Investigador Responsable: Dra. Ana María Adamo

Colaboradores: De Moliner, Karina L. (a cargo de los estudiantes) Millanovich, Verónica L. Aparicio, Evangelina Milanesio, Berenice

Instituto: Departamento de Química Biológica Patológica, Facultad de Farmacia y Bioquímica. UBA. IQUIFIB-CONICET.

Alumnos: Rodrigo C. Pampin y Robby Mattes

AntecedentesAntecedentes• El grupo de investigación con el cual trabajamos, hace unos

años, se interesó por estudiar la importancia de la Ubicuitina en la degradación de proteínas en el sistema nervioso central.

Sistema NerviosoSistema Nervioso• Las principales células de este sistema son las neuronas.

• Se subdivide en el sistema nervioso periférico y el sistema nervioso central. Este último está constituido por el cerebro, el cerebelo, el tronco cerebral y la médula espinal.

• El sistema nervioso central tiene dos tipos de formaciones: La sustancia gris, y la sustancia blanca, compuesta por las prolongaciones nerviosas, dendritas y axones.

• Las funciones del axón son el transporte tanto de organelas como de otros componentes celulares y la conducción del impulso nervioso.

• Los axones están recubiertos por mielina.

Célula de SchwannMielina

Nodo de Ranvier

Dendrita

Soma

Axón

Núcleo

Axón Terminal

Sistema Ubicuitina-ProteosomaSistema Ubicuitina-Proteosoma

El sistema Ubicuitina-proteasoma es un camino proteolítico caracterizado por su alto grado de especificidad y selectividad. Este sistema está involucrado en:

•La regulación del ciclo celular•La diferenciación y el desarrollo•La respuesta celular a efectos extracelulares y al estrés•La modulación de los receptores de superficie celular y canales iónicos•La reparación del ADN•La regulación de la respuesta inmune e inflamatoria•La biogénesis de organelas

E1Ub

ATP

E1

Ub

Ub

Sustrato Proteico

U K

E3

Ub

Sustrato Proteico

U K Ub

Ub

R-Ub

E2

E2

Ub

E3

E3

Ub

Ub

UbUb

Ub

Ub

GAP-43GAP-43• La GAP-43 es una fosfoproteína específica de las neuronas. • Está localizada en la superficie interna de la membrana plasmática. • La función precisa de esta proteína no se conoce completamente pero probablemente participe

en los mecanismos de traducción de señales a nivel de la membrana del terminal nervioso. • El nivel de esta proteína está controlado por la estabilidad de su ARN mensajero pero no se

sabía nada acerca de su degradación. • El grupo de investigación con el que estamos trabajando ha demostrado que la GAP-43 es

degradada vía el sistema Ubicuitina-proteosoma (Journal of Neuroscience Research, 2005), sin embargo, no se conoce aún el sitio subcelular donde se produce la conjugación de esta proteína con ubicuitina para su posterior degradación.

GAP-43 Ubicuitina Superposición

Microscopía ConfocalMicroscopía Confocal

ObjetivoObjetivo

• Poner a punto la técnica de fluorescencia por complementación con el objeto de utilizarla para estudiar la localización subcelular donde se lleva a cabo la conjugación de la GAP-43 con ubicuitina.

Nuestro SistemaNuestro Sistema

PlásmidosPlásmidos

• Las colonias seleccionados se cultivaron durante toda la noche a 37ºC.

Amplificación de los PlásmidosAmplificación de los Plásmidos

Purificación de los PlásmidosPurificación de los Plásmidos

ElectroforesisElectroforesis• se hizo una electroforesis, tras una digestión enzimática, para comprobar la

presencia de los plásmidos en las muestras.

• Esto comprobó la presencia de los plásmidos en las bacterias

CuantificaciónCuantificación• La cantidad total de ADN se realizó midiendo la absorbancia de una alícuota de las

soluciones conteniendo los plásmidos a 260 nm y a 280 nm. La absorbancia a 260 nm se empleó para calcular la concentración de ADN. Una absorbancia igual a 1 corresponde a una solución de 50 μg/ml. La concentración de ADN en la muestra (μg/ml) es igual a 50 x A260 nm. El cociente de absorbancias 260/280 se utiliza para evaluar la pureza de la preparación. Un cociente inferior a 1.8 indica que hay impurezas.

Condiciones de la TransfecciónCondiciones de la Transfección

Vectores: YN-Ub Jun-CC

Linea celular: NIH 3T3

Agente utilizado para la transfección: Lipofectamina.

Cultivo CelularCultivo Celular• Para ver la degradación de la GAP-43 utilizamos células que no expresan esta proteína,

fibroblastos NIH-3T3.• Se cultivaron a 37ºC, bajo atmósfera de 5% de CO2 en DMEM alta glucosa conteniendo suero

fetal bovino 10% v/v, antibióticos penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 mg/ml.

Transfección Transiente de la Línea Celular Transfección Transiente de la Línea Celular Fibroblastos NIH-3T3Fibroblastos NIH-3T3

Lipidocationico

ADN

ComplejoADN-Lípido

Fibroblastos NIH-3T3

Diluir el ADN en D-MEM

Diluir la Lipofectamina en D-MEM

Agregar los complejos a las células en un 60-70% confluentes

Incubar la mezcla 45 min.

Incubar de 5 a 7 Hs..

Cambio de medio. D-MEM

alta glucosa, 10% SFB.

Transfección de CélulasTransfección de Células• Se sembraron las células sobre cubreobjetos polilisinados.• Se transfectaron con cada plásmido individualmente y se realizaron cotransfecciones con ambos

plásmidos.• Después de 24hs en cultivo las células se observaron en un microscopio de fluorescencia.

• Se pudo obtener una visualización directa de los conjugados de Jun con ubicuitina en las células transfectadas con ambas construcciones. En la imagen de las células transfectadas con ambos plásmidos se observa fluorescencia verde principalmente en el citoplasma que rodea al núcleo. Por otro lado, las células transfectadas con los plásmidos individualmente no muestran una fluorescencia marcada y la distribución de la misma es diferente a la de las células cotransfectadas.

ConclusiónConclusión• Los resultados presentados demuestran que se cumplieron los objetivos

propuestos. La visualización de los conjugados de ubicuitina es una tarea dificultosa y hasta el momento las técnicas generalmente utilizadas para la detección de los mismos incluyen inmunoprecipitación seguida de Western Blot utilizando anticuerpos específicos. Esta técnica tiene limitaciones ya que no permite el análisis de la ubicuitinización en células in vivo.

• La técnica de fluorescencia por complementación desarrollada por Deyu Fang y Tom K. Kerppola es una herramienta útil para la visualización de proteínas ubicuitinizadas en células in vivo. Una vez puesto a punto este sistema, el mismo podrá ser utilizado para la localización de conjugados de ubicuitina de cualquier proteína de interés. Teniendo en cuenta los antecedentes del grupo de trabajo, este sistema podrá ser utilizado para caracterizar la conjugación de GAP-43 con ubicuitina.

• Además, cabe destacar que se utilizaron técnicas de biología molecular siendo esta una herramienta muy útil para el estudio y compresión de diversos procesos celulares.