Mejoramiento genético

MAS ( SelecciónAsistida por Marcadores)

5- Mejoramiento genético

3- Diversidad

1° - Mutación

1960

2 ° - Recombinaciónnatural (ó dirigida)

4- Selección

- Variación

- Hibridación

MAS: ( SelecciónAsistida porMarcadores)

- Enzimas de restricción

- Recombinaciónartificial:

Ingeniería genética:

(Construcciones genéticas: ADN recombinante)

- Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR):

replicación “in vitro”

Biol. (Mgter) Laura Torres

- Genéticos

- Moleculares

Gen de interés agronómico

Locus “marcador”

* Marcadores genéticos*

Biol. (Mgter) Laura Torres

Huellas……. Huellitas……

.

Marcador genético

- Herencia mendeliana clásica- Polimórfico - Codominante - No epistático - Sin influencia ambiental

Características deseables de un marcador

Biol. (Mgter) Laura Torres

Ingeniería Genética: (Recombinación Artificial)

Marcadores Genéticos y Moleculares

Biol. (Mgter) Laura Torres

Mejoramiento genético

Cruzamientos dirigidos….Hibridación, Recombinación …..y Selección

Hibridación con “sondas”

RFLPs

Amplificación por PCR

- Morfológicos

- Isoenzimáticos

Secuencias nucleotídicas “codificantes”

- Moleculares Secuencias nucleotídicas “codificantes” y “no codificantes”

Cebada

sex1 1cM ms 9

sex1 ms 9

Y 5 cM ms1

Y ms1

MaízMarcadores Morfológicos

- loci de expresión temprana

Biol.(Mgter) Laura Torres. Fac. Cs. Agropecuarias. UNC

Loci marcador:Endosperma blanco Loci de interés:

Androesterilidad (ms1)

Loci marcador:Endosperma arrugado

Loci de interés:Androesterilidad (ms9)

Biol. (Mgter) Laura Torres

Mejoramiento genético

Marcadores morfológicos: controlados por un solo loci y presentan expresión temprana

a) En Brassica:

Loci marcador: primera hoja vellosa

b) En maíz:

Loci marcador: raíz primaria ó coleoptilo púrpura

Loci con carácter de interés:

Haploidía

Biol. (Mgter) Laura Torres

Mejoramiento genético: SelecciónAsistida porMarcadores(MAS)

Mapa genético(Marcadores morfológicos)

enanoalto

pubescenteliso

normal

moteadaonormal

necrosisnormal

Infloresc compInfl. simple

Lycopersicum esculentum (2n= 24)

Biol. (Mgter) Laura Torres

Detección de marcadores

MetodologíaElectroforesisEquipoTecnología de los marcadores Interpretación de las combinaciones de bandasVentajas y desventajas

Tratamiento del material vegetal

Electroforesis en geles de almidón, de acrilamida ó capilar (cromatógrafos)

Tinción histoquímica, química, fluorocromos

Análisis de los patrones de bandas ó cromatogramasBiol. (Mgter) Laura Torres

MARCADORES Isoenzimáticos :

MARCADORES Isoenzimáticos :

MARCADORES Isoenzimáticos :

MARCADORES Isoenzimáticos :

MARCADORES Isoenzimáticos :

MARCADORES Isoenzimáticos :

MARCADORES Isoenzimáticos :

- Polimorfismo a nivel del producto génico (polipéptido o proteína)

MARCADORES Isoenzimáticos :

Biol.(Mgter) Laura Torres.

Ventajas

- Técnica consistente, reproducible y bajo costo- Co dominantes- Estudios de

diversidad parámetros poblacionales mapas genéticos

Desventajas

- Bajo número de sistemas de tinción para detectar enzimas- Análisis basado en el fenotipo- Inapropiados para MAS (ej: Tomate: el loci Mi controla la resistencia nemátodes está ligado al loci de la fosfatasa ácida

El loci para androesterilidadestá ligado a una fosfatasaBiol. (Mgter) Laura Torres

- Genética de poblaciones - Conservación ex situde germoplasma- Evolución de especies cultivadas (evaluar la diversidad genética de las poblaciones locales de Allium sp, mediante isoenzimas)- Evaluación y caracterización de germoplasma (evaluar la diversidad genética y la estructura de una colección de base de Arachis spp)- Erosión genética- Flujo de genes - Estabilidad genética en bancos de germoplasma (evaluar la diversidad genética de las entradas de semilla de ….spp,conservadas y suministradas por jardines botánicos europeos

Aplicaciones

Biol. (Mgter) Laura Torres

Ingeniería Genética: (Recombinación Artificial)

Marcadores

Biol. (Mgter) Laura Torres

Mejoramiento genético

Cruzamientos dirigidos….Hibridación, Recombinación …..y Selección

Hibridación con “sondas”:

RFLPs

Amplificación por PCR

- Morfológicos

- Isoenzimáticos

Secuencias nucleotídicas “codificantes”

- Moleculares Secuencias nucleotídicas

“no codificantes” y “codificantes”

Biol. (Mgter) Laura Torres

Mejoramiento genético: Marcadores Moleculares

- Microsatélites ó SSR:

Simple Sequence Repeats

- CAPS:

Cleaved Amplified Polymorphic Sequence

- SCARs:

Sequence Characterised Amplified Region

- STSs:

Sequence-Tagged Sites

- ESTs:

Espressed Sequence Tags

- EST - SSRs:

Espressed Sequence Tags of SSRs

- SNPs:

Single Nucleotide Polymorphism

Información previa de la secuencia: NO

- RAPDs:

Random Amplified Polymorphic DNA

- RFLP:

Restriction Fragment Lenght Polymorphism

- AFLPs:

Amplified Fragment Lenght Polymorphism

- SAMPLs:

Selective Amplification of M icrosatellite Polymorphism

- ISSRs: Inter-Simple Sequence Repeats

- Minisatélites ó VNTRs

Información previa de la secuencia:

SI

Biol. (Mgter) Laura Torres

Biol.(Mgter) Laura Torres.

Enzimas de restricción:

Digestión (ó corte) de la doble cadena de ADN

Endonucleasas: enzimas de restricción

AluIArthrobacter luteus: AG´CT

TC´GA Sitio de restricción (palíndromo)

BamHIBacillus amyloliquefaciens: G´GATCC

CCTAG´GSitio de restricción (palíndromo)

Biol. (Mgter) Laura Torres

Marcador molecular de tipo:

RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms)

1- Digestión

2- Electroforesis

3- Transferencia a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa)

4- Hibridación con “sondas marcadas”

5- Lavados

6- Revelado

Biol. (Mgter) Laura Torres

1- Basados en la amplificación del ADN (PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa)

(Numerosos sistemas)

2- Basados en la digestión con endonucleasas (enzimas de restricción) :

RFLPs (Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricciòn)

*MARCADORES MOLECULARES - Polimorfismo genético a nivel del DNA

Biol.(Mgter) Laura Torres.

Marcador molecular

RFLPs (RestrictionFragmentLenghtPolymorphisms)

Biol.(Mgter) Laura Torres.

5’…ATAAAAAGTTATACTATTCCAAATGATTGTCCTGTGGTATGTAATTCTATTCCTCGTAAACCTAACTTATCTTTGATGTTTATTAGAGCAATATTAGTTATTATGTTAATTAAAGATTATAGTGAAATTAAAGAAACACCAATTTATCAGCAACAACTTGAATTAGAAGATCCTGCGCGCAACGCCTGTCTTGTAACTGATAGTGGAATTCGAACTGAGCTGCAAAATGAACCAGTTACTGTACCAGTAACTCTTCCAACTTTGCCGACTTTTTCAAGTCCTAAAAATTAATCCTGTTAATTCATGTCAATTACGCGATTGCATAAGATGAGTTGTTTTAATGGATAGTGAGCGCCACTATGAATATGGTTCGTATTCAAACTCTCATGGCATTGAATTTGATCCAAATCACCCTTACATTGATTTGATTAACGATGATTTCGATGAAAATGATTATCTTGATCTCGAGACGTTAAATCTTGAAGCTGATTATGATGATGTTGAAAGTTTAGCTCTTAGGCTTAAAAATGCTCCTGACTACACTACTGAGATATTCGAGAAAATAGATAGAATACCAAACTTTGCGAGTTACAGATACTTCAGATGAGTTTTATACTTTAAGTTCGATGTTAACCGAGCATATGCAATCAATAATTACATTGCTTCCCAGTATACTATGGCCAATGGTCAGTCAGTTAACCAAATCTAATGTATTTCAAGCTGCAGACGATGTTAATATTACTAATTATTGGCGTTTGATGGACAGAAGATGGGATTTTATCGATGAACAGTTGAGAGTTCAATTTATTTTTAGAGCTTATGACTTGCGAGCGTATCAAAACGAGCGTGTGTCTCAAATTCTTTCTAGCAGTTTATTATTTGCTGGATTAAATCTAAT

TGG……….3'

pb

900

692

208

secuencia de ADN de 900 pb

Eco RI : (1 sitio de corte)

GAATTC

- Enzima EcoRI

- Buffer

- H2O

Biol. (Mgter) Laura Torres

Enzimas de restricción

Segregación Mendeliana de alelos marcadores de tipo molecular (Ej. RFLP, SSR)

Biol.(Mgter) Laura Torres.

Ingeniería Genética: (Recombinación Artificial)

Marcadores Genéticos

Biol. (Mgter) Laura Torres

Mejoramiento genético

Cruzamientos dirigidos….Hibridación, Recombinación …..y Selección

Basados en hibridación con sondas: RFLPs

Basados en la amplificación por PCR

- Morfológicos

- Isoenzimáticos

Secuencias nucleotídicas “codificantes”

- Moleculares Secuencias nucleotídicas

“no codificantes” y “codificantes”

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Biol. (Mgter) Laura Torres

Replicación “in vivo” del DNA

* Helicasa

* Proteínas de unión a cadena sencilla (SSBP)

* Topoisomerasa ADN girasa

* Iniciación de la síntesis

* ADN polimerasa III

* Primasa, ARN polimerasa

* ADN ligasa.

* Corrección : polimerasas I y III

Biol.(Mgter) Laura Torres.

Replicación natural del ADN

Biol.(Mgter) Laura Torres.

REPLICACIÓN NATURAL DEL DNA

Reacción en Cadena de la PolimerasaPCR….(Replicación “in vitro” de un fragmento de ADN ó ARN)

Biol. (Mgter) Laura Torres

Cebador

Biol. (Mgter) Laura Torres

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

NucleótidosAgua

Enzima Taq-polimerasa

Cebadores Buffer y Mg+ +

ADN molde

Muestra de tejido

Extracción de ADN

Termociclador

Millones de copias (10 6)de un fragmento de ADN

Electroforesis: visualización del fragmento de ADN amplificado a partir de los cebadores

Biol. (Mgter) Laura TorresBiol. (Mgter) Laura Torres

Reacción en Cadena de la PolimerasaPCR (Polimerase Chain Reaction)

Biol. (Mgter) Laura Torres

Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que, tras la amplificación, resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado

Condiciones de amplificación del DNA

1º Etapa:Desnaturalización

94ºC 30s a 2 min

2º Etapa:Hibridación de cebadores

35-60 ºC 15-120seg

3º Etapa:Polimerización

68-72ºC 30-150seg

Etapas 1 a 3: 25-45 ciclos ó repeticiones

Polimerización Final:5min

68-72ºC

Desnaturalización Inicial:5min95ºC

Termociclador

Biol. (Mgter) Laura Torres

Mejoramiento genético: SelecciónAsistida porMarcadores(MAS)

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Biol.(Mgter) Laura Torres.

Etapas para la reacción de PCR

Los pasos 2 a 4 se repiten 30-35 veces e incrementan más de 106 veces el fragmento de DNA de interés

Biol.(Mgter) Laura Torres.

RAPDs(Random Amplified Polymorphic DNAs)

Base genética

Biol.(Mgter) Laura Torres.

Base genética de marcadores tipo RAPDs

Biol.(Mgter) Laura Torres. Fac. Cs. Agropecuarias. UNC

-

+

Biol. (Mgter) Laura Torres

Variedades de olivo : Frantoio y Oblonga ¿Sinonimia?

Electroforesis de marcadores RAPDs

Biol.(Mgter) Laura Torres.

MARCADORES GENÉTICOS MOLECULARES “ BASADOS EN LA PCR

(Replicación “in vitro” del DNA )

5´- AT AT AT AT AT AT AT – 3´

Microsatélites (SSR: Single Sequence Repeat)

Cebador 1

Cebador 2

Cebador 3

Cebador 1

Cebador 2

Cebador 3

Región de longitud variable (microsatélite)

Región de secuencia conservada

Región de secuencia conservada

5´- GTC GTC GTC GTC GTC – 3´

5´- CGAT CGAT CGAT CGAT– 3´

Biol. (Mgter) Laura Torres

Mejoramiento genético: SelecciónAsistida porMarcadores(MAS)

Base genética de marcadores tipo Microsatélite ó SSRs (Simple Sequence Repeats)

1 2 1 x 2

Biol.(Mgter) Laura Torres.

Marcadores tipo SSRs (Microsatélites)

Dinucleótidos: (AT AT ATAT) – (AT)23

Trinucleótidos: ATC ATC ATC (ATC)16

Tetranucleótidos: ACGGACGG ACGG (ACGG)22

Biol.(Mgter) Laura Torres.

-

+

Sinonimia: electroforesis de marcadores tipo SSRs en las variedades de olivo Frantoio y Oblonga

Biol.(Mgter) Laura Torres.

Fingerprinting: Variedad “Arbequina” de Olivo

oli 11 oli 12 oli 17 oli 22

1 2 3 4 1 2 3 4 M 1 2 3 4 1 2 3 4

MPM (pb)

500

400

300

200

100

Biol.(Mgter) Laura Torres.

Fingerprinting (huella genética)

Autoincompatibilidad en cerezo Prunus avium L.

Biol.(Mgter) Laura Torres.

MPM (pb)

200

1 2 3 4 5 6 7 8 9 M

Electroforesis en gel de agarosa 3%

1- Empeltre de referencia(CSIC, España);

2- Empeltre LP;

3- Manzanilla de referencia(CSIC, España);

4-Manzanilla EC;

5- Manzanilla 4S;

6- Manzanilla gigante 4S;

7- Picual de referencia;

8- Nevadillo EC;

9- Nevadillo 4S;

M: 100 pb. DNA ladder (Sigma).

Biol.(Mgter) Laura Torres.

IAS oli 12

IAS oli 17

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Análisis de diversidad

Mejoramiento genético:

SelecciónAsistida porMarcadores(MAS)

Plantas con genotipo aa

Selección: plantas homocigotas m/m”

Análisis por PCR: cebadores para el loci M/ m

Extracción de ADN

Loci A/a(genotipo de interés: aa).

LocimarcadorM/m

Genotipo mm Mm MM mm MM

Cebador

Cebador

M m

A a

Biol. (Mgter) Laura Torres

Peritaje forense

Biol. (Mgter) Laura Torres

Biol.(Mgter) Laura Torres.

Electroforesis capilar: resolución de marcadores microsatélites (SSRs): tamaño en pares de bases

1000750

1 2 3 4 5 6 7

870 pb

M M1 M2 M3 M4 TE TS

Detección del agente causal del “maize bushy stunt”

Microfotografía electrónica de fitoplasmas

Planta sintomática de maíz

CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence

1- Amplificación por PCR

2- Digestión con enzimas de restricción

3- Electroforesis

Biol. (Mgter) Laura Torres

HaeIII RsaI

Figura 1. RFLP analysis of 1.2-kb PCR products (R16F2/R16R2 primers) of 16S rRNA genedigested with HaeIII (A) y RsaI (B) restriction enzymes S, 100 bp.ladder (Promega), fragment size (bp) from

Regiones genómicas evolutivamente conservadas

AluI

Figura 3. AluI restriction profile of a phytoplasmal tuf gene fragment amplified with primer pair fTufAy/rTufAy . Phytoplasma strain abreviations : AAY (American aster yellows), ACLLcba, ACLLctes y ACLLjun (Argentinian catharanthus little leaf), ChamAY (Chamomilla aster yellows), MBS (Maize bushy stunt) y DauAY (Daucus aster yellows). S, 100 bp ladder (Promega).

Taxonomía y filogenia de Fitoplasmas

Regiones genómicas mas variables

CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence

Biol. (Mgter) Laura Torres

NlaIII

RsaI

Tsp509I

TaqI

MseI

(CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence

Biol. (Mgter) Laura Torres

AY1 (16SrI-B)

Maryland aster yellows (16SrI-B)

SAY (16SrI-B)

MBS (16SrI-B)

PRIVC (16SrI-B)

AV2192 (16SrI-L)

IOWB (16SrI-N)

OAY (Ca. Phytoplasma ateris)

PaWB (16SrI-D)

AVUT (16SrI-M)

RapePh (16SrI-C)

Valeriana rrnA (16SrI-M)

ACLLcbaI

ACLLctes

ACLLcbaII

ChamAY

Soybean purple stem (16SrI-O)

SPS (16SrI-O)

ChLL (16SrI-Q)

Valeriana rrnB (16SrI-M)

Alfalfa stunt (16SrI-B)

THP Ca. Phytoplasma licopersicy

STRAWBERY multiplier (16SrI-K)

BBS3 (16SrI-E)

Blueberry stunt (16SrI-E)

Carrot proliferation (16SrI-A)

Oat proliferation (16SrI-A)

HYDP (16SrI-A)

BB (16SrI-A)

STRAWBERY phylloid fruit (16SrI-R)

CPh rrnA (16SrI-C)

KVG (16SrI-C)

CPh rrnB (16SrI-C)

KVE (16SrI-C)

ACLR AY 16SrI-F

CVB (16SrI-F)

MPV

JHP (Ca. Phytoplasma japonicum)

AusGY (Ca. Phytoplasma australiense)

Stolbur

A laidlawi

A palmae

96

81

69

100

100

99

74

63

48

95

65

90

73

72

65

59

57

55

42

10036

2238

17

32

21

6

3

0 .001

Figura 6. Phylogenetic tree constructed by the neighbour-joining method of 16S rRNA gene sequences from 31 phytoplasmas 16SrI -aster yellows representative subgroups strains, other related 16Sr phytoplasmas groups, and A. palmae y A. laidlawi as the outgroup. The numbers on the branches are bootsatrap (confidence) values. GenBank accessions numbers of phytoplasmal 16S rRNA gene sequences: AY1 (Maryland aster yellows) AF322644; SAY (Severe aster yellows) M86340; MBS (Maize bushy stunt) AY265208 ; PRIVC (Primose virescence) AY265210; AV2192 (Aster yellows phytoplasma) AY180957; IOWB (Ipomea obscura witche´s -broom) AY265205; OAY (Ca. Phytoplasma asteris) M30790; PaWB (Paulownia witche´s -broom) AY265206; AVUT (Aster yellows phytoplasma) AY265209, *, strains sequenced in this study. Bar represents 1 substitution in

1000 nt.

Biol. (Mgter) Laura Torres

Análisis filogenético

Marcador SCARS

Sequence Characterized Amplified Regions

Biol.(Mgter) Laura Torres.

En tomate:Marcador asociado a resistencia a Verticillium (loci Ve/ve).

SNPs (SingleNucleotidePolimorphism)

Biol. Mgter. Laura Torres

AFLPs RFLPs RAPDs SSRs (Microsatélites)

Ensayo de de detección

Rápido Lento Rápido Rápido

Reproducibilidad Alta Alta Baja Alta

Tipo de marcador Co-dominante ó dominante*

Co-dominante Dominante Co-dominante

Información sobre la secuencia

No No No Si

* según el análisis se realice mediante softwere o visualmente

Biol. (Mgter) Laura Torres

Biol.(Mgter) Laura Torres.

1: valor mas bajo5: valor mas altoDom: dominanciaCod: codominancia

Utilidad de los marcadores genéticos y moleculares1- Fingerprinting (huella genética: Identidad)

2- Conservación y Uso de Recursos Genéticos:

- Construcción de colecciones nucleares (bancos de germoplasma)

- Relaciones filogenéticas

- Identificación de germoplasma elite

3- Mapas Genéticos

3- Diversidad y Estructura Genética:

- Nivel de heterocigosidad

- Frecuencias génicas y genotípicas

4- Diagnóstico: salud humana, animal, fitopatología

6- Agroindustria

7- Peritajes forenses

Biol. (Mgter) Laura Torres

Mejoramiento genético

7- Conocimiento y Uso del Sistema Reproductivo:

- Grado de alogamia.

- Sistema de incompatibilidad.

- Identificación temprana del sexo del organismo.

8- MAS (Selección Asistida por Marcadores):

Resistencias a factores bióticos yabióticos

- Grado de introgresión

- Desarrollo de líneas puras.

- Protección legal: obtenciones de genotipos de propagación agámica . Mejora de caracteres cuantitativos (QTLs: Quantitative trait loci

Métodos de selección: (detección de genotipos superiores)

Convencional Vs ¿…?

Asistida por marcadores (MAS)

Costo - beneficio

-Fácil identificación de fenotipos segregantes

- Esquemas de retrocruzamientos: observación visual de fenotipos a campo y análisis de tejidos en laboratorio.

- Expresión tardía del carácter de interés.

- Proyecto privado o público? Tiempo de retorno.

- Costo de implementación: en disminución.

- Efectividad: en incremento. Influenciada por factores ambientales y epigenéticos.

- Esquemas de retrocruzamientos: rápida y certera identificación de individuos con el genoma recurrente.

↑ grado de precisión

↑ tasa de progreso

↓ tiempo de obtención del producto.

- MAS no es la “LA” solución …….

Convencional

y ¿…?Asistida por marcadores (MAS) Mayor evidencia empírica

Biol.(Mgter) Laura Torres.

Empresas biotecnológicas

Agricultura:

Caracterización de genotipos

Diagnóstico de patógenos

Análisis del control genético de caracteres cuanti y cualitativos

Mejora genética

Identificar MM ligados a caracteres de interés

Retrocruzamientos asistidos por MM

Cadena Agro-alimentaria:cuantificación y seguimiento de materia prima en productos elaborados

Cs. Biológicas:

Desarrollos tecnológicos para detección de variaciones cuanticualitativas de ADN y proteínas

Empresas producción y servicios agropecuarios

Empresas de servicios para industria agro-alimentaria

Perspectiva de los Marcadores Moleculares

Biol. (Mgter) Laura Torres