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15/06/2015
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M. en C. Patricia Regina Aranguré Peraza
16/Junio/ 2015
Detección, aislamiento e identificación de
Escherichia coli O157:H7 y Escherichia
coli productora de toxina de Shiga no
O157 por el método FSIS/USDA.
Escherichia coli fue descubierta en
1885 por Theodor Escherich.
En 1964 el género Escherichia fue
definido en la obra “Topley and
Wilson´s Principles of
Bacteriology and Immunity” de
Wilson y Miles
Kauffmann 1947, esquema de serotipificación.
176 antígenos somáticos (O) serogrupo.
112 flagelares (H) serotipo.
60 capsulares (K).
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INTRODUCCIÓN
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• Escherichia coli es una bacteria que se encuentra normalmente en el intestino del ser humano y de los animales de sangre caliente.
• La mayoría de las cepas de Escherichia coli son inofensivas.
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INTRODUCCIÓN
• Sin embargo algunas de ellas pueden causar graves enfermedades a través de los alimentos (ETA).
• La bacteria se transmite al hombre principalmente por el consumo de alimentos contaminados, como productos de carne cruda o poco cocida.
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INTRODUCCIÓN
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Mecanismos de patogenicidad de los seis patotipos reconocidos de Escherichia coli
Kaper y col., 2004 M. en C. Patricia Regina Aranguré Peraza
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INTRODUCCIÓN
• STEC se considera un patógeno emergente (ETA)
• STEC ha sido implicada en numerosos brotes incluyendo el desarrollo del Síndrome urémico hemolítico (SUH) en algunos pacientes.
STEC INTRODUCCIÓN
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• La mayor parte de la información disponible sobre EHEC/STEC guarda relación con el serotipo O157: H7
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INTRODUCCIÓN
STEC
1983-2002
70% de infecciones
(Brooks et al., 2005).
O26
O45
O103
O111
O121
O145
INTRODUCCIÓN
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HISTORIA
Konowalchuck y col.; 1977
¿STEC?
Karmali y col.; 1983
Riley ; 1983
Stx
INTRODUCCIÓN
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• Colitis hemorrágica
• Síndrome urémico hemolítico .
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INTRODUCCIÓN
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• Toxina de Shiga (Stx1, Stx2)
• Isla de patogenicidad LEE (locus of enterocyte effacement) que contiene entre otros el gen eae (fenómeno de A/E (attaching and effacing)).
• Plásmido pO157 (60Md).
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INTRODUCCIÓN
Factores auxiliares de virulencia
Mecanismo de acción de STEC
CH
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INTRODUCCIÓN
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Mecanismo de acción de la Toxina Stx1/Stx2
SUH
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INTRODUCCIÓN
• Escherichia coli O157:H7 y Escherichia coli no O157, son considerados patógenos en humanos con una baja dosis infecciosa.
• Ingestión de 100 células puede causar enfermedad
• Bioseguridad Clase II
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MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
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Este método es usado para el análisis de carne cruda para la detección de Escherichia coli O157:H7 y Escherichia coli no O157.
Utilizando herramientas y métodos como lo son enriquecimiento en caldo selectivo, PCR en tiempo real, separación inmunomagnética, placas de agar
altamente selectivas, serología, identificación bioquímica y ELISA
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Fundamento
METODOLOGIA
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Fundamento
The methods described in this guidebook are for use by the FSIS
laboratories. FSIS does not specifically endorse any of the mentioned test
products and acknowledges that equivalent products may be available for
laboratory use. Method validation is necessary to demonstrate the
equivalence of alternative tests as detailed in the document titled “FSIS
Guidance for Evaluating Test Kit Performance” available on the FSIS website.
METODOLOGIA
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Referencias
MLG 5A.04 FSIS Procedure for de Use of Escherichia coli O157:H7 Screening Test for Meat Products and Carcass and Environmental Sponges MLG 5.09 Detection, Isolation and Identification of Escherichia coli O157:H7 from Meat Products and Carcass and environmental Sponges. MLG 5B.05 Detection and Isolation of non-O157 Shiga Toxin-Producing Escherichia coli (STEC) from Meat Products and Carcass and environmental Sponges.
METODOLOGIA
Non-O157 STEC Test Methods that Received No-Objection Letters and are Validated by an Independent
Organization
Log Number Company Name Method Name 12-SMP-0848-N-A Biocontrol Systems Assurance GDS Top 7 STEC (eae) method
12-SMP-0849-N-A Biocontrol Systems Assurance GDS MPX Top 7 STEC method
12-SMP-0850-N-A IEH Laboratories IEH Non-O157 STEC detection and identification method
12-SMP-0858-N-A Bio-Rad Laboratories iQ Check™ VirX and iQ Check™ SerO STEC test methods
12-SMP-0860-N-A DuPont Qualicon BAX® System Real-Time PCR STEC Suite
12-SMP-0926-N-A Pall Corporation GeneDisc® Top 6 STEC test kit
Non-O157 STEC Test Methods that Received No-Objection Letters and are not Validated by an
Independent Organization
Log Number Company Name Method Name
12-SMP-0854-N-A Life Technologies RapidFinder™ STEC Screening and Confirmation Assays for Beef Products
12-SMP-0855-N-A Neogen Corporation NeoSeek Approach to STEC Detection Identification *confirmatory test
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Carta de No Objeción
PCR EN TIEMPO REAL ( PRUEBA TAMIZ)
http://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/regulatory-compliance/New-Technologies/summary-table-of-nols-non-O157-stec-test-methods/NOL-non-O157-STEC-+test-methods
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CEPAS DE REFERENCIA
Microorganismo ATCC Serotipo stx1 stx2 eae
Escherichia coli. 35150 O157:H7 + + +
Escherichia coli. 700728 O157:H7 - - -
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CEPAS DE REFERENCIA
Microorganismo Serogrupo stx1 stx2 eae Resistencia al
telurito de potasio
Escherichia coli. O26 + + + +
Escherichia coli. O45 + + + +
Escherichia coli. O103 + + + +
Escherichia coli. O111 + + + +
Escherichia coli. O121 + + + +
Escherichia coli. O145 + + + +
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Preparación de la muestra y enriquecimiento
primario
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BAX
325 ± 32.5g + 975±19.5mL CSTm
15-24h / 42 ± 1ºC
*Brotes, embutidos y carne cocida: 13 muestras de 25g
para un total de 325g + 975±19.5mL CSTm ó 25g de
muestra + 225 ± 4.5 mL CSTm
15-24h / 42 ± 1ºC
GDS
375g + 1.5mL mEHEC
10-18h / 42 ± 1ºC
25g + 225mL mEHEC
10-18h / 42 ± 1ºC
* Escherichia coli O157:H7
C+
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PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Y ENRIQUECIMIENTO PRIMARIO
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PCR en tiempo real
(prueba tamiz)
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Consiste en la amplificación automatizada de ácidos nucleicos:
Escherichia coli O157:H7
Factores auxiliares de virulencia eae, stx1 y stx2 Los 6 principales serogrupos de cepas de Escherichia coli productoras de toxinas de Shiga (STEC) no O157:H7
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PCR EN TIEMPO REAL (PRUEBA TAMIZ)
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BAX
PCR
O157:H7
PCR (STEC)
eae/stx
(Previamente positivo a eae/stx)
PCR
Panel 1/Panel 2
PCR EN TIEMPO REAL (PRUEBA TAMIZ)
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• O157:H7
• STEC Screening : eae, stx
• Panel 1: O26, O111, O121
• Panel 2: O45, O103, O145
BAX
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PCR EN TIEMPO REAL (PRUEBA TAMIZ)
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Preparar previamente
tubos con 200µL de
buffer de lisis
Agregar 20µL de la muestra al buffer de
lisis
37ºC/20min.
95ºC/1Omin
Enfriar los tubos 4ºC/5min
PCR EN TIEMPO REAL (PRUEBA TAMIZ)
BAX
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Capturar los datos en el
sistema
Transferir 50µL del
lisado a los tubos de
amplificación
Colocar los tubos e iniciar
la corrida
BAX
PCR EN TIEMPO REAL (PRUEBA TAMIZ)
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BAX
PCR
O157:H7
Positivo (SIM)
PCR (STEC)
eae/stx
Positivo (PCR Panel 1 Y 2)
(Previamente positivo a eae/stx)
PCR
Panel 1/Panel 2
Positivo (SIM)
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PCR EN TIEMPO REAL (PRUEBA TAMIZ)
BAX
GDS
PCR
MPX Top 7 STEC
O157:H7
y (STEC) eae/stx1 y stx2
PCR EN TIEMPO REAL (PRUEBA TAMIZ)
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Preparación del material y reactivos
X 2
Adición de: Reactivo de Concentración. (immunobeads) (20µL) Solución de lavado. (1 mL) Buffer de resuspensión. (45µL)
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GDS
PCR EN TIEMPO REAL (PRUEBA TAMIZ)
Adición de 1ml de la muestra
Vortex por 10min Usar la PickPen para capturar la bacteria
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PCR EN TIEMPO REAL (PRUEBA TAMIZ) GDS
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Transfiriendo los “inmunobeads” del
bloque de muestras para el plato de resuspensión
Concentrado Transfiriendo los
“inmunobeads” a los tubos de amplificación
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PCR EN TIEMPO REAL (PRUEBA TAMIZ) GDS
Capturar los datos en el sistema
Acomodar los tubos de
amplificación en el rotor
Leer los resultados después de 75 a
80min.
En una sola corrida se obtendrán resultados para O157:H7 y STEC
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PCR EN TIEMPO REAL (PRUEBA TAMIZ) GDS
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Si la muestra es positiva a PCR en tiempo real
se considera
POTENCIALMENTE POSITIVA
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PCR EN TIEMPO REAL (PRUEBA TAMIZ)
Método confirmatorio
Procedimiento de Inmunoseparación
Magnética (SIM)
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BAX
SIM
O157:H7 ó cualquier de los 6 serogrupos STEC
previamente identificados por PCR
GDS
SIM
7 serogrupos incluido el serotipo O157:H7 ó a seis serogrupos STEC
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PROCEDIMIENTO DE INMUNOSEPARACIÓN MAGNÉTICA (SIM)
• Anticuerpos anti-Escherichia coli purificados, adsorbidos y unidos covalentemente a la superficie de partículas esféricas paramagnéticas de poliestireno.
• Reaccionan con el antígeno somático.
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Fundamento SIM
PROCEDIMIENTO DE INMUNOSEPARACIÓN MAGNÉTICA (SIM)
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Tomar una alícuota de la muestra (1mL)
SIM
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Colocar 50 µL inmunoperlas serogrupos: O157, O26, O45, O103, O111,O121 y O145.
Colocar 50 µL inmunoperlas + 1mL de muestra.
Incubar 15 min en movimiento a una temperatura de 18-30ºC.
PROCEDIMIENTO DE INMUNOSEPARACIÓN MAGNÉTICA (SIM)
Añadir 1 mL de la muestra en las columnas
Colocar las columnas de inmunoseparación en el imán OCTOMACs y humectar con 500µL de Buffer E
Realizar 4 lavados Buffer E
Separar las columnas del imán y colocarla en tubos de 12 x 75 mm +1mL
Buffer E , posteriormente utilizar el émbolo.
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PROCEDIMIENTO DE INMUNOSEPARACIÓN MAGNÉTICA (SIM)
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Por cada muestra y control se prepararan: 3 tubos con 900 µL de Buffer E (diluciones) 1 tubo con 25 µL con HCl 1N (tratamiento ácido).
De la muestra directa se realizará dos diluciones con los tubos 900 µL de 1:10 y 1:100
Previamente se secaron 4 placas de agar rainbow modificado por cada muestras 2placas: 1:10 y 1:100 2 placas : tratamiento ácido y 1:10
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PROCEDIMIENTO DE INMUNOSEPARACIÓN MAGNÉTICA (SIM)
De las diluciones de 1:10 y 1:100 se sembraran 100 µL en ARM
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Se dispersa con asa de Digralsky y se incubaran a 35±2ºC por 20-24h
PROCEDIMIENTO DE INMUNOSEPARACIÓN MAGNÉTICA (SIM)
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Posterior a la incubación se agregará 475 µL Buffer E se sembraran con asa de Digralsky 100µL de la muestra, de igual forma se realizará una dilución 1:10, se procederá a inocular la placa de ARM y se incubaran a 35±2ºC por 20-24h
De la muestra sin diluir se tomaran 450 µL y se añadirá al tubo con 25 µL de HCl IN (pH 2) y se incubaran por una hora
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PROCEDIMIENTO DE INMUNOSEPARACIÓN MAGNÉTICA (SIM)
Seleccionar colonias típicas bien aisladas en ARM y realizarla prueba de serología para los antígenos somáticos : O26, O45, O103, O111,O121, O145 y O157.
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MLG 5B Apendix 2.01 Morphologies of Representative Strains from Six non-O157 Shiga Toxin-Producing Escherichia coli (STEC) Grown on modified Rainbow Agar.
IDENTIFICACIÓN
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Medio cromogénico selectivo.
• β-galactosidasa (un sustrato cromogénico azul-negro )
• β-glucuronidasa (un sustrato cromogénico rojo )
Para aumentar la selectividad del agar
• Telurito de Potasio 0.15 mL.
• Novobiocina 1.25 mL.
• Cefixima (concentración de 0.5mg/ mL) 0.1 mL.
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Agar Rainbow Modificado (ARM)
IDENTIFICACIÓN
1ª serología ARM detección de serogrupo sospechoso
STEC PCR opcional
Se sembraran por lo menos 5 colonias sospechosas en agar sangre
35 °C/16-24hrs Si la muestra es positiva a serología a partir de ARM se
reporta como:
Presuntamente positiva
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IDENTIFICACIÓN
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• Las partículas de látex son cubiertas con un anticuerpo contra el antígeno Escherichia coli O157 y Escherichia coli no O157.
• Cuando las partículas del látex son mezcladas con colonias frescas ,la bacteria se une al antisuero, causando que las partículas de látex se aglutinen (resultado positivo).
• Las bacterias que no sean del serogrupo de interés no se unirán a los antisueros y no dará como resultado aglutinación alguna. (resultado negativo)
SEROLOGÍA
Fundamento
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2ª Serología
Para obtener colonias
aisladas y puras.
O157:H7 Se realiza la serología para el
antígeno somático y el antígeno flagelar
STEC Se realiza la
serología para el antígeno somático
Agar sangre
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SEROLOGÍA
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1) ELISA,PCR (eae/stx)
2) Identificación bioquímica (VITEK®, API 20E®).
1) PCR (eae/stx)
2) PCR (Panel 1 ó 2)
3) Identificación bioquímica (VITEK®, API 20E®).
O157:H7 STEC no O157
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Positivos a serología
SEROLOGÍA
Una colonia a partir de agar
sangre
Resuspender en 50µL de agua grado
biología molecular
Al buffer de lisis, se le agregará 5µL de la
suspensión bacteriana y se continuará con el proceso previamente
visto.
Positivo O157
ID bioquímica, ELISA
Positivo STEC
PCR serogupo
PCR EN TIEMPO REAL
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PCR (eae/stx)
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Una colonia a partir de agar
sangre
Resuspender en 50µL de agua grado
biología molecular
Al buffer de lisis, se le agregará 5µL de la
suspensión bacteriana y se continuará con el proceso previamente
visto.
PCR EN TIEMPO REAL
PCR (Panel 1 Y Panel 2)
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ID bioquímica
Positivo STEC
• Es un sistema estandarizado que permite la identificación de
enterobacterias y otros bacilos Gram negativos no exigentes
• 21 tests bioquímicos miniaturizados, así como una base de datos.
• Las reacciones bioquímicas producidas durante el periodo de incubación
se traducen en cambios de colores espontáneos o revelados mediante la
adición de reactivos.
IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA
API 20E
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2015
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1 • A partir de una colonia aislada del agar sangre, hacer una suspensión en
5 mL de solución salina (1% de NaCl) o 5 mL de agua estéril.
2 • Llenar con la suspensión de bacterias los tubos, no la cúpula (cada
pocillo tiene un tubo y una cúpula, parte aerobia), de todos los pocillos.
3 • Llenar la cúpula de los pocillos CIT, VP, GEL con la suspensión de
bacterias.
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IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA
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IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA
4 • Llenar la cúpula de los pocillos ADH,LCD,ODC y H2S con parafina
5 • Poner la tira en su propia cámara húmeda de incubación
6 • Incubar a 35 ± 2 °C durante 18-24 h y realizar la lectura.
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• La prueba Premier EHEC utiliza anticuerpos monoclonales de captura anti- toxina Shiga, absorbidos en los micropocillos.
• Junto a un anticuerpo policlonal anti- toxina Shiga y un anticuerpo policlonal anti-igG conjugado a un enzima .
• Se realiza siguiendo las indicaciones del proveedor.
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PRUEBA DE ELISA
ELISA (O157:H7)
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ELISA (O157:H7)
PRUEBA DE ELISA
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• Si la toxina está presente, se forma un complejo antígeno-anticuerpo.
• Se desarrolla color por actividad enzimática en presencia del sustrato .
• Los resultados se interpretan visual o espectrofotométricamente.
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ELISA (O157:H7)
PRUEBA DE ELISA
Para confirmar la muestra como positiva deberá ser:
• Bioquímicamente identificada como Escherichia coli
• Serológica o genéticamente determinada como O157
Y que cumpla al menos uno de los siguientes criterios:
• Positiva a la producción de toxina de Shiga
• Positivo al gen de la toxina de Shiga (stx)
• Genéticamente determinado como H7
Si no cumple con ninguno de los criterios será reportada como Ausente en 325 ó 375g.
REPORTE DE RESULTADOS
O157:H7
Presente en 325g (BAX) ó
Presente en 375g (GDS)
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Para confirmar la muestra como positiva deberá ser :
• Bioquímicamente identificada como Escherichia coli
• Positivo al gen de la toxina de Shiga (stx) y al gen eae
• Serológica o genéticamente determinada como cualquiera de los 6 serogrupos
Si no cumple con ninguno de los criterios será reportada como Ausente en 325 ó 375g.
REPORTE DE RESULTADOS
No-O157:H7
Presente en 325g (BAX) ó
Presente en 375g (GDS)
MVZ Juan Gay Gutiérrez
Director del Centro Nacional de Servicios de Constatación en Salud Animal (CENAPA)
Dr Jorge E. Torroba Secretarío ex officio de la RILAA - OPS/OMS
Dr Susana Horta Fonseca
LANAGRO, Brasil
QI Martha Laura Dominguez
Subdirector de Constatación (CENAPA)
QBP Cesar Linares Altamirano
Jefe del Departamento de Químicos Farmacéuticos y Alimenticios (CENAPA)
Ing. Ivan Casarrubias Ayala
Sistemas de informática (CENAPA)
Ing Alberto Horacio Mendia
PANAFTOSA-OPS
Si no cumple con ninguno de los criterios será reportada como Ausente en 325 ó 375g.
AGRADECIMIENTOS
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M. en C. Patricia Regina Aranguré Peraza
Prof. Ejec. de Serv. Espdos. Enlace C
Laboratorio de Microbiología
Centro Nacional de Servicios de Constatación en Salud Animal
Carretera Federal Cuernavaca-Cuautla No. 8534, Col.
Progreso
Jiutepec Mor CP 62550
Tel. Conm. (55) 59 05 10 00, Ext. 53112
patricia.arangure@senasica.gob.mx