Post on 12-Feb-2015
IDENTIFICACIÒN demicroorganismos
específicos
Durante el proceso de fabricación, almacenamiento y uso, los medicamentos no estériles son susceptibles de contaminarse con diversos microorganismos.
Representa un riesgo para la salud del usuario.
Conlleva a que el producto deteriorado no sea apto para ser usado.
Es por ello, que las materias primas y los productos farmacéuticos terminados, deben ser sometidos a un análisis microbiológico.
Para demostrar que cumplen con ciertas especificaciones establecidas por los organismos oficiales, con el fin de garantizar que los productos son adecuados para el uso al que están destinados.
El control microbiológico de las materias primas y de los productos farmacéuticos no estériles, involucra la realización de dos tipos de ensayos: Recuento total de
bacterias aerobias mesófilas y/o recuento de mohos y levaduras. Investigación de
indicadores específicos.
Escherichia coliStaphylococcus
aureusSalmonella sp.
Pseudomonas sp.
La FEUM (2012) establece la búsqueda de moo epecíficos que son indeseables en las
preparaciones farmacéuticas.
No se incluyen a todos los patógenos posibles.
Ejemplo
La categoría de medicamentos orales que contienen antibiótico deben cumplir las siguientes características microbiológicas:
- No mas de 100 UFC en 1g o en 1 ml.
- No Pseudomonas aeruginosa.
- No Staphylococcus aureus.
- No Enterobacterias.
- No Candida sp
Algunas cepas
pueden
mantener su
viabilidad
durante 200
días en la tierra
y 300 en polvo
Algunas cepas
pueden
mantener su
viabilidad
durante 200
días en la tierra
y 300 en polvo
objetivo
Conocer e identificar a los moo objetables que sirven de indicadores de contaminación en productos farmacéuticos no estériles mediante su siembra en medios diferenciales y selectivos y pruebas bioquímicas.
PROCEDIMIENTO
Sembrar las cepas tipo en
placas de AST. Incubar 24h a
37ºC
Realizar frotis de cada cepa y
teñir por la técnica de Gram
A partir del crecimiento
obtenido sembrar en los medios de cultivo selectivos y/o diferenciales para cada moo
Incubar a 37ºC durante 18-24 h
Revisar morfología
colonial característica en cada medio
Realizar la lectura de las
pruebas bioquímicas.
Se trabajará
con cepas
de
referencia
para cada
moo.
S. aureusS. aureus P. aeruginosa
P. aeruginosa
Salmonella sp.
Salmonella sp. E. coliE. coli
SIEMBRA EN MEDIOS SELECTIVOS U DIFERENCIALESSIEMBRA DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Baird ParkerBaird Parker
Sal manitolSal manitol
Vogel JohnsonVogel
Johnson
CetrimidaCetrimida
Ps PPs P
Ps FPs F
Verde brillanteVerde
brillanteXLDXLD
Sulfito de Bismuto
Sulfito de Bismuto
Mc ConkeyMc Conkey
EMBEMB
Catalasa
Catalasa
Coagulasa
Coagulasa
ManitolManitol
Catalasa
CatalasaOxidasa
Oxidasa
CatalasaCatalasa
TSITSI
SIMSIM
VPVP
CSCS
Catalasa
CatalasaTSITSI
SIMSIM
VPVP
CSCS
Staphylococcus aureuscocos gram positivos, anaerobios faciltativos,
agupación en racimosfactor de cuagulación y agregación, no son móviles.
Medios de cultivo:•Baird Parker•Vogel Jhonson•Agar sal y manitol
Pruebas bioquímicas:•Catalasa•Coagulasa•Manitol
Baird Parker
Medio selectivo y diferencial para el aislamiento y recuento de estafilococos coagulasa positiva.
Selectivo debido al telurito de potasio y al cloruro de litio, los cuales inhiben el desarrollo de la flora acompañante.
Los estafilococos coagulasa positiva reducen el telurito a teluro y originan colonias de color grisáceo-negro, y dan reacción sobre la yema de huevo produciendo alrededor de la colonia una zona opaca que a menudo tiene una zona clara mas externa.
Vogel Jhonson
Los estafilococos coagulasa positivo, fermentan el manitol, produciendo un viraje del indicador de pH a color amarillo, y también reducen el telurito a teluro.
Medio utilizado para la rápida detección de estafilococos coagulasa positivo fermentadores de manitol.
Diferencial: manitol, carbohidrato fermentable. Rojo fenol, indicador de pH.
Selectivo: telurito, el cloruro de litio y la alta concentración de glicina, inhiben el desarrollo de la flora acompañante.
Agar sal y manitol
Medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina.
Manitol como carbohidrato fermentable
Rojo fenol es el indicador de pH
Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o púrpura.
Pseudomonas aeruginosabacilos gram negativos, móvil con flagelo(s)
polar(es), aerobio estricto .
Medios de cultivo:•Agar cetrimida•Agar Ps P•Agar Ps F
Pruebas bioquímicas:•Oxidasa•Catalasa
Agar cetrimida (Cet)Selectivo: La fórmula está desarrollada para favorecer la selección de P. aeruginosa y estimular la formación de pigmentos.El cloruro de magnesio y el sulfato de potasio promueven la formación de piocianina, pioverdina y piomelanina de P. aeruginosa. La cetrimida es un detergente catiónico que actúa como agente inhibidorDiferencial: Las colonias características presentan una pigmentación verde pálido espontánea y fluorescencia verde bajo luz ultravioleta.
Agar Pseudomonas P (PsP)Diferencial: Permite el crecimiento de especies de Pseudomonas spp. en base a la producción de piocianina.
Selectivo: La glicerina favorece la producción de pigmentos, las sales de magnesio y potasio estimulan la producción de piocianina y piorrubina e inhiben la producción de fluoresceína.
Diferencial: Permite el crecimiento de especies de Pseudomonas spp. en base a la producción de piocianina.
Selectivo: La glicerina favorece la producción de pigmentos, las sales de magnesio y potasio estimulan la producción de piocianina y piorrubina e inhiben la producción de fluoresceína.
Agar Pseudomonas F (PsF)
Diferencial: Medio para el aislamiento, la detección y la diferenciación de especies de Pseudomonas spp. en base a la producción de fluoresceína.
Selectivo: En el medio de cultivo, la tripteína y la peptona de carne aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la concentración de fosfatos estimula la producción de fluoresceína e inhibe la producción de piocianina y piorrubina.
Diferencial: Medio para el aislamiento, la detección y la diferenciación de especies de Pseudomonas spp. en base a la producción de fluoresceína.
Selectivo: En el medio de cultivo, la tripteína y la peptona de carne aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la concentración de fosfatos estimula la producción de fluoresceína e inhibe la producción de piocianina y piorrubina.
Fórmula:
Peptona20,0 g Cloruro de magnesio 1,4 Sulfato de potasio 10,0 Glicerol 10,0 Agar 15,0
Salmonella sp.Bacilo Gram negativo, móvil con flagelos perítricos.
Son aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados mesófilicos
Pruebas bioquímicas:•Catalasa•TSI •SIM•VP•CS
Medios de cultivo:•Agar verde brillante•Agar sulfito de bismuto•Agar XLD
Agar verde brillanteEl verde brillante actúa como inhibidor de bacterias Gram positivas y
de la mayoría de bacterias Gram negativasMEDIO ALTAMENTE SELECTIVO
Permite evaluar la presencia de Salmonella diferentes a la S. typhi y S. paratyphi
La lactosa y la sacarosa son los carbohidratos fermentables. El rojo de fenol es un indicador.
El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.
El agar es adicionado como agente solidificante.
AGAR XLD (XYLOSE-LYSINE-DESOXYCHOLATE)
Las colonias típicas de la Salmonella son de color rojo con el centro negro debido a la producción de H2S. Mientras que las de E. coli son grandes, amarillas con o sin precipitado de bilis.
Medio selectivo y difencial.Selectivo: utiliza el desoxicolato de sodio, inhibe los microorganismos gram positivos.
Diferencial: la xilosa se incorpora en el medio dado que la fermentan prácticamente todos los entéricos, excepto Shigella.
Sulfito de Bismuto(SB)
El sulfato ferroso actúa como indicador en la producción de sulfuro de hidrógeno que se manifiesta en el centro de la colonia por un precipitado negro y un halo negro grisáceo con brillo metálico.
Selectivo: El sulfito de bismuto y el verde brillante inhiben el crecimiento de bacterias contaminantes
Es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de Salmonella typhi y otros bacilos entéricos.
Escherichia coliBacilos Gram negativos, 2-3 µ, no esporulados, móviles, cápsulado, poseen fimbrias, flagelos perítricos, aerobios y anaerobios faculttivos.
Medios de cultivo:•Agar EMB•Agar Mac Conkey
Pruebas bioquímicas:•Catalasa•TSI •SIM•VP•CS
embSelectivo: la presencia eosina y azul de metileno inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas.
Diferencial: la lactosa y/o sacarosa, estan presentes para evaluar las bacterias fermentadoras de las no fermentadoras. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras.
Selectivo: contiene sales biliares y cristal violeta que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y de algunas Gram negativas exigentes.
Diferencial: Las bacterias fermentadoras de lactosa formas colonias de diferentes tonos de rojo. Las bacterias que no fermentan la lactosa forman colonias incoloras o transparentes. El indicador es el rojo neutro.
Agar MacConkey
Prueba de catalasa
La catalasa es una enzima que descompone al peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua.
La catalasa es una enzima que descompone al peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua.
La mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas tienen catalasa.
La mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas tienen catalasa.
El resultado es positivo si en la colonia hay efervescencia.
El resultado es positivo si en la colonia hay efervescencia. Catalasa (+):
Staphylococcus aureus, E. coli, Pseudomonas sp.
Catalasa (-): Streptococcus spp.
Catalasa (+): Staphylococcus aureus, E. coli, Pseudomonas sp.
Catalasa (-): Streptococcus spp.
Prueba de oxidasa
La reacción de la oxidasa se debe a la presencia del sistema de citocromo-oxidasa.
La reacción de la oxidasa se debe a la presencia del sistema de citocromo-oxidasa. El sistema de citocromos
está generalmente presente en organismos aeróbicos.
El sistema de citocromos está generalmente presente en organismos aeróbicos.
Se adiciona una pequeña cantidad de tetrametil-p-phenylendiamina al 1%, a un cultivo bacteriano colocado sobre un papel filtro:
Se adiciona una pequeña cantidad de tetrametil-p-phenylendiamina al 1%, a un cultivo bacteriano colocado sobre un papel filtro:
Oxidasa(+), se indica por un color púrpura obscuro en el papel, en menos de 10 seg. Ej. Pseudomona aeruginosa
Oxidasa (-), que consiste en una ausencia de color púrpura. Ej. Escherichia coli
Oxidasa(+), se indica por un color púrpura obscuro en el papel, en menos de 10 seg. Ej. Pseudomona aeruginosa
Oxidasa (-), que consiste en una ausencia de color púrpura. Ej. Escherichia coli
Se pretende comprobar la facultad de un moo de coagular el plasma por acción de la enzima coagulasa.
La coagulasa se puede encontrar en dos formas: libre y fija o ligada (unida a la pared bacteriana).La coagulasa es una enzima
con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibrinógeno en fibrina, provocando la formación de un coágulo visible.
Nos permite diferenciar Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) del resto de especies de Staphylococcus (coagulasas negativos)
Se piensa que la toxicidad de Staphylococcus aureus es debida
a la presencia de coagulasa, además de las enterotoxinas que
posee
Sirve para detectar si las bacterias son capaces de fermentar el manitol liberando productos ácidos que cambiarán a color.
Prueba del Manitol
Sirve para diferenciar Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-).
Sirve para diferenciar Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-).
agar TSIMedio diferencial, lactosa, sacarosa glucosa y producción de gas y ácido.
Al sembrar una bacteria fermentadora de glucosa se producirá un vire en todo el tubo pero al paso de mas de 16 horas incubación regresara al color rojo debido a la degradación aerobia de peptonas presentes en el medio
Si la bacteria fermenta lactosa y/o sacarosa se producirá un vire en todo el tubo el cual no podrá ser neutralizado y se vera de color amarillo.
El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la
producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la
fuente de iones Fe3+, los cuales se combinan con el
ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro,
de color negro.
Ciertas bacterias tienen la capacidad de utilizar el citrato de sodio y fosfato de amonio como única fuente de carbono y nitrógeno respectivamente; el medio tiene azul de bromotimol que cambia de verde a azul debido a la liberación de iones amonio y eliminación de citrato que generaran basificación del medio.
Citrato de Simons
Entre las enterobacterias estas características se dan en los
siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella.
Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella
paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.
Medio SIM
FundamentoEl triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac´s o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo.
Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo.