Post on 15-Jan-2016
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4QM1 SECCION 1 *LOPEZ RAMIREZ STEPHANY *MENDOZA GARCES DANIA FERNANDA
INSTITUTO POLITECNICO NACIONALESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICADR. GUILLERMO CARVAJAL SANDOVAL
PRACTICA 7: OBTENCIÓN DE GLUCÓGENO A PARTIR DE HÍGADO DE RATA Y SU CARACTERIZACIÓN QUÍMICA
*OBJETIVOSSe realizará el aislamiento y purificación del glucógeno a partir del hígado de un organismo vivo y se identificará la composición de los productos por medio de hidrólisis ácida y enzimática por medio de reacciones químicas características.
*INTRODUCCION
El glucógeno es la forma de almacenamiento de la glucosa en los tejidos animales. Se encuentra principalmente en el hígado y en el músculo representando hasta un 10% y un 1-2% de su peso húmedo, respectivamente. Está formado por unidades de glucosa unidas por enlaces α(1-4) y ramificaciones α(1-6).
El glucógeno actúa como regulador de la glucosa sanguínea, almacenándola como glucógeno durante una buena alimentación (glucogenogénesis) y liberándola por fosforolisis (glucogenolisis) durante el ayuno, ya que en esta situación no hay absorción intestinal. La duración del glucógeno hepático en ayunas es de aproximadamente 24 h. A partir de este momento, la concentración en sangre se mantiene por síntesis de glucosa a partir de sustancias distintas a los carbohidratos
1
1.- Sacrificar una rata con
eter (procurando no excitarla)
2.- Extraer rapidamente el higado y lavarlo
al chorro de agua
3.- pesar y cortar rapidamente el
higado en pedazos pequeños
4.- colocar los pedazon es un
mortero previamete sumergido en hielo.
5.- Añadir acido tricloroacetico (TCA)
al 10% en proporcion de 1ml/g de tejido hepatico, triturar el higado hasta formar una
pasta homogenea.
6.- centrifugar el homogenizado durante 5 min a
2000 rpm.
7.-Decantar el .un vaso de 250 ml y mantenerlo en
hielo.
8.- Lavar el mortero y pisilo con 10 ml de TCA al 5% y en
este liquido reuspender en el
precipitado de centrifugacion
aterior
9.- dejar reposar por 5
min y centrifugar a
2000 rpm.
10.- Decatar el liquido
sobrenadante y reunirlo con el
obteido en el paso 7.
11.- Añadir 2 volumenes de etanol
por volumen de sobrenadante. agitar
esta mezcla y dejar en reposo hasta que el glucogeno flocule
12.- Centrifugar a
2000 rpm durante 5
min.
13.- Desechar el sobrenadante y resuspender el
precipitado con 5 ml de agua destilada
14.- Volver a precipitar con 2 volumenes de
etanol.
15.- centrifugar a 2000 rpm
durante 3 min.
16.- Decantar y suspender con la menor cantidad
posible de alcohol absoluto y pasarlo
a un vidrio reloj para que seque y
cristalice
4QM1 SECCION 1 *LOPEZ RAMIREZ STEPHANY *MENDOZA GARCES DANIA FERNANDA*Explicación de cada paso:
1.- La rata no debe excitarse puesto que si esto sucede esta empezara a segregar glucógeno lo que ocasionara que obtengamos menos de lo estimado.
2.- El Hígado debe extraerse de manera rápida puesto que entre más nos tardemos se producirán enzimas que degraden el glucógeno esta se tiene que lavar para quitar la sangre pues esta es una impureza para nuestra extracción de glucógeno.
3.- Se debe pesar el hígado pues necesitamos este dato para el cálculo de rendimiento, se cortara en pedazos pequeños para que sea más sencillo triturarlo.
4 y 5.- El tratamiento posterior con ácido tricloroacético (TCA) hace que precipiten las proteínas y ácidos nucleicos de la mezcla.
6.-Se centrifuga para que todos los componentes que no necesitas queden en el precipitado que se formara como proteínas, mezcla de células y la arena que se utilizó para triturar.
7.- Se decanta el sobrenadante para que en el obtengamos el glucógeno, y de igual manera se encontraran en esta agua y TCA.
8.- Se lava el mortero y el pistilo con el TCA para que recolectemos la pasta homogénea que quedo en ellos.
9.- se centrifuga de nuevo por la misma razón del paso 6.
10.- se decanta el sobrenadante para juntarlo con el sobrenadante inicial para poder obtener la mayor cantidad de glucógeno posible.
11.-Se le agrega etanol para que se separe el glucógeno del sobrenadante y se precipite.
12.- Se centrifuga para que el glucogeno quede precipitado.
13.- El sobrenadante se desecha pues no contiene ningún compuesto de interés.
14 y 15.- se repite el procedimiento para que el precipitado sea el mayor posible y obtengamos mayor cantidad de glucógeno.
16.- Se decanta el precipitado en una charolita y se le agrega etanol para deshidratarlo y este cristalice.
*Caracterización química del glucógeno.
a) Preparar 15mL de una solución de glucógeno de 5mg/ml.
b) Preparar una serie de tubos según la tabla.
*RESULTADOS
Rendimiento, Porcentaje de glucógeno presente en la rata.
Charola= 1.3851g
Charola con Glucógeno= 1.9114g
Glucógeno= (1.9114g-1.3851g)= 0.5263g peso seco
Peso de Hígado= 14g 100%
Peso de hígado X % de glucógeno
14g 100%
0.5263g X X=
3.75% de glucógeno presente en el hígado de nuestra rata
2
TUBO 1 2 3 4 5 6
Glucógeno (ml) 2 2 2 2 2 2HCl 1N (ml) 2HCl 2N (ml) 2HCl 4N (ml) 2Amilasa con.
(ml)2
Amilasa 1:2 (ml) 2
NaCl al 5%1gota
1gota
Agua dest. 2Incubar 30min 92°C 37°C
4QM1 SECCION 1 *LOPEZ RAMIREZ STEPHANY *MENDOZA GARCES DANIA FERNANDACaracterización química.
*ANALISIS DE RESULTADOS
Prueba de Fehling
En la hidrólisis ácida como en la hidrólisis enzimática se obtuvieron resultados positivos en los tubos hidrolizados, esta prueba se realiza para identificar los carbonilos potencialmente libres que estén involucrados en enlaces glucosidicos (azucares reductores) gracias a esto podemos decir que en nuestra muestra probablemente hay presencia de glucosa, maltosa o fructosa. En el tubo testigo del glucógeno sin hidrolizar dio negativo, debido a que sus grupos están bloqueados debido a los enlaces alfa-1,4 y alfa-1,6; no posee iones libres par que se lleve a cabo la reacción.
Prueba de Seliwanoff
Los resultados fueron positivos para 5 tubos, el tubo testigo del glucógeno dio negativo debido a que no se hidrolizo. En esta prueba podemos diferenciar aldosas de cetosas, las cetosas dan rápido y las aldosas lento, por lo tanto podemos decir que el azúcar presente es una aldosa (glucosa).
Prueba del lugol
Dio positivo en el tubo testigo del glucógeno, debido a que al no ser hidrolizado el glucógeno es capaz de atrapar al lugol por ser un polisacárido lineal, formando caltratos.
*CONCLUSIONES
-Los seres vivos almacenan glúcidos en forma de polisacáridos, que sirven como materiales de reserva como es el caso del glucógeno en los animales.-El glucógeno contiene unidades de glucosa unidas por enlaces glicosídicos alfa-1,4 y alfa-1,6.
-Se caracterizó al problema por reacciones químicas, dando como resultado la identificación del glucógeno.
*PREGUNTA EXTRA
Cascada del glucógeno
*BIBLIOGRAFIA
*Lehninger, Albert, Nelson, David L. (1993). Principios de Bioquímica´. Segunda Edición, Ediciones Omega, Barcelona, España.
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Prueba Observaciones Imagen
Ninhidrina
Negativo Nos indica que nuestro problema no
hay aminoácidos, ya que es una reacción característica para grupos
amino libres.
Biuret
Negativo En nuestro problema no hay
presencia de proteínas debido a q la reacción es para identificar
proteínas y péptidos de cadena menor a 3 unidades de a.a.
Molish
Positivo Se identifico que nuestro problema es un carbohidrato. La reacción de
Molish es general para carbohidratos.
Hidrolisis
Acida Testigo Enzimática Blanco
1 N
2 N
4 N
Glucógeno sin
hidrolizarConc. 1:2 Agua
Fehling + + + - + + -Lugol - - - + - - -
Seliwanoff
+ + + - + + -