DEFENSAS ANTIMICROBIANASDEFENSAS ANTIMICROBIANASDE PLANTAS SUPERIORES:DE PLANTAS SUPERIORES:

““Un caso de aplicaciUn caso de aplicacióónn””

Julio Armando Pedrozo PérezProfesor Asociado

Departamento de QuímicaPontificia Universidad Javeriana

Bogotá – Colombia2003

GIFUJ

CULTIVO DE PAPACULTIVO DE PAPA

(Guasca – Cundi.)

El cultivo de plantas ornamentales se ha convertido en Colombia,en una de las industrias de mayor crecimiento, debido a la gran demanda internacional de flores de excelente calidad y sanidad.

Constituye uno de los rubros de mayor importancia de la econo-mía nacional, generando divisas comparables a las producidasen años precedentes por el petróleo o el café.

FLORICULTURAFLORICULTURA

FLORICULTURA EN COLOMBIAFLORICULTURA EN COLOMBIA

Colombia posee una combinación única de condiciones topográficasy de temperatura, que permiten la producción intensiva de más de 30tipos de flores cultivadas en invernadero, desde rosas, pompones,crisantemos, astromelias, girasoles y claveles, hasta las másexóticas, como heliconias y el “ave del paraíso”.

Hongos FitopatHongos FitopatóógenosgenosAlternariaAspergillusRhizoctonia

ColletotrichumSphaerotheca

FusariumBotrytis

Bacterias FitopatBacterias FitopatóógenasgenasPseudomonas

FITOPATFITOPATÓÓGENOSGENOS

CONTROL QUCONTROL QUÍÍMICOMICO

AGRICULTURA ORGAGRICULTURA ORGÁÁNICANICA

SUSTANCIAS ANTIMICROBIANASSUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS

1. SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS CONSTITUTIVAS

☼ INHIBIDORES☼ POSINHIBIDORES

2. FITOALEXINAS

ECOSISTEMA PARECOSISTEMA PARÁÁMOMO

Páramo de Guasca (Guasca – Cundi.)

VEGETACIVEGETACIÓÓN DEL SUBPN DEL SUBPÁÁRAMORAMO

PROYECTOPROYECTO

ESTUDIO QUESTUDIO QUÍÍMICO Y EVALUACIMICO Y EVALUACIÓÓN DE LAN DE LAACTIVIDAD ANTIFACTIVIDAD ANTIFÚÚNGICA Y ANTIBACTERIANANGICA Y ANTIBACTERIANA

DE PLANTAS AUTDE PLANTAS AUTÓÓCTONAS DE PCTONAS DE PÁÁRAMOSRAMOSCOLOMBIANOS COLOMBIANOS

Investigadores:Rubén Darío Torrenegra GuerreroJulio Armando Pedrozo Pérez

COLCIENCIAS/U. JAVERIANA, código 1203-05-394-95, CT-128-97

Cromatogramas

Medio de cultivo +Microorganismo

Medio de cultico +Cromatograma invertido

Refrigeración / 18 horas

Retirar CCDIncubación

Comparación de resultadoscon duplicado de CCD

Medición de Rf y zonas de inhibición

Zonas de inhibición

TEST BIOAUTOGRÁFICO

Dipolostephium phylicoides - -Diplostephyum revolutum - -Senecio formosus b,c b,cSenecio pampae b.c b,c Pentacalia corymbosa - b,cPentacalia ledifolia - b,c Pentacalia pulchella - b,cBejaria aestuans - -Gaultheria anastomosans b -Pernettya prostrata - -Vaccinium floribundum - -Cavendishia cordifolia - -Lupinus paniculatus - -Calamagrostis effusa - -Baccharis tricuneata - -Espeletia grandiflora a,b -Espeletia argentea a,b -Espeletiopsis corymbosa a,b -Ageratina vacciniaefolia a,b bAgeratina fastigiata a,b bAgeratina tinifolia a,b b

Especies vegetales A.AB A.AF

Pentacalia corymbosa (Benth.)Cuatr.(Guasg(Guasgüíüínn-- HuasgHuasgüíüín)n)

Pentacalia ledifolia (H.B.K)Cuatr.(Guasg(Guasgüíüínn-- HuasgHuasgüíüín)n)

EXTRACCIEXTRACCIÓÓN DEL VEGETALN DEL VEGETALExtracto:Extracto:

Sustancias de la superficie foliarSustancias de la superficie foliar

200 g de hojas frescas se lavaron por 3 min en CHCl3(5 ml/g); el solvente fue removido por filtración y

concentrado al vacío; el residuo obtenido se trató conMe2CO y enfrió a 4 ºC durante 12 h. El flóculo fue

removido por filtración y, el filtrado resultante, fueconcentrado y secado al ambiente.

El extracto se guardó en nevera a 4ºC paraevaluarle luego su acción antifúngica

EXTRACCIEXTRACCIÓÓN CON PETRN CON PETRÓÓLEOLEO

• El material vegetal, previamente lavado con CHCl3,fue secado al ambiente y luego pulverizado.

• A 600 g, se le extrajo con éter de petróleo durante72 h, al cabo de las cuales fue filtrado y concentrado al vacío.

• El extracto se trató con Me2CO y, después de 12h de reposo se filtró a mínimo volumen y se secóal ambiente.

El extracto se guardó en nevera a 4 ºC, para evaluarluego su acción antifúngica.

EXTRACCIEXTRACCIÓÓN CON ETANOLN CON ETANOL

• El material desengrasado se extrajo porpercolación en frío con EtOH 96% v-v.

• El extracto resultante se trató con agua, sefiltró y al filtrado obtenido se le fraccionó L/Lcon CHCl3 y luego con AcOEt.

Las fracciones se concentraron, se secaron alambiente y se guardaron a 4 ºC para evaluarles,posteriormente, su acción antifúngica.

MMÉÉTODO DE CRECIMIENTOTODO DE CRECIMIENTORADIAL EN PDARADIAL EN PDA

Extracto vegetal Medio de cultivo

InóculoIncubación / 6 días

Medición de los diámetrosde las colonias

CIM ENCIM EN mgmg/ml DE EXTRACTOS DE ESPECIES/ml DE EXTRACTOS DE ESPECIESDE PENTACALIA, ANTE HONGOS FILAMENTOSOS DE PENTACALIA, ANTE HONGOS FILAMENTOSOS

Extractos F. solani A. solani R. solani C. gloeosp. T. viride1h-Pc 1,9 2,0 2,0 2,0 2,42h-Pc 2,0 2,2 2,5 2,4 2,62f-Pc 2,1 2,4 2,4 2,4 2,6 2r-Pc 2,2 2,4 2,4 2,4 2,63h-Pc 1,9 2,2 2,1 2,1 2,53f-Pc 2,1 2,4 2,3 2,1 2,53r-Pc 2,2 2,4 2,3 2,3 2,51h-Pl 1,9 2,0 2,0 2,0 2,32h-Pl 2,0 2,2 2,3 2,4 2,62f-Pl 2,2 2,4 2,4 2,4 2,62r-Pl 2,4 2,4 2,4 2,4 2,6 3h-Pl 2,0 2,2 2,1 2,1 2,53f-Pl 2,1 2,4 2,4 2,1 2,53r-Pl 2,4 2,4 2,3 2,3 2,5

EXTRACTO DE MAYOREXTRACTO DE MAYORACCION ANTIFACCION ANTIFÚÚNGICANGICA

Procedimiento:

Se extrajeron 800 g de hojas frescas por maceración en frío conCHCl3, durante 8 días; el material se extrajo una segunda vezdurante 2 días más. Los extractos se mezclaron, se concentrarony se trataron con Me2CO. Los filtrados se concentraron, se redi-solvieron en mezclas hidroalcohólicas y se extrajeron L/L con CHCl3. Estos extractos se rotularon como FCA y se guardaron en neveraa 4 ºC.

Extractos F. solani A.solani R. solani C. gloeosp. T.viride

FCA-Pc 1,1 1,1 1,1 1,1 1,2FCA-Pl 1,2 1,2 1,2 1,2 1,3

CIM ENCIM EN mgmg/ml DE LA FCA DE ESPECIES/ml DE LA FCA DE ESPECIESDE PENTACALIA, ANTEDE PENTACALIA, ANTE

HONGOS FITOPATOGENOSHONGOS FITOPATOGENOS

RECONOCIMIENTO DE PROBLEMASRECONOCIMIENTO DE PROBLEMASFITOPATFITOPATÓÓGENOSGENOS

Sphaerotheca pannosa var. rosae (Ascomicetes)

Parásito obligado

Causante del mildeo polvoso en el fruto del du-rasno, fresa y mora; es la enfermedad de mayorseveridad y diseminación en cultivos de rosa eninvernadero y en campo abierto.

La forma más corriente es la asexual, designadacomo Oidium leucoconium.

La forma sexual presenta cleiostecios globosos con unos peque-ños apéndices miceloides de color café; contienen 8 ascosporas.

Las esporas asexuales (conidias) son producidas en gran número yson prácticamente responsables de la propagación y diseminaciónde la especie.

Mildeo polvoso del rosalMildeo polvoso del rosalLos síntomas tempranos son un leve levan-tamiento, como una ampolla, a menudo, enáreas rojas en la superficie de la hoja.El micelio (con conidióforos) aparece comomanchas discretas en la superficie de lashojas jóvenes, las cuales se vuelven curva-das, deformes y, comúnmente, se recubrende un polvo blanco llamado.

Ataca las espinas en su base; a los tallos en las partes más tiernas;a las hojas jóvenes en toda su superficie; a las flores en los pedún-culos, en sépalos y receptáculos, especialmente cuando la flor aúnno está abierta.

El daño reduce el crecimiento de la hoja, el valor estético de laplanta, la eficiencia en la fotosíntesis y, por consiguiente, el desa-rrollo.

BIENSAYO BIENSAYO in vivoin vivo PARA HONGOSPARA HONGOSPARPARÁÁSITOS OBLIGADOSSITOS OBLIGADOS

Invernadero: dividido en naves de aproximadamente 1.000 m2 y, confor-mada cada una por 15 a 20 camas. Sólo se utilizaron 6 de estas camas,cada una conteniendo 280 plantas en periodo de floración. Éstas camasfueron distribuidas según un diseño de bloques al azar con aleatoriza-ción restringidaEvaluación: la evaluación del daño del hongo sobre las plantas se rea-lizó de acuerdo a una escala de calificación, correspondiente a porcen-tajes de ataque entre 0 y 50%.Aspersión: se utilizó una bomba de presión constante, previamente de-sinfectada y calibrada. Se utilizó el método de aplicación en escuadra.Muestras experimentales: se utilizaron soluciones acuosas de extrac-tos de especies de Pentacalia, adicionando un adherente especial(Pegal 0,5%). Análisis: se realizó la prueba de “t” y el análisis de varianza (ANOVA)que permite comparar más de dos medias poblacionales.

APLICACIAPLICACIÓÓN DE LAN DE LAFRACCIFRACCIÓÓN ACTIVAN ACTIVA

MMÉÉTODOS DE SEPARACITODOS DE SEPARACIÓÓN E N E IDENTIFICACIIDENTIFICACIÓÓNN

MMÉÉTODOS DE SEPARACITODOS DE SEPARACIÓÓNN•|Cromatografía en capa delgada preparativa• Fraccionamiento sobre lecho de sílica• Cromatografía en columna flash• Cromatografía en columna de sílica• Cromatografía en columna de sephadex

MMÉÉTODOS DE IDENTIFICACITODOS DE IDENTIFICACIÓÓNN• Espectrofotometría ultravioleta• Espectrometría de masas• Resonancia Magnética Nuclear

CUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIARCUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIAR

Hongos FitopatHongos FitopatóógenosgenosAlternariaAspergillusRhizoctonia

ColletotrichumSphaerotheca

FusariumBotrytis

Bacterias FitopatBacterias FitopatóógenasgenasPseudomonas

FITOPATFITOPATÓÓGENOSGENOS

SUSTANCIAS ANTIMICROBIANASSUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS

1. SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS CONSTITUTIVAS

☼ INHIBIDORES☼ POSINHIBIDORES

2. FITOALEXINAS

ECOSISTEMA PARECOSISTEMA PARÁÁMOMO

Páramo de Guasca (Guasca – Cundi.)

VEGETACIVEGETACIÓÓN DEL SUBPN DEL SUBPÁÁRAMORAMO

Dipolostephium phylicoides - -Diplostephyum revolutum - -Senecio formosus b,c b,cSenecio pampae b.c b,c Pentacalia corymbosa - b,cPentacalia ledifolia - b,c Pentacalia pulchella - b,cBejaria aestuans - -Gaultheria anastomosans b -Pernettya prostrata - -Vaccinium floribundum - -Cavendishia cordifolia - -Lupinus paniculatus - -Calamagrostis effusa - -Baccharis tricuneata - -Espeletia grandiflora a,b -Espeletia argentea a,b -Espeletiopsis corymbosa a,b -Ageratina vacciniaefolia a,b bAgeratina fastigiata a,b bAgeratina tinifolia a,b b

Especies vegetales A.AB A.AF

Pentacalia corymbosa (Benth.)Cuatr.(Guasg(Guasgüíüínn-- HuasgHuasgüíüín)n)

EXTRACCIEXTRACCIÓÓN DEL VEGETALN DEL VEGETALExtracto:Extracto:

Sustancias de la superficie foliarSustancias de la superficie foliar

200 g de hojas frescas se lavaron por 3 min en CHCl3(5 ml/g); el solvente fue removido por filtración y

concentrado al vacío; el residuo obtenido se trató conMe2CO y enfrió a 4 ºC durante 12 h. El flóculo fue

removido por filtración y, el filtrado resultante, fueconcentrado y secado al ambiente.

El extracto se guardó en nevera a 4ºC paraevaluarle luego su acción antifúngica

EXTRACCIEXTRACCIÓÓN CON PETRN CON PETRÓÓLEOLEO

• El material vegetal, previamente lavado con CHCl3,fue secado al ambiente y luego pulverizado.

• A 600 g, se le extrajo con éter de petróleo durante72 h, al cabo de las cuales fue filtrado y concentrado al vacío.

• El extracto se trató con Me2CO y, después de 12h de reposo se filtró a mínimo volumen y se secóal ambiente.

El extracto se guardó en nevera a 4 ºC, para evaluarluego su acción antifúngica.

EXTRACCIEXTRACCIÓÓN CON ETANOLN CON ETANOL

• El material desengrasado se extrajo porpercolación en frío con EtOH 96% v-v.

• El extracto resultante se trató con agua, sefiltró y al filtrado obtenido se le fraccionó L/Lcon CHCl3 y luego con AcOEt.

Las fracciones se concentraron, se secaron alambiente y se guardaron a 4 ºC para evaluarles,posteriormente, su acción antifúngica.

CIM ENCIM EN mgmg/ml DE EXTRACTOS DE ESPECIES/ml DE EXTRACTOS DE ESPECIESDE PENTACALIA, ANTE HONGOS FILAMENTOSOS DE PENTACALIA, ANTE HONGOS FILAMENTOSOS

Extractos F. solani A. solani R. solani C. gloeosp. T. viride1h-Pc 1,9 2,0 2,0 2,0 2,42h-Pc 2,0 2,2 2,5 2,4 2,62f-Pc 2,1 2,4 2,4 2,4 2,6 2r-Pc 2,2 2,4 2,4 2,4 2,63h-Pc 1,9 2,2 2,1 2,1 2,53f-Pc 2,1 2,4 2,3 2,1 2,53r-Pc 2,2 2,4 2,3 2,3 2,51h-Pl 1,9 2,0 2,0 2,0 2,32h-Pl 2,0 2,2 2,3 2,4 2,62f-Pl 2,2 2,4 2,4 2,4 2,62r-Pl 2,4 2,4 2,4 2,4 2,6 3h-Pl 2,0 2,2 2,1 2,1 2,53f-Pl 2,1 2,4 2,4 2,1 2,53r-Pl 2,4 2,4 2,3 2,3 2,5

EXTRACTO DE MAYOREXTRACTO DE MAYORACCION ANTIFACCION ANTIFÚÚNGICANGICA

Procedimiento:

Se extrajeron 800 g de hojas frescas por maceración en frío conCHCl3, durante 8 días; el material se extrajo una segunda vezdurante 2 días más. Los extractos se mezclaron, se concentrarony se trataron con Me2CO. Los filtrados se concentraron, se redi-solvieron en mezclas hidroalcohólicas y se extrajeron L/L con CHCl3. Estos extractos se rotularon como FCA y se guardaron en neveraa 4 ºC.

Extractos F. solani A.solani R. solani C. gloeosp. T.viride

FCA-Pc 1,1 1,1 1,1 1,1 1,2FCA-Pl 1,2 1,2 1,2 1,2 1,3

CIM ENCIM EN mgmg/ml DE LA FCA DE ESPECIES/ml DE LA FCA DE ESPECIESDE PENTACALIA, ANTEDE PENTACALIA, ANTE

HONGOS FITOPATOGENOSHONGOS FITOPATOGENOS

MMÉÉTODOS DE SEPARACITODOS DE SEPARACIÓÓN E N E IDENTIFICACIIDENTIFICACIÓÓNN

MMÉÉTODOS DE SEPARACITODOS DE SEPARACIÓÓNN•|Cromatografía en capa delgada preparativa• Fraccionamiento sobre lecho de sílica• Cromatografía en columna flash• Cromatografía en columna de sílica• Cromatografía en columna de sephadex

MMÉÉTODOS DE IDENTIFICACITODOS DE IDENTIFICACIÓÓNN• Espectrofotometría ultravioleta• Espectrometría de masas• Resonancia Magnética Nuclear

CUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIARCUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIAR

O

CH3O

HO O O

CH3O

O O

CUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIARCUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIAR

Escopoletina 7-O-geranilescopoletina

FITOQUINOLES DE LA SUPERFICIE FOLIARFITOQUINOLES DE LA SUPERFICIE FOLIAR

QUINOLES DE PENTACALIAQUINOLES DE PENTACALIA

(1-hidroxi-4-oxo-2,5-ciclohexandienil) acetato ...

Jacaranona

12

34

5

6

78

O

HO OCH3

O1

2

34

5

6

78

O

HO OCH2.CH3

O

Etiljacaranona

JACARANONAJACARANONA

MMÉÉTODO DE CRECIMIENTO RADIALTODO DE CRECIMIENTO RADIALBotrytis cinerea, Fusarium oxysporum

SUSTANCIAS ANTIFUNGICASSUSTANCIAS ANTIFUNGICAS

Escopoletina 120 1207-geraniloxilescopoletina 90 90Jacaranona 660 650Metiljacaranona 650 650

Sustancias CIM en μg/mlF.oxysporum B.cinerea

INDUCCIINDUCCIÓÓN DE ESCOPOLETINAN DE ESCOPOLETINAPATÓGENO

Virus del mosaico

Virus

VirusCeratostomella

fimbriata

Helicobasidiummompa

Phytophthorainfectans

Pseudomonassolanacearum

PLANTA

Tabaco

Tabaco

Papa

Papa

Papa

Papa

Tomate

BIBLIOGRAFÍA

Best, 1944

Andreae, 1948

Uritani, 1953

Hoshiya, 1958

Fang, 1988

Hofer, 1984

Paxton, 1944

También se ha encontrado ser inducidas por nemátodos e insectos

JACARANONAJACARANONAMarcada acción citotóxica y antitumoral

* Activo a 2 mg/kg sobre el sistema leucemia linfocítica P338* Solamente acción citotóxica marginal (ED50) a niveles de

2,1 μg/ml)

Acción inhibidora del crecimiento deSpodoptera litura (Lepidoptera)

Concentraciones inferiores a 1000 ppm

Mecanismos: como reactivos electrofílicos están implicadoscon intermediarios de la fosforilación oxidativa y en reac-ciones de eliminación. Pueden sufrir ataques nucleofílicosposiblemente por constituyentes celulares con grupo-S de

una enzima clave.

1 2

345

6

1'2'3'

4' 5'

6'

1''2''

3''4''

5''

6''

78

9

10111'''

2'''

O O

CH3O

OO

HOH

H

H HHO

HO

O HHH

CO

O

HH

OH

PENTACALIOSIDOSPENTACALIOSIDOS

O O

CH3OHH

H

H δ 6,37

δ 7,68δ 7,05

δ 7,59

δ 3,73

δ 5,73

δ 4,40

δ 5,14

δ 4,74δ 4,14

δ 4,38 δ 4,34

OO

HOH

H

H HHO

HO

O HHH

CO

O

HH

OH

HH

H

Hδ 6,32

δ 7,52

δ 3,10δ 3,23

ASIGNACIONES DE LAS SEASIGNACIONES DE LAS SEÑÑALES DELALES DELESPECTRO ESPECTRO 11HNMR DE PENTACALIHNMR DE PENTACALIÓÓSIDO ASIDO A

(1-hidroxi-4-oxo-2,5-ciclohexandienil) acetato de 6’-escopolinilo

O O

CH3OHH

H

H δ 6,37

δ 7,68δ 7,05

δ 7,59

δ 3,73

δ 5,73

δ 4,40

δ 5,14

δ 4,74δ 4,14

δ 4,38 δ 4,34

OO

HOH

H

H HHO

HO

O HHH

δ 2,35; 2,95

δ 2,14; 2,31

δ 3,10δ 3,23

CO

O

HH

OH

HH

HH

HHH

H

ASIGNACIONES DE LAS SEASIGNACIONES DE LAS SEÑÑALES DELALES DELESPECTRO ESPECTRO 11HNMR DE PENTACALIHNMR DE PENTACALIÓÓSIDO BSIDO B

(1-hidroxi-4-oxo-ciclohexanil) acetato de 6’-escopolinilo

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

1. Sobre la superficie foliar de Pentacalia corymbosaexisten sustancias “protectoras” contra hongos einsectos.

2. Estas sustancias mostraron estructuras de tipocumarínico y quinólico.

3. Las cumarinas aisladas fueron la escopoletina y la 7-O-geranilescopoletina.

4. Los quinoles aislados fueron la jacaranona y laetiljacaranona.

• PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

• COLCIENCIAS

• UNIVERSIDAD DE STRATHCLYDE(Glasgow – Escocia)

• INSTITUTO DE INMUNOLOGIA(Bogotá – Colombia)

AGRADECIMIENTOSAGRADECIMIENTOS