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PRODUCCIÓN DE SANGRE ARTIFICIAL A PARTIR DE HEMERITRINA OBTENIDA
DEL GUSANO MARINO Sipunculus nudus
Resumen
El propósito de esta investigación fue encontrar otro medio para la producción de
sangre por medio de la proteína hemeritrina encontrada en la especie de gusanos
marinos Sipunculus nudus, este proyecto va desde la obtención de la proteína hasta la
producción de la sangre, debe recalcarse que esta mezcla es artificial y es universal.
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Introducción.
Una de las necesidades en las que se enfrenta el sistema de salud a nivel mundial es la
demanda de las transfusiones de sangre que existe. Las transfusiones de sangre
permiten salvar vidas y mejorar la salud. Se puede decir, que nueve de cada diez
personas necesitarán una transfusión de sangre en algún momento de su vida; debido
a alguna cirugía o por motivo de algún accidente pero muchos de estos cuando
requieren de una transfusión no pueden acceder por las limitaciones que el sistema
presenta, esto debido a que no se cuenta con la cantidad suficiente o no se cuenta con
el tipo de sangre requerida.
Actualmente se cuenta con numerosas campañas de concientización y aun así las
tasas de donación son inferiores al uno por ciento de la población
Una transfusión de sangre es un procedimiento médico relativamente sencillo durante el
cual un paciente recibe sangre o algún componente de la sangre a través de una vía
intravenosa. Ésta puede utilizarse para reponer una pérdida de sangre o de una parte
de ésta.
Es raro el caso en donde se lleve a cabo una transfusión de sangre completa. En vez
de eso, se hacen transfusiones de los componentes de la sangre que se necesitan. Los
glóbulos rojos, la parte que se transfunde más a menudo, se utilizan para incrementar la
capacidad de la sangre de transportar oxígeno y para evitar el agotamiento y otras
complicaciones
Teniendo en cuenta que en el mundo millones de pacientes no tienen acceso a este
recurso cuando lo necesitan (generalmente cuando sufren enfermedades crónicas,
complicaciones en el parto, cirugías o accidentes de tránsito) diversos científicos han
dedicado años de trabajo al desarrollo de sangre artificial.
En la actualidad, la sangre artificial se trabaja mediante perfluorocarbonos (PFC), un
líquido claro e inerte de consistencia similar al aceite, o soluciones de hemoglobina, que
utilizan elementos vivos como placenta humana, sangre vacuna o bacterias. Entre los
avances más recientes, científicos del Centro Escocés de Medicina Regenerativa
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obtuvieron a mediados de este año el permiso para desarrollar sangre a partir de
células madre adulta. Esto permitiría transportar de manera efectiva oxígeno y dióxido
de carbono por todo el cuerpo.
La manera alternativa en que se busca producir sangre por medio de gusanos marinos
(proteína), sal y agua; se conoce de un estudio que se llevado a cabo por el doctor
Silaghi-Dumitrescu, sus investigaciones están enfocadas a lograr un fluido estéril, que
no conlleve riesgos de infección durante la transfusión, ni requiera tanta refrigeración, a
fin de que pueda ser aplicada en humanos de manera instantánea, en situaciones de
emergencia.
La sangre se compone principalmente de un tipo de proteína que se encuentra en
gusanos marinos llamados Anélidos poliquetos (Polychaete annelid), llamada
hemeritrina. Se encontró que la proteína de los gusanos resiste más tipos de estrés que
la hemoglobina que es la proteína principal de la sangre humana.
Estas investigaciones tienen el fin de aportar alternativas seguras y que puedan
almacenarse de una forma eficiente y sin cuidados especiales para cualquier tipo de
emergencia.
Cabe señalar que la sangre artificial no es un sustituto de sangre, sino que es un medio
de protección que ayuda al organismo a regenerar su sangre en tan solo 24 horas sin la
necesidad de exponerse a riegos mortales.
Nuestra investigación está dirigida a sostener todas las cuestiones planteadas
anteriormente con el desarrollo teórico de proponer otra especie marina para la
ampliación de materia prima en la obtención de hemeritrina.
El Sipunculus nudus es también una especie marina, que porta la proteína estudiada
para la producción de sangre artificial, pretendemos que sea una opción para la
extensión de nuestro panorama en la búsqueda de otra especie que nos ayude en la
elaboración de esta nueva fuente de sangre.
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Antecedentes.
Transfusiones de sangre.
El almacenamiento y transfusión de sangre estéril compatible o de componentes de la
sangre es un procedimiento de rutina que salva vidas. Su desarrollo tiene una larga
historia y ha dependido de los experimentos con animales realizados por varios
médicos y científicos. Actualmente se hacen alrededor de 88 millones de donaciones de
sangre cada año, suficientes para llenar 32 piscinas olímpicas, a pesar de que todavía
no son suficientes para cubrir la demanda. La investigación sigue encontrando formas
alternativas de abastecerse de sangre e incluso alternativas a la sangre. (George Crile,
2011)
Donación de sangre a nivel mundial.
El 65% de las donaciones de sangre se hacen en los países desarrollados, que solo
representan un 25% de la población mundial. Las tasas de donación siguen siendo
inferiores al 1% de la población (el mínimo necesario para atender las necesidades
básicas de un país) en 73 países, 71 de los cuales son países en desarrollo o en
transición. En 42 países los donantes voluntarios no remunerados, que son la fuente
más segura, aportaron menos del 25% de las donaciones. En 2007, 31 países seguían
obteniendo donaciones remuneradas, que totalizaron más de un millón de donaciones.
En 41 países no se realizaron en toda la sangre donada pruebas de detección de una o
más de las siguientes infecciones transmisibles por transfusión: VIH, hepatitis B y C, y
sífilis. (Bagozzi, 2009)
De los 85,4 millones de donaciones hechas en 2007, aproximadamente el 65%
correspondieron a los países desarrollados, que solo representan aproximadamente un
25% de la población representada. (Bagozzi, 2009)
Las donaciones por 1000 habitantes, que también reflejan la disponibilidad general de
sangre en un país, son muy variables, y la menor disponibilidad corresponde a los
países en transición y en desarrollo. La tasa media de donaciones fue de 38,1/1000
habitantes (entre 4,92 y 68,01) en los países desarrollados, de 7,5 (entre 1,07 y 35,18)
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en los países en transición, y de 2,3 (entre 0,40 y 7,46) en los países en desarrollo. Se
registraron menos de 10 donaciones por 1000 habitantes en 73 países, 71 de los cuales
son países en desarrollo o en transición. (Jose, 1997)
Según las estadísticas, cada año en el todo el mundo se donan cerca de 80 millones de
litros de sangre, que es el equivalente a 40 piscinas olímpicas. Estos datos también nos
arrojan unas cifras en las que se indica que el 54% de los donantes de sangre son
hombres, correspondiendo el 46% a las mujeres. Si diferenciamos por edades, el 41%
de los donantes tienen entre 31 y 45 años, el 35% corresponde a los que abarcan la
franja de 18 a 30 años y 24% restante a los de 46 a 65 años. Una reciente encuesta
entre personas que habían donado sangre en alguna ocasión mostró que un 45,4% de
los preguntados dado sangre por solidaridad y altruismo y un 19,8% porque lo había
necesitado un familiar y/o conocido. (20 minutos, 2014)
Donación de sangre en México.
En México la recuperación de sangre es de menos del 65% del 100% necesario (en
Latinoamérica es de apenas 37%). Del total de la sangre donada, sólo el 2% es
voluntario. 90% de 6 mil 500 donadores (cifra anual de 2011) acude porque tiene a un
ser querido hospitalizado. De los 80 países del mundo con un bajo índice de
donaciones de sangre (menos de 10 donaciones por cada mil personas), 79 son
naciones en desarrollo (es el caso de México). (Mexicana, 2012)
Investigaciones y avance en las transfusiones sanguíneas.
Richard Lower fue el primero en realizar una transfusión sanguínea de animal a animal
y de animal a humano, ambos en 1665. La primera transfusión sanguínea
documentada, de humano a humano y con resultado exitoso no se produjo hasta 1830,
cuando James Blundell transfirió sangre de su asistente a una mujer que sufría
hemorragia posparto. (Dr. Decaro Jorge, 2010).En esos tiempos la transfusión
sanguínea era un procedimiento técnicamente difícil: los únicos aparatos disponibles
eran plumas de animales o tubos de plata, y no había forma de prevenir la formación de
coágulos de sangre. A pesar de esto, su práctica continuó como un procedimiento
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extremo y pronto se usaron nuevas soluciones intravenosas como una solución salina,
leche y albúmina extraída de huevo. (Dimitrescu, 2013)
Los experimentos con animales, que se desarrollaron entre los años 1900 y 1916,
permitieron que las transfusiones se convirtieran gradualmente en el tratamiento
rutinario que conocemos en la actualidad. En 1907, George Crile perfeccionó la técnica
de la transfusión de arteria a vena, usando perros, tal como describió en su aplicación a
32 pacientes. El protagonista del siguiente mayor logro fue Adolph Hustin, quién en
1914 halló que añadir citrato de sodio a la sangre impedía que ésta se coagulara y
podía entonces transferirse a perros con seguridad. En 1915, Richard Lewinsohn
fomentó este descubrimiento al establecer la máxima cantidad de citrato que podría
transferirse a perros sin que provocara toxicidad. Esto reveló la concentración máxima
de citrato de sodio que podía añadirse a la sangre para conseguir un efecto
anticoagulante óptimo. (Crile, 2011)
El siguiente avance se produjo en 1915 cuando Richard Weil mostró que esta sangre a
la que se había añadido citrato, podía almacenarse durante dos días y mantener su
efectividad al ser transferida a cobayas y perros que habían perdido sangre. A estos
experimentos le siguieron el trabajo de Peyton Rous y Joseph Turner en conejos en
1916, que demostró que con determinados aditivos y el tratamiento adecuado, la
sangre podía almacenarse durante 14 días y posteriormente administrarse con éxito
mediante transfusión. (George Crile, 2011)
Sangre artificial.
En 2011, un sustitutivo de la sangre derivado del plasma de vaca se usó para salvar la
vida de una mujer a la que sólo le quedaba un litro de sangre en el cuerpo pero que su
religión impedía una transfusión sanguínea convencional. En este caso se usó un
transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (Hemopure) que no requiere la
compatibilidad de tipos sanguíneos y puede durar hasta tres años sin refrigeración.
(Jonathan, 2012)
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Esta es una de las llamadas sangres artificiales, diseñadas para aumentar el transporte
de oxígeno en el cuerpo después de una fuerte pérdida de sangre. Sin embargo, éstas
han tenido una historia controvertida. (Jonathan, 2012)
Un metaanálisis de estudios sugirió que el uso de sangre artificial ha aumentado en un
30% el riesgo de muerte. La FDA atrajo las críticas de las fuerzas navales de los EEUU,
quién habían financiado la mayor parte de las investigaciones. Las críticas se
fundamentaban en que la FDA había interrumpido los ensayos clínicos, y el autor del
metaanálisis fue denunciado por una de las empresas que desarrolló el tratamiento.
(Saulo, 2012)
En la actualidad, la sangre artificial se trabaja mediante perfluorocarbonos (PFC), un
líquido claro e inerte de consistencia similar al aceite, o soluciones de hemoglobina, que
utilizan elementos vivos como placenta humana, sangre vacuna o bacterias.
(dimitrescu, 2014)
Cultivo de glóbulos rojos.
Los investigadores también han estado trabajando en la creación de una reserva
continua de glóbulos rojos provenientes de células madre embrionarias. Después de un
primer desarrollo de esta técnica en ratones, investigadores japoneses desarrollaron
una línea de células madre embrionarias humanas inmortalizadas que podían usarse
indefinidamente para producir glóbulos rojos. El trabajo en este campo se ha retrasado
indefinidamente debido a inquietudes éticas y problemas para obtener licencias para el
uso de células derivadas de embriones humanos. (Diego, 2014) A pesar de estas
precauciones se espera que los ensayos clínicos empiecen pronto.
En el año 2011 se cultivaron glóbulos rojos de células madre hematopoyéticas
extraídas de médula ósea. Estos cultivos produjeron 10 billones de células (el
equivalente a 2 mililitros de sangre) y, después de pruebas iniciales en ratones, estas
células se inyectaron de nuevo a la médula ósea del donante. Se observó que se
comportaban igual que glóbulos rojos normales, de modo que esta técnica parece
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prometedora, a pesar de que el reto se mantiene en magnificar el proceso para obtener
grandes cantidades. (Emma, 2014)
Sangre artificial obtenida a través de la hemeritrina de gusanos marinos Anélidos
poliquetos.
Científicos de la Universidad Babeş-Bolyai, en Rumania, desarrollaron un compuesto
muy similar a la sangre. El doctor Radu Silaghi-Dumitrescu, líder de esta investigación,
menciona que está fabricado a partir de albúmina (principal proteína de la sangre, que
se sintetiza en el hígado), agua, sal y una proteína obtenida de gusanos marinos. Hasta
el momento, han sido muchos los intentos por crear sangre artificial; sin embargo, no se
había logrado que las sustancias obtenidas resistieran el estrés mecánico y químico. La
sangre está compuesta por hemoglobina, que se encarga de transportar oxígeno
obtenido de los órganos respiratorios a los tejidos, en este caso, el fluido artificial
creado por el equipo rumano, contiene hemeritrina, una proteína que ha mostrado ser
sumamente resistente a varios tipos de estrés. En su laboratorio, el doctor Silaghi-
Dumitrescu transfirió la sangre desarrollada a ratones sin que éstos presentaran alguna
enfermedad o efecto adverso; el siguiente paso es que dicho compuesto trabaje por
horas en el cuerpo de los roedores. El doctor Silaghi-Dumitrescu sigue trabajando para
lograr un fluido estéril, que no conlleve riesgos de infección durante la transfusión, ni
requiera tanta refrigeración, a fin de que pueda ser aplicada en humanos de manera
instantánea, en situaciones de emergencia. (Martínez, 2013)
Hemeritrina.
Es una proteína que se encuentra en los glóbulos sanguíneos de algunos anélidos y de
unos pocos braquiópodos. La proteína hemeritrina es responsable del enlace y
transporte de O2 en algunos invertebrados. A pesar de su nombre, no contienen grupos
hemos. (J.C., 2014)
El trabajo hecho por los investigadores rusos se hizo con anélidos poliquetos, los
poliquetos constituyen el grupo más numeroso de anélidos, estos son de vida marina,
habitando en las zonas litorales y neríticas, estos gusanos son difíciles de hallar y no en
toda región abundan, nosotros usaremos el gusano marino llamado Sipuncúlido nudus,
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el cual contiene igual la proteína hemeritrina. (Dimitrescu, Ferric carboxymaltose
improves exercise capacity and quality of life in patients with pulmonary arterial
hypertension and iron deficiency: A pilot study., 2014)
Anélidos Poliquetos.
Son los gusanos anillados, pues su cuerpo está formado por una serie de anillos o metá
meros de anatomía muy parecida. (Tirsoferrol)
Podemos definir a los anélidos como mazoos triblásticos con simetría bilateral,
esquizocelomados y protóstomos.
El mayor avance del filo esta representado por la metamería.La cavidad celómica alcan
za un alto grado de desarrollo.
La región cefálica se especializa con órganos diferenciados, tales como tentáculos,
palpos y ojos rudimentarios de los poliquetos.
El sistema nervioso está formado por ganglios cerebroideos, dos cordones que no
recorren el cuerpo y ganglios con sus ramas laterales.
Las tres grandes clases del filo de los Anélidos son:
Clase Poliquetos (unas 5.300 especies), Son gusanos con cerdas, sobre todo
marinos y a menudo luminiscentes
Clase Oligoquetos (unas 3.100 especies), que son, sobre todo, terrestres o viven
en el suelo, como la lombriz de tierra;
Clase Hirudíneos (unas 300 especies), Son las sanguijuelas, en su mayoría, de
agua dulce pero también pueden ser marinas o terrestres. (Tirsoferrol)
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Poliquetos.
El cuerpo es alargado y sección redondeada, con la boca en un extremo y el ano
en el otro, presenta simetría bilateral. Está compuesto por varias unidades
similares, o segmentos, separados externamente por surcos y en su interior por
tabiques.
Los segmentos suelen tener unos lóbulos (parápodos) con cerdas que
pertenecen al sistema de locomoción. (Garza, 2013)
El sistema digestivo está formado por un tubo recto y el sistema nervioso tiene
órganos sensoriales poco desarrollados.
Los poliquetos crecen por adición de segmentos al cuerpo en el extremo
posterior, algunos son depredadores activos. Tienen un modo de vida sedentario
y extraen partículas de agua o depósitos en el fondo.
Aparato circulatorio debido a que no hay continuidad entre las cavidades
celómicas el sistema no puede ser abierto, sino que ha de ser cerrado.
Está constituido por dos grandes vasos: ventral y dorsal. La hemolinfa circula de
la parte posterior hacia delante en el vaso dorsal, y al contrario en el vaso ventral
En la superficie de las branquias se realiza el intercambio de gases, ya que
estas están muy irrigadas. En ocasiones también se puede realizar a través del
cuerpo.
La fecundación es externa presenta una larva trocófora similar a la de los
moluscos
(Garza, 2013)
Sipuncúlidos
Los Sipunculus o sipuncúlido son un filo de animales protóstomos celomados, marinos
y con el cuerpo no segmentado. Se conocen entre 144 y 320 especies. Se les
denomina gusanos cacahuate.
Normalmente no sobrepasan los 10 cm de largo. Su característica más destacable es
su boca, rodeada por un anillo de tentáculos retráctiles. El tracto digestivo, en forma de
U helicoidal, pasa de la cavidad oral a la parte posterior del cuerpo para luego remontar
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y acabar en un ano en el costado del animal; algunos grupos poseen una estructura
calcificada anal (y una porción calcificada posterior. (Adina, 2013)
Presentan celoma, pero no aparato circulatorio, aprovechan los fluidos intersticiales
para el transporte de oxígeno y nutrientes. El celoma está separado en dos porciones
por un saco de compensación; se distingue un celoma del introverto y otro del cuerpo.
El exterior del cuerpo está muy muscularizado y les permite encogerse hasta parecer
un cacahuate. (Dumitrescu, 2013)
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Objetivos generales:
Purificación de la proteína hemeritrina a partir del gusano marino de la especie
Sipunculus nudus para su uso en la preparación de sangre artificial.
Objetivos particulares:
Búsqueda de secuencias homologas de la proteína hemeritrina.
Secuenciar la proteína.
Obtener la secuencia nucleotidica y el marco de lectura completo.
Expresión de la proteína con plásmidos de expresión
Producción de la proteína.
Preparación de la sangre artificial.
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Metodología
Nos daremos a la tarea de buscar en bases de datos secuencias tanto del genoma
completo como del mRNA, esto nos ayudará a conocer la secuencia de nucleótidos del
cual está compuesta la proteína y poder obtener el marco de lectura completo.
Reiteramos la utilización de base de datos para encontrar el marco de lectura en la
secuencia de ADN, este nos da la traducción de la proteína correspondiente y a la vez
nos dará instrucciones para hacer una proteína completa.
(NCBI National Center for Biotechnology Information)
Ya teniendo la secuencia de nucleótidos ésta será insertada en un vector o vehículo de
clonación, el cual consiste en una molécula de ADN capaz de replicarse de forma
autónoma. Entre los vectores más utilizados se encuentran los plásmidos ya que estos
pueden replicarse independientemente del cromosoma principal. Los más comunes son
E.Colli y Saccharomyces Cerevisiae.
(LA GUÍA)
Queremos mencionar que para nuestro sistema se utilizará Saccharomyces Cerevisiae,
dado que es una levadura eucarionte y nuestra proteína proviene de un organismo
eucarionte.
Dependiendo de su origen, las levaduras son ricas en proteína y vitaminas (Martínez et
al., 2001), además poseen la propiedad de no ser tóxicas, presentan alta digestibilidad,
elevado contenido en proteínas, grasas, carbohidratos.
Las células de la levadura se multiplican rápidamente por gemación, una forma
asimétrica de reproducción asexual: a partir de una célula se origina una protuberancia
que va creciendo y acaba dando lugar a otra célula, más pequeña (al principio) que la
célula inicial y diferenciada genéticamente de la célula original. En condiciones óptimas,
este tipo de reproducción dura unas dos horas y permite la colonización total de los
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mostos en cuestión de horas o días. El rápido crecimiento ha sido clave a la hora de
elegir esta levadura como herramienta para la investigación y las aplicaciones
biotecnológicas.
(Consejo Superior de Investigaciones Cientifícas (CSIC))
Una vez que obtengamos la secuencia nucleotídica de la hemeritrina, procederemos a
aislar el ARNm (ARN mensajero) el cual codifica a la proteína de interés, esto lo
haremos con el propósito de obtener una copia del ADN de la proteína mediante la
transcriptasa reversa, ésta copia llamada ADNc (ADN complementario), no presentará
intrones, lo cual permitirá que la proteína se exprese correctamente dentro de un
huésped que será nuestro vector de expresión el ADNc en la célula de levadura para su
replicación, éste huésped eucariótico no distinguirá entre el ADN extraño y el propio, y
la maquinaria celular continuará el programa genético de replicación, transcripción y
traducción de los genes que se han introducido.
(LA GUÍA)
(Manipulación de la expresión)
Separación o recuperación de las proteínas
El siguiente paso se llevara a cabo por medio de la purificación de las proteínas, el cual
depende de la localización de la Proteína, la cual también proporciona ciertas ventajas
según cada caso.
Si la proteína se acumula en el citoplasma, el primer paso es la ruptura celular, por
medios mecánicos o químicos.
La acumulación en el citoplasma lleva a la acumulación de cuerpos de inclusión, lo que
depende de factores como la secuencia de la proteína, la fuerza del promotor, la
temperatura, velocidad de crecimiento, etc. Los cuerpos de inclusión pueden tener
agregadas grandes cantidades de contaminantes como ADN, ARN y chaperonas, por
mencionar haciendo que la proporción de proteínas en el cuerpo de inclusión llegue a
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ser baja .Si las proteínas son acumuladas en el espacio periplásmico, la aplicación de
un choque osmótico permite la extracción de la proteína a la vez que causa muy poco
daño a las células.
La recuperación de la proteína puede llevarse a cabo empleando filtros de diversos
tamaños y con superficie cargada. Los ácidos nucleicos pueden ser removidos
mediante extracciones o bien agregando agentes policatiónicos como la polietinilamina.
La proteína puede ser capturada o precipitada selectivamente empleando una variedad
de materiales que han sido desarrollados para este propósito, como algunas resinas de
interacción hidrofóbica (Kato y col, 2004).
(Lara, 2011)
Cuando ya se tenga la proteína purificada, se dispone a preparar la sangre artificial,
esta mezcla estará compuesta por agua, sales, la proteína hemeritrina y albúmina
como agente contra los factores de estrés. (Tu discovery)
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