aa)Neighbor-joining phylogenetic tree, pair-wise

deletion 1000 bootstrap replications

• Les seqüències s’agrupen en general en funció de la data de mostreig.

• Elevat nombre de seqüències sense similitud amb espècies de bacteris desnitrificants cultivades.

Ruiz-Rueda et al. 2009. FEMS Microbiol Ecol 67:308-319

[cto_20

cto_23

cto_13

cto_14

cto_3

cto_11

cto_22

cto_24

cto_27

cto_10

cto_21

cto_6

cto_26

cto_9

Nitrosomonas marina

Nitrosomonas ureae

cto_30

cto_7

cto_19

Nitrosomonas europaea

Nitrosomonas eutropha

Nitrosospira III2

Nitrosospira D11

Nitrosospira A4

Nitrosospira sp.

Nitrosospira briensis

Nitrosospira multiformis

Nitrosospira Nsp2

Thiobacillus thioparus

Thiobacillus denitrificans

Methylobacillus glycogenes

Methylobacillus flagellatum

Methylophilus methylotrophus

cto_2

cto_18

cto_1

Escherichia coli

Nitrosococcus oceanus

Nitrosococcus halophilus99

91

99

92

100

99

65

99

80

98

99

98

70

95

77

78

60

95

63

73

63

0.02

Nitrosococcus mobilis

Ic

Estructura de la comunitat. Nitrificants

Bacteris oxidadors de amoni

• Les bandes es distribueixen en 5 grups diferenciats. Totes emparentades amb Nitrosomonas spp.

• Bandes específiques per a les mostres de Setembre (1, 2 i 18) es relacionen amb Methylobacteria, I probablement són productes inespecífics de la PCR.

Phylogenetic analysisNeighbor joining, pair wise deletion,

1000 bootstrap replicates

Ia

Ib

II

III

Ruiz-Rueda et al. 2009. FEMS Microbiol Ecol 67:308-319

[ Participants i agraïments

Olaya Ruiz-RuedaArantxa García-LledóAriadna Sanz-VilarLluís Bañeras

Sara Hallin

Aquest treball s’ha finançat amb un contracte de col·laboracióentre el CCB i la UdG i amb el projecte de recerca Ref. CGL2006-02382 de l’actual Ministeri de Ciència i Innovació.

Jordi SalaLluís Sala

[ Estructura de la comunitat: Desnitrificants

NO3– NO2

– NO N2O N2

Aproximació molecular a l’estudi de la diversitat microbiana

• Reaccions enzimàtiques cap a productes gasosos (NO i N2)

• Especificitat enzimàtica

• Bases de dades molt complertes

nirK

nirS

nosZ

Nitrit reductases

Oxid nitrós reductasa

[ Estructura de la comunitat: Desnitrificants

Bacteris desnitrificants. Bacteris que contenen nitrit reductases depenent de citocrom (nirS)

•Mostres de 2004 i 2005 (estiu)

•L’anàlisi revela una elevada heterogeneitat, malgrat que les mostres semblen agrupar-se en funciódel temps

EFECTE DE LES VARIABLES AMBIENTALS?

NMS plot based on Sorensen indexT-RFLP based analysis. AluI, MspI, HhaI digestions(Ruiz-Rueda et al. 2009. Ecol. Eng. Submitted)

[ Estructura de la comunitat: Desnitrificants

NH4+ NO2

– NO3–

Aproximació molecular a l’estudi de la diversitat microbiana

amoA

16S rRNA

Amoni monooxigenasa subunitat A

Marcador filogenètic. Grup metabòlic molt compacte