INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO DE VACUNAS PARA SALMONES:

LA EXPERIENCIA DE LABORATORIO CENTROVET

TALLER: “Hacia una estrategia de control de Piscirickettsiosis (SRS) “

26 – 27 julio 2006 – Puerto Montt – Chile

M.V. Miguel Arriagada P.Jefe Área Biológicos

Laboratorio Centrovet Ltda.

ORGANIGRAMA ÁREA BIOLÓGICOSM.V. MIGUEL ARRIAGADA

PLANTA DE PRODUCCIÓN

(M.V. M. ARRIAGADA)

CONTROL DECALIDAD

(B.Q. LUIS VELÁSQUEZ)

INVESTIGACIÓN YDESARROLLO

(M.V. CELIA MULLER)

ÁREAS DE ENSAYOS

(M.V. PAULA AEDO)

PECESB.M. T. JACKOVLJEVIC

PhD. JAIME TOBAR

AVESM.V. CONSTANZA ESPIÑEIRA

CERDOSPhD. P. VILLALOBOS

LÍNEAS DE DESARROLLO ENLÍNEAS DE DESARROLLO ENVACUNAS VETERINARIASVACUNAS VETERINARIAS

ÁREA AVESÁREA AVES�� Bacterianas: Bacterianas:

-- SalmonellaSalmonella enteritidisenteritidis-- E. E. colicoli-- HaemophillusHaemophillusparagallinarumparagallinarum

�� Mixtas: Mixtas: -- EDS + BI + NDEDS + BI + ND-- E. E. colicoli + Hepatitis cuerpos inclusión+ Hepatitis cuerpos inclusión

LÍNEAS DE DESARROLLO EN LÍNEAS DE DESARROLLO EN VACUNAS VETERINARIASVACUNAS VETERINARIAS

ÁREA CERDOSÁREA CERDOS�� Bacterianas: Bacterianas: -- LawsoniaLawsonia intracelularisintracelularis-- Micoplasma Micoplasma hyopneumoniaehyopneumoniae-- HaemophillusHaemophillus parasuisparasuis-- StreptococcusStreptococcus suissuis-- ActinobacillusActinobacillus pleuropneumoniaepleuropneumoniae

�� Virales: Virales: -- ParvovirusParvovirus porcinoporcino

�� Mixtas: Mixtas: -- ParvovirusParvovirus + + LeptospirosisLeptospirosis + Erisipela+ Erisipela-- E. E. colicoli + + ClostridiumClostridium

LÍNEAS DE DESARROLLO ENLÍNEAS DE DESARROLLO ENVACUNAS VETERINARIASVACUNAS VETERINARIAS

ÁREA PECES ÁREA PECES �� Bacterianas: Bacterianas: -- VibrioVibrio ordaliiordalii

-- FlavobacteriumFlavobacterium PsychrophilumPsychrophilum-- CocáceasCocáceas GramGram positivaspositivas-- PiscirickettsiaPiscirickettsia salmonissalmonis (SRS)(SRS)

�� Virales: Virales: -- Necrosis Pancreática Infecciosa (IPN)Necrosis Pancreática Infecciosa (IPN)

S.O.PS.O.P.: PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS .: PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTANDARIZADOS EN TODASESTANDARIZADOS EN TODAS

LAS ÁREAS DE TRABAJOLAS ÁREAS DE TRABAJO

Desarrollo de una vacuna contrael Síndrome Rickettsialde los Salmonídeos

Elementos necesarios para eliminar un patógeno intracelular obligado

MacrófagoLinfocitos T

CD8+Destruye las

células infectadas

Sistema Inmune InnatoRespuesta rápida, poca duración

Sistema Inmune AdquiridoRespuesta lenta, durable

CD4+Ayuda a activar CD8+

y Linfocitos B

Linfocitos B

Secretoras de Anticuerpos

PNAS 99: 13711, 2002

PNAS 101: 7369, 2004

www.fisheries.go.th

Neutrófilos

Fish Shell Immunol10: 695, 2000

…y otros

Destruye microorganismosActiva Linfocitos T

Destruye microorganismos

Estrategias en desarrollo para una vacuna eficiente

OBJETIVOS

1. Potenciar la respuesta inmune innata:Generar una mayor capacidad de reconocimiento y destrucción del patógeno

2. Inducir respuesta inmune adquirida: Eliminar un patógeno específico y con alta eficiencia

ESTRATEGIAS

I- Vacuna BacterinaII- Vacuna Bacterina PotenciadaIII- Vacuna Recombinante.

Estrategias en desarrollo para una vacuna eficienteI. Bacterina

P. salmonispurificada

Activación de Linfocitos T

Sistema Inmune InnatoAumenta capacidad

de eliminar el patógeno

Sistema Inmune AdquiridoExpansión de linfocitos T y B específicos

Liberación de restosbacterianos

Activación de linfocitos B y secreción de anticuerpos

Inmunidad específicacontra P. salmonis

Estrategias en desarrollo para una vacuna eficienteI. Bacterina

1. Purificación de P. salmonis:

Es fundamental obtener la bacteria con la mayor concentración y en un alto grado de pureza.

Microscopía electrónica

2. Evaluación de respuesta inmune innata:

Si existe una respuesta inmune innata adecuada, se favorecerá la respuesta inmune específica

0

0,050,1

0,15

0,20,25

0,3

0,350,4

0,45

Bacterina Control

Res

peu

sta

Oxi

dat

iva

3. Evaluación de respuesta inmune específica:

Estudios en proceso

PRODUCCIÓN DE ANTÍGENO RICKETTSIAL EN DIFERENTES SUSTRATOS

- Es importante escoger el sustrato más adecuado, paraobtener antígeno en la mayor cantidad y calidad.

- Cultivo en células CHSE-214 y otras líneas de peces.

- Cultivo en células de insecto Sf-21.

- Cultivo en huevos embrionados SPF (Specific Pathogen Free).

Cultivo en células CHSE Cultivo en células CHSE -- 214214

�� Línea obtenida de salmón (Línea obtenida de salmón (ChinookChinook salmonsalmonembryoembryo).).

�� Es la línea actualmente más usada. Es la línea actualmente más usada. �� Su cultivo esta bien estandarizado, pero no se Su cultivo esta bien estandarizado, pero no se

obtienen altos títulos de la bacteria.obtienen altos títulos de la bacteria.�� Existen otras líneas usadas Existen otras líneas usadas

como la RTGcomo la RTG--2, CHH2, CHH--1, 1, EPC, etc. EPC, etc.

Cultivo en células Cultivo en células SfSf-- 2121�� Línea de insecto (Línea de insecto (SpodopteraSpodoptera frugiperdafrugiperda).).�� P. s. replica con mayores títulos.P. s. replica con mayores títulos.�� Las enfermedades Las enfermedades RickettsialesRickettsiales en vertebrados en vertebrados

superiores se caracterizan por utilizar vectores superiores se caracterizan por utilizar vectores artrópodos. artrópodos.

�� Muchas Muchas RickettsiasRickettsias son son capaces de desarrollarse capaces de desarrollarse al interior de insectos (células al interior de insectos (células intestinales y g. salivales).intestinales y g. salivales).

Cultivo en huevos Cultivo en huevos embrionadosembrionados

�� Se utilizan huevos SPF.Se utilizan huevos SPF.�� Distintas vías de inoculación, principalmente Distintas vías de inoculación, principalmente

saco saco vitelinovitelino..�� Para otras Para otras RickettsiasRickettsias se recomienda disminuir la se recomienda disminuir la

temperatura de incubación. temperatura de incubación.

Estrategias en desarrollo para una vacuna eficienteII. Bacterina Potenciada

Adición a la bacterina de elementos capaces de activar el sistema inmune de una forma fuerte, duradera, y sin efectos secundarios

P. salmonispurificada

+ POTENCIADOR

Activación de Linfocitos T

Activación de linfocitos B y secreción de anticuerpos

Inmunidad específicacontra P. salmonis

� Selección de proteínas de importancia en la patogenicidad de P. salmonis

Estrategias en desarrollo para una vacuna eficienteIII. Vacuna Recombinante

Vacuna consistente en proteína(s) presente(s) en P. salmonis, las cuales permiten un reconocimiento específico por parte del sistema inmune.

� Clonamiento del gen candidato en vector de expresión.

• Optimización de expresión y purificación de proteínas candidatasdesde E. coli. En proceso.

• Evaluación de respuesta inmune en peces. Por realizar.

Gencandidato

Proteínade Interés

Análisisde secuenciaaminoacídica

Optimizaciónde secuencia

de ADN Amplificación por PCRdel gen

candidato

Importancia de la formulación Importancia de la formulación final de la vacunafinal de la vacuna

�� Debe hacerse un estudio acabado del % de los componentes Debe hacerse un estudio acabado del % de los componentes de la vacuna final.de la vacuna final.

�� Debe estudiarse la dosis más conveniente.Debe estudiarse la dosis más conveniente.�� Debe considerarse el uso de un buen producto adyuvante o Debe considerarse el uso de un buen producto adyuvante o

emulgente.emulgente.�� Es importante la tecnología usada Es importante la tecnología usada

para realizar la emulsión:para realizar la emulsión:-- EquipoEquipo-- TemperaturaTemperatura-- Tiempo Tiempo -- VelocidadVelocidad

Estudios inEstudios in--vitrovitro y en terrenoy en terreno�� Una vez concluida la vacuna lo más importante es Una vez concluida la vacuna lo más importante es

evaluar 4 aspectos: evaluar 4 aspectos:

11-- La seguridad e inocuidad de la vacuna. La seguridad e inocuidad de la vacuna.

22-- La eficacia de la vacuna.La eficacia de la vacuna.

33-- La estabilidad de la vacuna.La estabilidad de la vacuna.

44-- Seguimiento de los resultados en el tiempo.Seguimiento de los resultados en el tiempo.

1. Nuestro trabajo esta orientado a entender la respuesta inmune de los peces frente a patógenos de importancia productiva, y de difícilcontrol como es Piscirickettsia salmonis.

2. Los resultados preliminares sugieren que nuestros productos son capaces de inducir un reconocimiento de P. salmonis, iniciándose los mecanismos orientados a su eliminación.

3. El trabajo de Investigación y Desarrollo de una vacuna involucra probar todas las alternativas posibles, con resultados exitosos y otros defectuosos.

4. Para encontrar soluciones efectivas contra la Piscirickettsia salmonis, es imprescindible el trabajo conjunto entre la empresa privada, los centros de investigación (Universidades) y los Productores.

MUCHAS GRACIAS…..