Post on 16-Oct-2020
Brechas de información cubiertas en relación al
patógeno P. salmonis :
Cepario, caracterización genómica, ubicación geográfica, ciclos, patogenicidad
Ideas y recomendaciones para vigilancia y control.
Diciembre, 2018Alvaro Labra M. MV., MSc.Pontificia Universidad Católica de Valparaísoalvaro.labra@pucv.cl
“BASES TÉCNICAS PARA LA CONSOLIDACIÓN DE
UN CEPARIO NACIONAL DE Piscirickettsia
salmonis DEBIDAMENTE CARACTERIZADO”
“ESTUDIO INTEGRAL DE LAS BASES BIOLÓGICAS
Y MOLECULARES DEL CICLO DE VIDA DE
Piscirickettsia salmonis EN EL CONTEXTO DE
UNA APROXIMACIÓN EPIDEMIOLÓGICA PARA
DESARROLLAR ESTRATEGIAS QUE PERMITAN SU
CONTROL”
2015 2016 2017 2018 Mayo 2018 Junio 2018 Diciembre 2018 Junio 2019
AGENDA
Programa Cepario
Estructura administrativa y temporal
Principales logros
Preguntas respondidas
Ciclo de Vida
Objetivos
Principales resultados obtenidos a la fecha y sus proyecciones por WP
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Definición de un procedimiento para el aislamiento de Piscirickettsia salmonis para el establecimiento de un cepario
oficial de la bacteria
Establecimiento de un cepario nacional de Piscirickettsia salmonis
debidamente caracterizado
Bases técnicas para el establecimiento de un cepario
nacional de Piscirickettsia salmonis debidamente caracterizado
Bases técnicas para la consolidación de un cepario nacional de
Piscirickettsia salmonisdebidamente caracterizado
•Dic 2015 - Jun 2016
•Sistema reproducible de aislamiento
•Aislamientos del año y recuperación de aislados del pasado
•Convenio con DSMZ para secuenciación y cierre de genomas
•Nov - Dic 2016
•Piloto para evaluar “in vivo” el rol de la salinidad en la virulencia
•Impacto de diferentes formas bacterianas en la patogenicidad
•Nov - Dic 2016 y Ene - Jun 2017
•Condiciones optimas de crecimiento “in vitro”
•Aislamientos del año y recuperación de aislados del pasado
•Caracterización genética de aislados mediante NGS
•Evaluación “in vivo” del rol de la salinidad en la patogenicidad
•Screening de potenciales vectores
•Screening de mecanismos de transmisión vertical
•Manual Operativo para el muestreo y manejo de P. salmonis
•Abril 2018 - Dic 2018
•Aislamientos del año
•Inicio de operación del cepario
•Caracterización genética mediante NGS
PROGRAMA CEPARIO
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PROGRAMA CEPARIO
Principales Logros:
• Infraestructura y equipamiento adecuado para mantener el Cepario
• Sinergia operacional entre las dos unidades espejo (PUCV – UACh)
• Adecuadas capacidades profesionales y técnicas del personal
• 186 aislados provenientes de diferentes años, zonas geográficas, genogrupos yespecies con un significativo porcentaje de caracterización
• Eficiente sistema de transferencia de material (aislados) e informaciónrespectiva
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PROGRAMA CEPARIO
Diferentes Especies / Cepas / Genogrupos o Aislados de Piscirickettsia?
Infecciones únicas o Coinfecciones por diferentes tipos de Piscirickettsia?
Adaptación a la salinidad
Adaptación a diferentes zonas geográficas? ¿Origen u Orígenes?
Adaptación a las diferentes especies de huéspedes?
Adaptación temporal?
Resistencia a antibióticos
¿Cómo podemos usar esta información para hacer un diagnóstico rápido y mejorarel manejo de la Piscirickettsiosis?
Diferentes Especies / Cepas / Genogrupos o Aislados de Piscirickettsia?
ESTATUS NUMERO
Genomas cerrados 22
Genomas en proceso de cierre 22
Genomas en proceso de secuenciación 14
Total 58
Diferentes Especies / Cepas / Genogrupos o Aislados de Piscirickettsia?
Diferentes Especies / Cepas / Genogrupos o Aislados de Piscirickettsia?
Diferentes Especies / Cepas / Genogrupos o Aislados de Piscirickettsia?
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PROGRAMA CEPARIO
Diferentes Especies / Cepas / Genogrupos o Aislados de Piscirickettsia?
Infecciones únicas o Coinfecciones por diferentes tipos de Piscirickettsia?
Adaptación a la salinidad
Adaptación a diferentes zonas geográficas? ¿Origen u Orígenes?
Adaptación a las diferentes especies de huéspedes?
Adaptación temporal?
Resistencia a antibióticos
¿Cómo podemos usar esta información para hacer un diagnóstico rápido y mejorarel manejo de la Piscirickettsiosis?
Infecciones únicas o Coinfecciones por diferentes tipos de
Piscirickettsia?
Condiciones experimentales:• Técnica de citometría de flujo.,• Cultivo en medio liquido de P. salmonis• Análisis de las poblaciones de P. salmonis tanto en fase
exponencial de crecimiento como en fase estacionaria tardía (11 días de cultivo).
• Para cada condición se analizó la población bacteriana sin filtrar y aquella filtrada por un filtro de 0,22 µm.
Resultados:• Fase exponencial de crecimiento se observa una sola población
bacteriana, la que es retenida al ser filtrada a 0,22µm. • Fase estacionaria tardía heterogeneidad en la población al
menos 3 subpoblaciones de distinto tamaño y complejidad • Post-filtración permitió identificar a la población de
microcélulas la que fue enriquecida por la filtración a 0,22µm.
Infecciones únicas o Coinfecciones por diferentes tipos de
Piscirickettsia?
Condiciones experimentales:• Reactivación desde -80 en medio sin sangre (UACh)• Reactivación desde -80 en medio con sangre (PUCV)• Secuenciación por Pac-Bio, corrección por Ilumina y ensamble en DSMZ• Secuenciación directa desde el pez
Resultados pendientes:• Resecuenciaciones para comprobar• Amplificaciones de genes únicos por Grupo
IDs Psal IDs AUS Draft DSMZ
Genoma Completo
Psal-010* AUS-007 LF EM
Psal-069 AUS-023 EM
Psal-009* AUS-025 LF EM
Psal-005 AUS-040 EM
Psal-011 AUS-041 LF EM
Psal-006* AUS-042 LF EM
Psal-013 AUS-044 LF
Psal-014 AUS-045 EM
Psal-018 AUS-072 LF
Psal-070 AUS-100 EM
Psal-025 AUS-005 LF (NCBI) EM
Psal-008* AUS-008 En proceso En proceso
Psal-105 5265 (Noruega)
LF/EM
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PROGRAMA CEPARIO
Diferentes Especies / Cepas / Genogrupos o Aislados de Piscirickettsia?
Infecciones únicas o Coinfecciones por diferentes tipos de Piscirickettsia?
Adaptación a la salinidad
Adaptación a diferentes zonas geográficas? ¿Origen u Orígenes?
Adaptación a las diferentes especies de huéspedes?
Adaptación temporal?
Resistencia a antibióticos
¿Cómo podemos usar esta información para hacer un diagnóstico rápido y mejorarel manejo de la Piscirickettsiosis?
Evaluación de Patogenicidad in vivo y efecto de la
salinidad
Condiciones experimentales:
• Determinación de DL-50, previo al experimento de desafío.• Infección por cohabitación con peces Troyanos.• Dos aislados de P. salmonis previamente animalizadas• Dos salinidades (una correspondiente a agua estuarina y otra
equivalente a agua de mar)• Recuperación de peces enfermos y análisis anatomo-
patológicos.• Análisis de mortalidad y evaluación de resultados.• Peces: Salmón del Atlántico (S. salar) no vacunados y sanos
Cepa: desove nacional Rango de peso: parr SO de 60-70 g Densidad de cultivo: 12 kg/m3
Estuario Mar Estuario Mar
Estuario Mar Estuario Mar
Estuario Mar Estuario Mar
Estuario Mar Estuario Mar
Cepa “EM-90” Cepa “EM-90” Cepa “LF-89” Cepa “LF-89”
Triplicados(Análisis de Mortalidad)
Muestreos
(Análisis génico)
35 peces x estanque
Adaptación a diferentes zonas geográficas?
¿Origen u Orígenes?
Se necesitan mas aislados de otros orígenes para evaluar este punto
Adaptación a las diferentes especies de
huéspedes?
Adaptación temporal?
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PROGRAMA CEPARIO
Diferentes Especies / Cepas / Genogrupos o Aislados de Piscirickettsia?
Infecciones únicas o Coinfecciones por diferentes tipos de Piscirickettsia?
Adaptación a la salinidad
Adaptación a diferentes zonas geográficas? ¿Origen u Orígenes?
Adaptación a las diferentes especies de huéspedes?
Adaptación temporal?
Resistencia a antibióticos
¿Cómo podemos usar esta información para hacer un diagnóstico rápido y mejorarel manejo de la Piscirickettsiosis?
Resistencia antibióticos
Florfenicol Oxytretracycline Polymyxin Kanamycin Streptomycin Chloramphenicol Tetracycline
P sal 103 (8465) 0,4 µg/ml 0,4 µg/ml 128 µg/ml 128 µg/ml 64 µg/ml 1 µg/ml 1 µg/ml
P sal 104 (8670) 0,4 µg/ml 0,4 µg/ml 128 µg/ml 128 µg/ml 64 µg/ml 1 µg/ml 1 µg/ml
P sal 008 0,8 µg/ml 0,4 µg/ml 16 µg/ml 4 µg/ml 8 µg/ml 3,2 µg/ml 0,8 µg/ml
P sal 025 1,6 µg/ml 0,4 µg/ml 16 µg/ml 4 µg/ml 16 µg/ml 3,2 µg/ml <0,4 µg/ml
P sal 005 0,4 µg/ml 0,2 µg/ml 16 µg/ml 8 µg/ml 16 µg/ml 1,6 µg/ml <0,2 µg/ml
P sal 006 0,4 µg/ml 0,2 µg/ml 16 µg/ml 8 µg/ml 16 µg/ml 1,6 µg/ml <0,2 µg/ml
P sal 013 0,8 µg/ml 0,4 µg/ml 8 µg/ml 4 µg/ml 8 µg/ml 1,6 µg/ml 0,8 µg/ml
P sal 018 3,2 µg/ml 0,4 µg/ml 8 µg/ml 4 µg/ml 8 µg/ml 3,2 µg/ml 0,8 µg/ml
P sal 010 0,4 µg/ml 0,4 µg/ml 16 µg/ml 4 µg/ml 32 µg/ml 0,8 µg/ml 0,2 µg/ml
P sal 069 0,4 µg/ml 0,4 µg/ml 32 µg/ml 8 µg/ml 32 µg/ml 0,4 µg/ml 0,2 µg/ml
P sal 002 0,8 µg/ml 0,2 µg/ml 16 µg/ml 16 µg/ml 16 µg/ml 0,8 µg/ml 0,2 µg/ml
P sal LF ATCC <0,1 µg/ml <0,1 µg/ml Repeat Repeat <2 µg/ml Repeat <0,05 µg/ml
P sal 03 <0,1 µg/ml 0,4 µg/ml 256 µg/ml 64 µg/ml 256 µg/ml 0,4 µg/ml 0,8 µg/ml
P sal 051 0,2 µg/ml 0,1 µg/ml 64 µg/ml 256 µg/ml 16 µg/ml 1,6 µg/ml 0,1 µg/ml
P sal 02 0,8 µg/ml 0,4 µg/ml 512 µg/ml 128 µg/ml >1024 µg/ml 25,6 µg/ml <0,1 µg/ml
P sal 027 0,2 µg/ml 0,2 µg/ml Repeat Repeat 16 µg/ml Repeat 0,1 µg/ml
P sal 003 0,8 µg/ml 0,2 µg/ml 128 µg/ml 512 µg/ml 64 µg/ml 1,6 µg/ml 0,4 µg/ml
CMI a diferentes antibióticos de P. salmonis (Medio IFOP 7 días)
Resistencia antibióticos
Erythromycin Carbenicillin Imipenem Ceftazidime Gentamicin Ciprofloxacin Ampicillin
P sal 103 (8465) 32 µg/ml 1024 µg/ml 128 µg/ml 4 µg/ml 64 µg/ml <1 µg/ml <4 µg/ml
P sal 104 (8670) 16 µg/ml 1024 µg/ml 256 µg/ml 8 µg/ml 64 µg/ml <1 µg/ml <4 µg/ml
P sal 008 16 µg/ml 2 µg/ml 128 µg/ml <1 µg/ml 4 µg/ml 0,4 µg/ml <4 µg/ml
P sal 025 32 µg/ml 32 µg/ml 512 µg/ml <1 µg/ml 4 µg/ml 0,4 µg/ml 1024 µg/ml
P sal 005 8 µg/ml 2048 µg/ml >128 µg/ml 512 µg/ml 4 µg/ml <1 µg/ml 2048 µg/ml
P sal 006 8 µg/ml 2048 µg/ml >128 µg/ml 512 µg/ml 4 µg/ml <1 µg/ml 2048 µg/ml
P sal 013 32 µg/ml <4 µg/ml <2 µg/ml Repeat 2 µg/ml <0,1 µg/ml <4 µg/ml
P sal 018 32 µg/ml <4 µg/ml <2 µg/ml Repeat 2 µg/ml 0,4 µg/ml <4 µg/ml
P sal 010 4 µg/ml <4 µg/ml <2 µg/ml <1 µg/ml 8 µg/ml <0,05 µg/ml <4 µg/ml
P sal 069 4 µg/ml <4 µg/ml <2 µg/ml <1 µg/ml 8 µg/ml <0,05 µg/ml <4 µg/ml
P sal 002 8 µg/ml 2048 µg/ml 512 µg/ml 512 µg/ml 8 µg/ml <0,05 µg/ml 1024 µg/ml
P sal LF ATCC Repeat <2 µg/ml Repeat <1 µg/ml 4 µg/ml <0,05 µg/ml <2 µg/ml
P sal 03 16 µg/ml 128 µg/ml >512 µg/ml >512 µg/ml 32 µg/ml 0,8 µg/ml 2048 µg/ml
P sal 051 8 µg/ml <4 µg/ml <1 µg/ml 32 µg/ml 8 µg/ml Repeat <4 µg/ml
P sal 02 32 µg/ml 8 µg/ml 16 µg/ml >512 µg/ml 16 µg/ml 0,4 µg/ml 16 µg/ml
P sal 027 Repeat <4 µg/ml <1 µg/ml Repeat 8 µg/ml Repeat <4 µg/ml
P sal 003 16 µg/ml <4 µg/ml <1 µg/ml 64 µg/ml 16 µg/ml 12,8 µg/ml <4 µg/ml
CMI a diferentes antibióticos de P. salmonis (Medio IFOP 7 días)
Resistencia antibióticos
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PROGRAMA CEPARIO
Diferentes Especies / Cepas / Genogrupos o Aislados de Piscirickettsia?
Infecciones únicas o Coinfecciones por diferentes tipos de Piscirickettsia?
Adaptación a la salinidad
Adaptación a diferentes zonas geográficas? ¿Origen u Orígenes?
Adaptación a las diferentes especies de huéspedes?
Adaptación temporal?
Resistencia a antibióticos
¿Cómo podemos usar esta información para hacer un diagnóstico rápido y mejorarel manejo de la Piscirickettsiosis?
¿Cómo podemos usar esta información para hacer un
diagnóstico rápido y mejorar el manejo de la
Piscirickettsiosis?
Centro de cultivo (+)
Diagnóstico y Aislamiento
Cepario Nacional
Evaluación fenotípica
Opciones de Tratamiento
¿Cómo podemos usar esta información para hacer un
diagnóstico rápido y mejorar el manejo de la
Piscirickettsiosis?
Centro de cultivo (+)
Diagnóstico y Aislamiento
Cepario Nacional
Evaluación fenotípica
Opciones de Tratamiento
Base de Datos de genomas
Predicción de origen,
resistencia ATB, virulencia
¿Cómo podemos usar esta información para hacer un
diagnóstico rápido y mejorar el manejo de la
Piscirickettsiosis?
Centro de cultivo (+)
Diagnóstico y Aislamiento
Cepario Nacional
Evaluación fenotípica
Base de Datos de genomas
Predicción de origen,
resistencia ATB, virulencia
Extracción de ADN y secuenciación directa
Rápida mejora de las opciones de tratamiento
Prevención de la enfermedad
Mejora de la Base de datos
Ciclo de vida de Piscirickettsia salmonis
WP 1 WP 2 WP 3 WP 4
Variables ambientales de
supervivencia y viabilidad.
(Microcosmos).
Mecanismos de mantención y
propagación de la bacteria en el
mar.
Bancos y vectores de la bacteria
en el ambiente marino.
Asociación molecular y
epidemiológica entre potenciales
fuentes de infección y la
enfermedad.
Secuenciación masiva de nuevos
aislados
Analizar el core genoma y
pangenoma en el contexto de
patogenicidad y virulencia.
Ampliar el sistema de clasificación
de cepas por virulencia, y
patogenicidad..
Expresión de genes asociados a
patogenicidad y virulencia por
transcriptoma de “cepas tipo»
Elementos genéticos en la
resistencia a antibióticos s en el
core y pangenoma
Análisis transcriptómico, para
diferenciar resistencia fenotípica
de adquirida.
Rol l de los plásmidos en el
fenómeno de resistencia en
diferentes cepas
Predecir en los aislados la
selección de nuevos elementos
genéticos involucrados en la
resistencia a los dos antibióticos
tipo.
Establecer condiciones de edición
genética de marcadores putativos
de patogenicidad.
Consolidar el sistema
CRISPR/Cas9 como mecanismo
de edición génica en P. salmonis
Exosomas de sangre y sueros de
peces natural y artificialmente
infectados
RNAs pequeños (sRNA y
miRNAs) como bio marcadores
del progreso de la enfermedad .
Estudiar el ciclo de vida de Piscirickettsia salmonis de manera integral, estableciendo aspectos claves involucrados
en su transmisión vectorial y su supervivencia.
Asimismo, conocer las bases moleculares de la virulencia bacteriana, evaluando el impacto de factores ambientales en la
aparición de variantes genéticas involucradas en el desarrollo de la enfermedad, para establecer modelos predictivos y
estrategias alternativas que favorezcan su control.
WP1: Vectores y bancos de Piscirickettsia salmonis
Piscirickettsia salmonis es capaz mantenerse en el mucus de salmón del Atlántico.
Las pseudoheces podrían ser un vehículo de P. salmonis soló en peces con signos clínicos infecciosos
severos. ∞ P. salmonis es capaz de infectar y multiplicarse en el protozoo A. castellani.
P. samonis evade la fusión fagosoma-lisosoma para mantenerse en el protozoo A. castellani. ∞ P. salmonis no crece por si sola en medio de cultivo para microalgas.
P. salmonis crece en presencia de microalgas, posiblemente éstas entregan algún factor decrecimiento requerido por la bacteria.
La bacteria no infecta células de microalgas, solamente crece adherida a la pared o a su alrededor. ∞ P. salmonis produce biofilms en condiciones in vitro y se mantiene viva al menos por 15 días en
condiciones in vitro.
Se detectó el ADN de P. salmonis en el biofilm de algunas superficies inertes de estructuras de cultivo.
∞
GRUPOS DE TRABAJO (WPs) Logros Destacables
WP 1: Vectores y fuentes de mantención del patógeno
P.sal se replica en amebas del ámbito acuícola Sobrevive en comensalismo con algas marinas Sobrevive, se replica, mantiene viabilidad en agua pura
WP 2: Definición del core y pangenoma de la bacteria
Alta complejidad genómica Hasta hoy, se mantiene estables los dos genogrupos Dinamismo genético hace difícil definir cepa
WP 3: Establecer el resistoma de P. salmonis
Hay inducción de resistencia a antibióticos generalizada No es evidente para florfenicol y oxitetraciclina Los dos antibióticos NO llegan a la bacteria intra pez
WP 4: Marcadores de patogenicidad y virulencia
Promisorios marcadores de la evolución de la enfermedad miRNAs, fuente de diagnóstico precoz no invasivo (sueros) Edición génica como segura alternativa de eficientes vacunas vivas
WP2: Definición de Core y Pangenoma de Piscirickettsia salmonis
Pan-genoma
Core-genoma
Genoma variable
Familias de genes compartidas por todos los genomas
Genes específicos del genoma
WP3: Resistoma de Piscirickettsia salmonis
Son todos los genes de resistencia a los antibióticos o sus precurcores tanto en bacterias patógenas como ambientales.
Descifrar el resistoma de P. salmonis a los antibióticos florfenicol y oxitetraciclina permitirá determinar las variantes genéticas que
podrían tornarse resistentes con los suscesivos tratamientos
Resistencia Genotípica Resistencia Fenotípica
1. MIC’s de cada aislado obtenido desde el pez y
desde el cultivo
2. Experimento evolución en concentraciones
crecientes de antibióticos en P. salmonis.
WP4: Marcadores asociados a patogenicidad y virulencia de
Piscirickettsia salmonis
• Condiciones de edición genética (CRISP/Cas9)• Purificación de exosomas desde sangre• Evaluación de (sRNA) como biomarcadores de la enfermedad y diseño de estrategias terapéuticas
Resultados:
Se diseñó un mecanismo funcional y eficiente de edición génica para P. salmonis basado en el sistema
CRISP/CAS
Proyección: Edición genética inactivación de genes de virulencia Vacunas vivas
Identificación de sRNA desde suero de peces como marcadores para diagnóstico temprano de infección
con P. salmonis.
Proyección: diagnóstico no invasivo/seguimiento del desarrollo de la enfermedad a nivel pre-clínico.
Equipo de TrabajoPUCV UACH UNAB DSMZ
• Sergio Marshall• Fernando Gomez• Jorge Olivares• Alvaro Labra• Luis Mercado• Vitalia Henriquez• Marisela Carmona• Carolina Salazar• Nicolás Ojeda• Ninoska Delagado• Bruno Milesi• Oscar Arredondo• Cristian Muñoz• Omar Luna • Martin Galaz• Felipe Vasquez
• Jaime Figueroa• Denise Haussmann• Guillermo Nourdin• Fernando Lagos• Camila Solis• Jose Blanco
• Rubén Avendaño• Cristian Valenzuela• Hector Levipan• Diana Tapia• Rute Irgang• Astrid Zamorano• Eloisa Arias
• Jörg Overmann• Isabel Schober• Boyke Bunk• Sixing Huang
Gracias
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 50 100 150 200
Ab
sorv
anci
a [6
20
nm
]
Horas
P. Salmonis en Mucus J1
LF89
Ps103
Ps104
M+M
MEDIO
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
0 50 100 150 200Li
ve/D
ead
[b
ac/m
L]
Horas
LIVE/DEAD BacLight
LF89-J1-V
LF89-J1-M
Ps103-J1-V
Ps103-J1-M
Ps104-J1-V
Ps104-J1-M
Cinética de ingreso de P. salmonis a A. castellanii.
La flecha negra indica a P. salmonis teñidacon R18 (membrana).
A-E: fagocitos de P. salmonis mediada porseudópodos.
F-J: Ingreso de P. salmonis a la vacuoladigestiva de A. castellanii.
Agrupaciones de P. salmonis en elinterior de A. castellanii
Microscopía Confocal: P. salmonisen verde (SRS Fouorotest) y laameba en rojo (R18)
P. salmonis no se multiplica por si sola en medios de cultivo paramicroalgas.
Co-cultivos líquidos de P. salmonis a microalgas.
Cultivos por 10 días.
P. salmonis sembrada en medios para microalgas
No se observó crecimiento
P. salmonis crece en co-cultivo con las microalgas C. vulgaris, C.protothecoides, C. reinhardtii y T. suecica
P. salmonis en co-cultivo con C. vulgarisVerde: P. salmonis; Rojo: cloroplasto microalga
P. salmonis en co-cultivo con C. protothecoidesVerde: P. salmonis; Rojo: cloroplasto microalga
Determinar en condiciones in vitro el rol del biofilm en la supervivencia de P. salmonis
Figura 3 Visualización en eltiempo de la formación debiopelículas en medio AUSTRAL-SRS mediante tinción con el kitLIVE/DEAD en placas de 96pocillos para P. salmonis Psal-103y Psal-104. Cada imagenrepresenta un pocilloindependiente en la microplaca yla barra blanca de escala(esquina inferior derecha sobrecada imagen) es de 100 μm. Lasimágenes son representativas decuatro experimentos conducidosindependientemente.
Determinar en condiciones in vitro el rol del biofilm en la supervivencia de P. salmonis
Figura 4 Visualización en el tiempo dela formación de biopelículas en aguade mar mediante tinción con el kitLIVE/DEAD en placas de 96 pocillospara P. salmonis Psal-103 y Psal-104.Cada imagen representa un pocilloindependiente en la microplaca y labarra blanca de escala (esquina inferiorderecha sobre cada imagen) es de 100μm. Las imágenes son representativasde cuatro experimentos conducidosindependientemente.