SELECCIÓN DE PROGENIES DE ENCINA (Quercus ilex L. spp ballota) Y

ALCORNOQUE (Q. suber L.) TOLERANTES

Departamento de Ciencias AgroforestalesEscuela Técnica Superior de Ingeniería

(Quercus ilex L. spp ballota) Y ALCORNOQUE (Q. suber L.) TOLERANTES

AL PATÓGENO Phytophthora cinnamomiRands

INTRODUCCIÓN

Control

No es fácil establecer un método de control ante P. cinnamomi. ¿por qué?

- Amplia gama de huéspedes a los que afecta

- Longevidad de estructuras de

EL DECAIMIENTO DE LOS QUERCUS.

- Longevidad de estructuras de resistencia

- Facilidad de propagación

Métodos químicos:

- Aplicación de fungicidas sistémicos( García et al., 1993)

- Aplicación de fertilizaciones de fósforo ( Fernández-Escobar et al., 1999; 2002)

2

¿Alternativas de lucha contra el decaimiento?

INTRODUCCIÓN

Estudios de variabilidad genética.

Ante el ataque de patógenos las plantas actúan mediante diferentes mecanismos (Larcher 1995):

EL DECAIMIENTO DE LOS QUERCUS.

mecanismos (Larcher 1995):- Mecanismos evitadores: respuestas que tienden a evitar o prevenir el estrés.

- Mecanismos tolerantes: adaptaciones que permiten soportar o resistir el estrés.

Resistencia de progenies y líneas clonales a P.cinnamomi en árboles de:

• Eucaliptus spp (Stuckely et al., 1994; Hüberli et al., 1997)

• Castanea spp (Marçais et al., 1996)

• Quercus spp

3

OBJETIVOSOBJETIVO PRINCIPAL:

- Selección de progenies de Q.ilex spp ballota y Q.suber con alto grado de tolerancia a P.cinnamomi.

- Selección de genotipos

FINANCIACIÓN Y PARTICIPANTES• Programa Interreg III 2004-2006

4

• Programa Interreg III 2004-2006

• Consejería de innovación, Ciencia y empresa, Junta de Andalucía (2008-2012)

• Universidad do Algarbe, INIA Oeiras, UHU.

Metodología. 1/2

Material vegetal:

- 2 especies (encina y alcornoque).

- 7 procedencias

- 20 familias por procedencia.

- Plantas de 1 savia procedentes de semilla.

Preparación del inóculo:

- Tres tipos de sustratos (N, P, A):- Tres tipos de sustratos (N, P, A):

- N: Tierra natural cogida de un foco de infección.

- P: El sustrato N pero parcialmente pasteurizado.

- A: El sustrato P pero infectado artificialmente.

Cultivo

- Pregerminación en laboratorio

- Trasferencia a envase forestal de 300cc

-Cultivo en invernadero con riego abundante

-- Dos sitios de ensayo Huelva y Oeiras

Ribatejo

Tras os

Montes

Algarve

Huelva Málaga

Baixo Alentejo

Ribatejo

Estremadura

Alto Alentejo

Metodología. 2/2

Diseño del experimento:

- 2 especies (encina y alcornoque).

- Tres niveles de infección de P. cinnamomi (N, P, A):

- N: Tierra natural cogida de un foco de infección.

- P: El sustrato N pero parcialmente pasteurizado.

- A: El sustrato P pero infectado artificialmente

- 7 procedencias de cada especie.- 7 procedencias de cada especie.

- 20 familias por procedencia.

- 10 plantas por familia y tipo de sustrato en 10 bloques completos.

-Ensayos en La Rábida y en Oeiras (Portugal)

Parámetros medidos:

- Supervivencia y crecimiento (H, D, Peso).

- Síntomas de la infección.

Análisis de datos:

- UNIANOVA con SPSS v12

- Factores: procedencia, familia, sustratos y bloque.

Resultados 1/8

Alcornoques Encinas

-Se aprecia un mayor susceptibilidad a la enfermedad en las encinas, apreciable desde el momento de la germinación de las semillas.

l

20

30

40

50

60

70

80

90

100

supe

rviv

enci

a (%

)

Q. ilex

Q. suber

Resultados 2/8

• Supervivencia de encinas y alcornoques en los tres niveles de infección del sustrato con P. cinnamomi. A: artificialmente infestado, P: parcialmente pasteurizado, N: Naturalmente infestado. (Todos: promedio general del ensayo).

0

10

A N PNiveles de infección

40

50

60

70

80

90

100

A

Results 3/8

40

50

60

70

80

90

100

surv

ival

(%

)

A

N

P

0

10

20

30

40

Marzo Abril Mayo Junio Agosto

P

N

todos

evolution de la superviencia de alconoque y encina en los tres niveles deinfección del sustrato con P. cinnamomi. A: artificialmente infestado,P: parcialmente pasteurizado, N: Naturalmente infestado. (Todos:promedio general del ensayo).

0

10

20

30

40

march april may june augustdate

surv

ival

(%

)

P

total

Q. suberQ. ilex

20

30

40

50

60

70

80

90

100

AlgarbeBadajozBaixo AlentejoMálagaHuelva

N

70

80

90

100

P

Resultados 4/8

Q. ilex

• Figura 3. Evolución de los porcentajes de supervivencia de las 7 regiones deprocedencia de Quercus ilex en los tres niveles de infección: N (naturalmenteinfestado), P (parcialmente pasteurizado) y A (Artificialmente infestado).

0

10

Marzo Abril Mayo Junio Agosto

HuelvaGranadaLa Rioja

0

10

20

30

40

50

60

70

Marzo Abril Mayo Junio Agosto

AlgarbeBadajozBaixo AlentejoMálagaHuelvaGranadaLa Rioja

Algarbe

A

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

A

P

N

global

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

Q. ilex

Results 7/8

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

freq

uecy

(%)

A

N

P

total

Q. suber

0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Supervivencia (%)

0

0 2 4 6 8 10 12 14Altura (cm )

0,00

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Survival (%)

Distribución de la supervivencia de progenies de encinas y alcornoques en los tres niveles de infección del sustrato con P. cinnamomi. A: artificialmente infestado, P: parcialmente pasteurizado, N: Naturalmente infestado. (Todos: promedio general del ensayo).

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

Fre

qu

en

cyLa Rábida

Oeiras

Total

Q. suber

0,00

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Survival (%)

Distribución de la supervivencia de progenies de alcornoques en los dos sitios de ensayo

30

40

50

60

70

80

90S

urvi

val (

%)

La Rabida

Oeiras

0

10

20

Algarve Alto Alen Baixo Ale Estremadu Huelva Malaga Ribatejo Tras os Mprovenance

supervivencia de procedencias de alcornoques en los dos sitios deensayo

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

A

P

N

global

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

Q. ilex

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

%

A

P

N

Total

Q. suber

0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Supervivencia (%)

0

0 2 4 6 8 10 12 14Altura (cm )

0,00

0 10 20 30 40 50 60 70Height (cm)

Distribución de la altura media de progenies de encinas y alcornoques en los tres niveles de infección del sustrato con P. cinnamomi. A: artificialmente infestado, P: parcialmente pasteurizado, N: Naturalmente infestado. (Todos: promedio general del ensayo).

Evaluación de la influencia sobre el sistema radical de la dosis de

inóculo, especie hospedadora y procedencia de las semillas en la infección de inóculo, especie hospedadora y procedencia de las semillas en la infección de

P.cinnamomi a Q. ilex y Q. suber.

16

Material y métodos

• Material vegetal: semillas de encina y alcornoque recogidas durante los meses de octubre y noviembre de 2008 de dos regiones de procedencia diferentes.

• Siembra y plantación: febrero 2009 durante 1 año.2009 durante 1 año.

• Inóculo: cepas P45, P37 y P203 de P.cinnamomi cultivadas en V8.

• Infección: 10 ml de inóculo infectivo inyectado a lo largo del cepellón.

• Trasplante: 25 plantas en caja de poliestireno expandido de 45 litros con sustrato perlita.

Material y métodos

Clase Porcentaje de afección Sintomatología radicular Sintomatología aérea

0 0-10%

Necrosis radicular Defoliación y/o marchitez foliar1 10-25%2 26-75%3 76-90%4 91-100%

Material y métodosEfecto de la dosis del inóculo infectivo

100 plantas de un año de edad de cada especie; 3 dosis + testigo; 25 plantas por tratamiento.Duración del ensayo: 1 mesParámetros medidos: Ψ, PRN, LRN, PRS, PRP, VR, PTP, LTP, NHJ y VA.Análisis de datos: ANOVA � modelo lineal general (GLM). Test Tukey-b. Correlación de Pearson.Dosis Composición del inóculo infectivo

D1 Contenido de micelio de 1,5 placa Petri de 15 cm de diámetro en medio V8(½ de cada cepa) de P. cinnamomi + 300 ml agua destilada para 30 plantas.

D3 Contenido de micelio de 6 placa Petri de 15 cm de diámetro en medio V8 (2 de cada cepa) de P. cinnamomi + 300 ml agua destilada para 30 plantas.

D5 Contenido de micelio de 24 placa Petri de 15 cm de diámetro en medio V8 (8 de cada cepa) de P. cinnamomi + 300 ml agua destilada para 30 plantas.

Correlación de Pearson.

Material y métodosDiferencias entre especies

380 plantas de un año de edad de cada especie.Duración del ensayo: 4 meses.Parámetros medidos: VA, VR.Análisis de datos: ANOVA � modelo lineal general (GLM).

20

Resultados

C

D1

D3 D5

1

1,5

2

2,5

ΨΨ ΨΨ(M

pa)

Q. ilex

Dosis Q. ilex

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14PRN (g)

Isabel María León Sánchez Universidad de Huelva

21

C

0

0,5

1- ΨΨ ΨΨ

0,00

0,02

C D1 D3 D5

0

5

10

15

20

25

C D1 D3 D5

LRN (cm)PRN LRN PRS PRP LRP PTP LTP NHJ VR

LRN 0,785** 1

PRS 0,191 0,234 1

PRP 0,139 0,223 0,367** 1

LRP 0,025 0,183 -0,174 0,314* 1

PTP 0,054 0,109 0,430** 0,620** -0,088 1

LTP 0,088 0,116 0,424** 0,438** -0,144 0,816** 1

NHJ 0,146 0,171 0,228 0,249 -0,031 0,464** 0,551** 1

VR -0,129 -0,260* -0,426** -0,338** -0,042 -0,396** -0,323* -0,087 1

VA 0,118 0,101 -0,15 -0,206 0,065 -0,042 0,05 -0,034 0,042

ResultadosDosis Q. suber

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

0,014

0,016

0,018P/L

1,9

2,1

2,3

2,5

2,7

2,9

- ΨΨ ΨΨ(M

Pa

)

Q. suber

Isabel María León Sánchez Universidad de Huelva

22

0

0,002

C D1 D3 D5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

C D1 D3 D5

VR

0

10

20

30

40

50

C D1 D3 D5

R

1,5

1,7

1,9

C D1 D3 D5

ResultadosDiferencias entre especies

1

1,5

2

2,5

3

3,5

VA

Control

Inoculada

1

1,5

2

2,5

3

VR C

I

Isabel María León Sánchez Universidad de Huelva

23

0

0,5

1

Encina Alcornoque 0

0,5

1

Encina Alcornoque

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 1 2 3 4 5

- ΨΨ ΨΨ(M

pa

)

Qi

Qs

Evaluación de la tolerancia/susceptibilidad de distintas

progenies de Q.ilex spp ballota y Q. suber al patógeno P.

cinnamomi Rands.

24

Material y métodosTemporada otoñal 2009/2010

200 semillas por árbol:

98 progenies de Q.ilex y 69 progenies de Q.suber.

Villanueva de los Castillejos (HR)Puebla de Guzmán (PG)

Selección de progenies

Puebla de Guzmán (PG)Las Herrerías (HE)Paymogo (PAY)Castaño del Robledo (CR)Zalamea la Real (ZR)Campofrío (CP)Cortes de la Frontera (CO)Los Barrios (BA)Bajo Alentejo (ABA)Alto Alentejo (AA)Algarve (ALG)

25

Material y métodos

26

Material y métodos

1. Duración: 6 meses.2. Parámetros evaluados: PRN, LRN, DIRP, P, R, F y VR.3. Total de plantas evaluadas:

Evaluación de tolerancia de progenies de Q.ilex y Q.suber a P.cinnamomi .

3. Total de plantas evaluadas:- 5 inoculadas y 2 control en Q.i de 80 progenies

diferentes.- 5 inoculadas y 2 control en Q.s de 64 progenies

diferentes.4. Análisis estadístico: GLM Univariante con los factores fijos tratamiento (T) y progenie (Pr).

Material y métodos

28

ResultadosEvaluación de la tolerancia de progenies de Q.ilex a P. cinnamomi

PRN LRN DIRP P R F VR

p T <0,001 <0,001 0,935 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001p Pr <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,653

p Pr*T <0,001 <0,001 0,868 0,002 <0,001 <0,001 1

0,2

0,25

PRN (g)35

40R

0

0,05

0,1

0,15

0,2

PGE6

CPE10

HRE8

HRE10

PRN LRN DIRP P R F VR

C 0,185±0,014 37,542±2,179 4,078±0,091 5,013±0,325 32,320±2,182 10,807±0,523 1,022±0,044

I 0,047±0,003 11,078±0,600 4,061±0,055 1,661±0,097 10,352±0,760 3,254±0,164 2,247±0,050

0

5

10

15

20

25

30

COE22

CPE10

HRE4

PGE7

ResultadosIR= PRN+LRN+P+R+F

FAMILIA IR GT FAMILIA IR GT FAMILIA IR GT FAMILIA IR GT

CPE10 7,336 HT HEE10 1,121 Tl HEE3 -0,269 S HRE2 -1,441 S

PGE6 5,302 HT CPE4 1,079 Tl ZRE6 -0,290 S ZRE7 -1,469 S

PAYE7 4,798 HT ZRE9 0,907 MT HRE13 -0,327 S HRE4 -1,588 S

ZRE8 3,564 HT HEE8 0,893 MT COE8 -0,357 S COE14 -1,608 S

PGE15 3,551 HT HEE5 0,725 MT ZRE11 -0,365 S HRE11 -1,700 S

COE22 3,397 HT COE7 0,691 MT ZRE12 -0,499 S HEE7 -1,766 S

Evaluación de la tolerancia de progenies de Q.ilex a P. cinnamomi

Nyassé et al., 1995

30

COE22 3,397 HT COE7 0,691 MT ZRE12 -0,499 S HEE7 -1,766 S

PAYE10 2,998 HT CPE3 0,564 MT COE24 -0,501 S PAYE8 -1,842 S

PGE4 2,626 HT PGE13 0,559 MT HEE9 -0,711 S PGE11 -1,954 S

COE31 2,621 HT COE1 0,529 MT CPE5 -0,730 S ZRE4 -2,117 HS

CPE8 2,376 HT CR3 0,472 MT HEE12 -0,771 S PAYE2 -2,583 HS

COE23 2,231 HT COE6 0,463 MT COE9 -0,848 S HRE3 -2,626 HS

CPE1 1,994 Tl HEE14 0,434 MT PAYE4 -0,883 S HRE9 -2,639 HS

COE15 1,937 Tl PAYE9 0,383 MT COE25 -0,969 S PAYE5 -2,680 HS

CR2 1,650 Tl CPE7 0,324 MT PGE7 -1,035 S ABA110 -2,692 HS

CPE6 1,626 Tl HRE16 0,214 MT HRE14 -1,043 S COE26 -2,954 HS

PAYE11 1,565 Tl CPE2 0,191 MT HEE15 -1,162 S HRE7 -3,013 HS

PGE10 1,520 Tl HEE11 -0,069 S HEE4 -1,178 S PAYE3 -3,231 HS

COE30 1,435 Tl COE29 -0,074 S PGE9 -1,211 S PAYE1 -3,321 HS

ZRE1 1,294 Tl HEE1 -0,213 S HEE2 -1,264 S HRE10 -3,652 HS

HRE15 1,143 Tl PGE8 -0,251 S CPE9 -1,299 S HRE8 -3,926 HS

PRN LRN DIRP P R F VRp T <0,001 <0,001 0,583 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001p Pr <0,001 <0,001 1 0,009 <0,001 0,20 0,960

p Pr*T <0,001 0,001 1 0,065 <0,001 0,608 0,948

160

180

200R

Evaluación de la tolerancia de progenies de Q.suber a P. cinnamomi

0,6

0,7

PRN (g)

31

0

20

40

60

80

100

120

140

160

HEE6

SAA359

COA49

SAA360

PRN LRN DIRP P R F VRC 1,021±0,070 111,357±5,404 4,613±0,086 6,492±0,438 165,175±10,153 16,365±0,605 0,750±0,038

I 0,151±0,012 21,137±1,259 6,349±2,063 2,602±0,159 22,152±1,442 6,020±0,296 1,870±0,051

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

SALG297

SBA326

COA49

BAA13

Resultados

FAMILIA IR GT FAMILIA IR GT FAMILIA IR GT FAMILIA IR GT

HEE6 5,244 HT SAA361 0,791 MT COA47 -0,495 S BAA27 -1,151 S

SALG297 5,050 HT COA2 0,781 MT COA6 -0,527 S COA7 -1,204 S

SBA326 3,734 HT COA10 0,735 MT BAA22 -0,579 S BAA29 -1,220 S

BAA6 3,483 HT COA3 0,709 MT BAA4 -0,607 S COA48 -1,273 S

SAA359 3,463 HT SALG82 0,625 MT BAA7 -0,661 S COA45 -1,470 S

IR= PRN+LRN+P+R+F

Evaluación de la tolerancia de progenies de Q.suber a P. cinnamomi

32

SAA359 3,463 HT SALG82 0,625 MT BAA7 -0,661 S COA45 -1,470 S

BAA26 2,621 HT BAA10 0,421 MT SALG307 -0,662 S BAA15 -1,481 S

COA4 2,459 HT BAA3 0,392 MT BAA8 -0,672 S SALG296 -1,489 S

BAA9 2,189 HT COA5 0,315 MT BAA12 -0,726 S SALG299 -1,559 S

SAA355 1,947 Tl BAA24 0,082 MT ZRA5 -0,735 S COA43 -2,063 HS

SAA370 1,837 Tl BAA18 0,002 MT COA1 -0,746 S SAA356 -2,096 HS

BAA1 1,691 Tl SABA330 -0,047 S BAA25 -0,818 S COA46 -2,181 HS

BAA5 1,629 Tl SALG295 -0,113 S COA41 -0,867 S COA44 -2,309 HS

COA9 1,416 Tl BAA17 -0,118 S BAA20 -0,868 S CRA1 -2,384 HS

BAA11 1,304 Tl BAA28 -0,128 S COA42 -0,986 S BAA14 -2,528 HS

BAA16 1,135 Tl COA8 -0,206 S BAA30 -1,034 S SAA360 -2,885 HS

COA40 1,055 Tl BAA23 -0,369 S BAA13 -1,099 S COA49 -3,747 HS

Resultados

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6PRN

HS C

HS I

HT C

HT I

20

40

60

80

100

120

LRN

HS C

HS I

HT C

HT I

Corroboración de las diferencias de tolerancia de progenies seleccionadas de Q.ilex.

33

0

0,1

0

20

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100R

HS C

HS I

HT C

HT I

Inoculación in vitro

Metodología• Selección de 5 genotipos de alcornoque por la tolerancia de la

familia en los ensayos anteriores• Multiplicación in vitro de segmentos nodales• Enraizadas en MSR4 (1 mes) y vermiculita (15 días)• 3 cepas de P. cinnamomi en V8 líquido durante el período de • 3 cepas de P. cinnamomi en V8 líquido durante el período de

máxima producción de zoosporas a dosis de 3.5x10^6 zoosporas/planta

• Evaluación hasta 30 días• Evaluación

– Tallo: nivel de daño, longitud– Raíces: longitud total y necrosada, diámetros, número.– Tiempo en aparecer los síntomas y de supervivencia.

• Comprobación en medio selectivo V8-NARPH

34

35

36

37

• Resultados

• Se han encontrado diferencias en los tiempos de aparición de síntomas y de supervivencia.

• En la producción de raíces nuevas y la longitud • En la producción de raíces nuevas y la longitud y proporción de las necrosis

• Distinto comportamiento entre clones.

38