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SEMINARIO 8SEMINARIO 8
Aguilar, RosarioAguilar, RosarioBastos, LuisBastos, LuisMarcone, María InésMarcone, María InésMartí, María ConsueloMartí, María ConsueloRudi, Juan ManuelRudi, Juan ManuelSoria, MarielSoria, MarielVaca, AliciaVaca, Alicia
UN NUEVO TIPO DE MUTACIÓN UN NUEVO TIPO DE MUTACIÓN CAUSA UN DEFECTO EN EL CAUSA UN DEFECTO EN EL
SPLICING DEL GEN SPLICING DEL GEN ATMATM
Franco Pagani, Emanuelle Buratti, Cristiana Stuani, Franco Pagani, Emanuelle Buratti, Cristiana Stuani, Regina Bendix, Thilo Dörk & Francisco E. BaralleRegina Bendix, Thilo Dörk & Francisco E. Baralle
Nature Genetics – Volumen 30 – Abril 2002 Nature Genetics – Volumen 30 – Abril 2002
ATAXIA-TELANGIECTASIAATAXIA-TELANGIECTASIA
ATAXIA-TELANGIECTASIAATAXIA-TELANGIECTASIA
ATAXIA-TELANGIECTASIAATAXIA-TELANGIECTASIA
Herencia autosómica recesivaHerencia autosómica recesiva 1/40000 – 1/100000 nacidos 1/40000 – 1/100000 nacidos vivosvivos Locus 11q 22 – 23 (1980)Locus 11q 22 – 23 (1980)
Gen Gen ATMATM Proteína Quinasa Serina Proteína Quinasa Serina TreoninaTreonina Traducción de señalesTraducción de señales
Arresto del Ciclo Celular:Arresto del Ciclo Celular:G1, Fase S, G2G1, Fase S, G2
ATMATM
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
GN C A GA / C A G G U A / G A G U C A A / G A C / U
Exo
n 5
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3`
Exó
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80 100 100 6070 60 80 80 90 100 8080100 100 70 80 45
PremRNA
Frecu
encia d
e A
pariciòn
% Las únicas bases casi invariables son las 5´GU 3`AG
20 – 50 Kb
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
Exón CrípticoExón Críptico
20 21DNADNA
RNARNA
cDNAcDNA
Splicing anormal Exón CrípticoSplicing anormal Exón Críptico
Deleción GTAADeleción GTAA
En el intrón 20, En el intrón 20, a 1870 y 570 pb de los exones a 1870 y 570 pb de los exones vecinos (ex 20 y 21)vecinos (ex 20 y 21)
Situada en una secuencia nucleotídica similar a los Situada en una secuencia nucleotídica similar a los sitios consenso de splicingsitios consenso de splicing
SON NECESARIOS 30 – 40 NUCLEOTIDOS, SON NECESARIOS 30 – 40 NUCLEOTIDOS, EN CADA EXTREMO DEL INTRÓN, PARA EN CADA EXTREMO DEL INTRÓN, PARA
QUE EL SPLICING SEA NORMALQUE EL SPLICING SEA NORMAL
HIPÓTESISHIPÓTESIS
La secuencia de nucleótidos La secuencia de nucleótidos (CAGGTAAGT) del intrón 20, que contiene (CAGGTAAGT) del intrón 20, que contiene la deleción GTAA, pese a estar alejada de la deleción GTAA, pese a estar alejada de 5´ ss y de 3´ ss 5´ ss y de 3´ ss no es neutrano es neutra en el splicing en el splicing
del pre-mRNAdel pre-mRNA
Splicing entre exones 20 y 21Splicing entre exones 20 y 21
Evaluar el splicing entre los exones 20 y 21 Evaluar el splicing entre los exones 20 y 21 en el paciente con A-T y en un individuo en el paciente con A-T y en un individuo
normalnormal
OBJETIVOOBJETIVO
Splicing entre exones 20 y 21Splicing entre exones 20 y 21
MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS
ARN (Línea celular linfoide HA174)ARN (Línea celular linfoide HA174)
RT-PCR: random primer (ex 20 dir, ex 21 rev)RT-PCR: random primer (ex 20 dir, ex 21 rev)
Gel de agarosaGel de agarosa
Masculino heterocigotaMasculino heterocigota para para
- Mutación salto en exón 16 ( 2250G - Mutación salto en exón 16 ( 2250G→→A )A ) - Mutación exón críptico entre exones 20 y 21 - Mutación exón críptico entre exones 20 y 21
PACIENTEPACIENTE
Splicing entre exones 20 y 21Splicing entre exones 20 y 21
RESULTADOSRESULTADOS
Calle 1 Inserción de 65 nt (exón críptico)Calle 1 Inserción de 65 nt (exón críptico)
Calle 2 Splicing normalCalle 2 Splicing normal
Splicing entre exones 20 y 21Splicing entre exones 20 y 21
Exón CrípticoExón Críptico
RNA m.
16 dir 22 rev
RT PCR
CDNA
Splicing alelo-específicoSplicing alelo-específico
Evaluar el splicing alelo-específico entre los Evaluar el splicing alelo-específico entre los exones 20 y 21exones 20 y 21
OBJETIVOOBJETIVO
Splicing alelo-específicoSplicing alelo-específico
MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS
Gel de agarosaGel de agarosa
RT-PCR: random primer (ex 16 dir, ex 22 rev)RT-PCR: random primer (ex 16 dir, ex 22 rev)
El alelo 2250G→A no podrá amplificarse El alelo 2250G→A no podrá amplificarse (salto del exón 16) (salto del exón 16)
ARN ARN
Splicing alelo-específicoSplicing alelo-específico
RESULTADOSRESULTADOS
Calle 1 Exón crípticoCalle 1 Exón críptico
Calle 2 Splicing normalCalle 2 Splicing normal
El splicing defectuoso del exón 20 El splicing defectuoso del exón 20 no afecta el splicing regulado por no afecta el splicing regulado por
elementos canónicoselementos canónicos
Observar que el splicing defectuoso del exón Observar que el splicing defectuoso del exón que posee la deleción no produce un que posee la deleción no produce un
transcripto normaltranscripto normal
OBJETIVOOBJETIVO
El splicing defectuoso del exón 20 no afecta El splicing defectuoso del exón 20 no afecta el splicing regulado por elementos canónicosel splicing regulado por elementos canónicos
MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS
Los productos amplificados fueron separados en geles Los productos amplificados fueron separados en geles de agarosade agarosa
Se amplificaron por RT-PCR, usando primers específicos, Se amplificaron por RT-PCR, usando primers específicos, los exones 19 al 22los exones 19 al 22
PUROMICINA: es un antibiótico que inhibe la síntesis PUROMICINA: es un antibiótico que inhibe la síntesis proteica, pues su estructura es similar a la terminación proteica, pues su estructura es similar a la terminación aminoacil de un aminoacil ARNt. De esta manera libera las aminoacil de un aminoacil ARNt. De esta manera libera las cadenas de pre-RNA antes de que se complete su síntesiscadenas de pre-RNA antes de que se complete su síntesis
RESULTADOSRESULTADOS
Calle 1 Tratamiento sin puromicinaCalle 1 Tratamiento sin puromicina
Calle 2 Tratamiento con puromicinaCalle 2 Tratamiento con puromicina
El splicing defectuoso del exón 20 no afecta El splicing defectuoso del exón 20 no afecta el splicing regulado por elementos canónicosel splicing regulado por elementos canónicos
CONCLUSIÓNCONCLUSIÓN
El tratamiento con puromicina incrementa la El tratamiento con puromicina incrementa la cantidad relativa del producto que contienecantidad relativa del producto que contiene
la inserción de 65 nt, a partir de la línea celular la inserción de 65 nt, a partir de la línea celular que se obtiene del individuo afectado. que se obtiene del individuo afectado.
De lo contrario, se obtiene poco producto del De lo contrario, se obtiene poco producto del splicing defectuoso, ya que, la inserción posee un splicing defectuoso, ya que, la inserción posee un codon stop que trunca la transcripción antes de codon stop que trunca la transcripción antes de
lo normallo normal
SISTEMA MINIGENESISTEMA MINIGENE
El sistema minigene es una importante El sistema minigene es una importante herramienta para la identificación y análisis in herramienta para la identificación y análisis in
vivo de reguladores como elementos cis- y vivo de reguladores como elementos cis- y factores trans-, que establecen un splicing factores trans-, que establecen un splicing eficiente y regulan el splicing alternativoeficiente y regulan el splicing alternativo
SISTEMA MINIGENESISTEMA MINIGENE
Los usos más comunes de los minigenes son:Los usos más comunes de los minigenes son:
Determinar la variante alélica que afecta la Determinar la variante alélica que afecta la eficiencia del splicing, entre otros usoseficiencia del splicing, entre otros usos
Identificar elementos exónicos e intrónicos que Identificar elementos exónicos e intrónicos que favorecen o reprimen el splicingfavorecen o reprimen el splicing
Determinar el rol de los sitios de splicing en Determinar el rol de los sitios de splicing en establecer el nivel basal de reconociemiento del establecer el nivel basal de reconociemiento del exónexón
SISTEMA MINIGENESISTEMA MINIGENE
La expresión de preRNAs mediante el Sistema La expresión de preRNAs mediante el Sistema Minigene, por transfección transciente, provee un Minigene, por transfección transciente, provee un rápido ensayo para conocer la pérdida de función rápido ensayo para conocer la pérdida de función
y/o el análisis de la pérdida o ganancia de y/o el análisis de la pérdida o ganancia de elementos cis- y/o factores trans- que afectan la elementos cis- y/o factores trans- que afectan la
regulación de la transcripciónregulación de la transcripción
SISTEMA MINIGENESISTEMA MINIGENE
SISTEMA MINIGENESISTEMA MINIGENE
SISTEMA MINIGENESISTEMA MINIGENE
Estudio de la secuencia de Estudio de la secuencia de ATMATM afectada por la deleciónafectada por la deleción
ISPEISPEElemento de procesamiento de splicing del intrónElemento de procesamiento de splicing del intrón
Secuencia del ISPE de ATMSecuencia del ISPE de ATM
Sitios de splice 3’ y 5’ Sitios de splice 3’ y 5’ respectivamenterespectivamente
HOMOLOGASHOMOLOGAS
Estudio de la secuencia de Estudio de la secuencia de ATMATM afectada por la deleciónafectada por la deleción
Complementariedad de bases entre ISPE y snRNA U1Complementariedad de bases entre ISPE y snRNA U1
12 bp fuertemente complementarias
Unión no clásica del snRNA U1
Estudio de la secuencia de Estudio de la secuencia de ATMATM afectada por la deleción afectada por la deleción
HIPÓTESISHIPÓTESIS
La unión del snRNA U1 al ISPE es crucial en el proceso de La unión del snRNA U1 al ISPE es crucial en el proceso de modulación del pre RNAm del intrón 20modulación del pre RNAm del intrón 20
Mutaciones puntuales en ISPE
Sistema de minigen de ATM
Mutagénesis sitio dirigida
RT- PCR
Gel de agarosa
Estudio de la secuencia de Estudio de la secuencia de ATMATM afectada por la deleción afectada por la deleción
CONFIRMACIÓN DE LA HIPÓTESISCONFIRMACIÓN DE LA HIPÓTESIS
Mutaciones puntuales Mutaciones puntuales
en el ISPEen el ISPE
REMOCIÓN COMPLETA DEL INTRÓN
Cierta inclusión del INTRÓN
INCLUSIÓN COMPLETA DEL
INTRÓN5G y 6G5G y 6Gexcepciónexcepción
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Secuencia intrónica (ISPE) distante de los sitios Secuencia intrónica (ISPE) distante de los sitios clásicos de spliceclásicos de splice
Mutaciones puntuales en la secuencia intrónica Mutaciones puntuales en la secuencia intrónica (ISPE), alteran la unión clásica de snRNA U1, (ISPE), alteran la unión clásica de snRNA U1, actuando como el ISPE con la deleción y por lo tanto actuando como el ISPE con la deleción y por lo tanto generando la inclusión del intróngenerando la inclusión del intrón
Activación del exon críptico producida por la de Activación del exon críptico producida por la de una interacción no clásica del snRNA U1 con el ISPEuna interacción no clásica del snRNA U1 con el ISPE
¿La deleción de 4pb o mutación CT ¿La deleción de 4pb o mutación CT rompe la interación entre U1 snRNP rompe la interación entre U1 snRNP
y ATM ISPE?y ATM ISPE?
EMSAEMSA(Electroforetic Movility Shift Assay)(Electroforetic Movility Shift Assay)
Puede determinar si una proteína o mezclas Puede determinar si una proteína o mezclas de proteínas, son capaces de unirse a un de proteínas, son capaces de unirse a un determinado DNA o RNAdeterminado DNA o RNA
Gel Shift Assay, Band Shift Assay o Gel Shift Assay, Band Shift Assay o Gel Retardation AssayGel Retardation Assay
Interacción proteína-DNA o proteína-RNAInteracción proteína-DNA o proteína-RNA
Separación electroforética de una mezcla Separación electroforética de una mezcla proteína-DNA en geles de poliacrilamida o proteína-DNA en geles de poliacrilamida o agarosa, por un período corto de tiempoagarosa, por un período corto de tiempo
La velocidad de la corrida está dada por el La velocidad de la corrida está dada por el tamaño y carga, y en menor medida por la formatamaño y carga, y en menor medida por la forma
Visualización: DNA o RNA marcado con Visualización: DNA o RNA marcado con fluorescentes o radioactivosfluorescentes o radioactivos
EMSAEMSA
EMSAEMSA
Oligonucleótidos de RNA sc de Oligonucleótidos de RNA sc de ATM-ISPE normal, e ISPE con deleción ATM-ISPE normal, e ISPE con deleción (ATM-(ATM-ΔΔ) o con sustitución CT ) o con sustitución CT (ATM-CT) (ATM-CT) con 5’ terminal marcadocon 5’ terminal marcado
Extracto nuclear de HeLAExtracto nuclear de HeLA
CONCLUSIÓN:CONCLUSIÓN:
Sólo el ATM ISPE normal induce Sólo el ATM ISPE normal induce la formación del complejo la formación del complejo Proteína-RNA específicoProteína-RNA específico
EMSAEMSAAnálisis de competiciónAnálisis de competición
Oligonucleótidos ATM-ISPE, ATM-Oligonucleótidos ATM-ISPE, ATM-ΔΔ o ATM-CT, o ATM-CT, no marcados, en excesono marcados, en exceso
ATM ISPE marcadoATM ISPE marcado
Incubación: 25 minutos a T ambienteIncubación: 25 minutos a T ambiente
CONCLUSIÓN:CONCLUSIÓN:
Las variantes ATM-Las variantes ATM-ΔΔ o ATM-CT o ATM-CT no pueden desplazar al ATM no pueden desplazar al ATM ISPE del complejo proteína-RNAISPE del complejo proteína-RNA
¿Está presente U1 snRNP en el ¿Está presente U1 snRNP en el complejo Proteína-RNA específico?complejo Proteína-RNA específico?
Ensayo de clivaje con RNasa HEnsayo de clivaje con RNasa H
Incubación del extracto nuclear de Incubación del extracto nuclear de HeLa, con Oligonucleótido HeLa, con Oligonucleótido complementario U1 AS (antisense) y complementario U1 AS (antisense) y RNasa HRNasa H
T = 30ºC durante 15 y 30 minutosT = 30ºC durante 15 y 30 minutos
Control negativo: Oligonucleótido Control negativo: Oligonucleótido CAS no relacionadoCAS no relacionado
Análisis de super-movilidadAnálisis de super-movilidad
Se agrega anticuerpo policlonal Se agrega anticuerpo policlonal de conejo anti U1 Ade conejo anti U1 A
Control: anticuerpo policlonal de Control: anticuerpo policlonal de conejo específicoconejo específico
CONCLUSIÓN:CONCLUSIÓN:
snRNP U1 participa en el snRNP U1 participa en el complejo Proteína-RNA formado complejo Proteína-RNA formado por ATM ISPEpor ATM ISPE
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Sólo el ATM ISPE normal induce la formación Sólo el ATM ISPE normal induce la formación del complejo Proteína-RNA específicodel complejo Proteína-RNA específico
Las Variantes ATM-Las Variantes ATM-ΔΔ o ATM-CT no pueden o ATM-CT no pueden desplazar al ATM ISPE del complejo proteína-RNAdesplazar al ATM ISPE del complejo proteína-RNA
snRNP U1 participa en el complejo proteína-RNA snRNP U1 participa en el complejo proteína-RNA formado por ATM ISPEformado por ATM ISPE
Interacción funcional entre Interacción funcional entre U1 snRNA e ISPEU1 snRNA e ISPE
Determinar si la complementariedad entre Determinar si la complementariedad entre mutantes de U1 snRNA, denominadas mutantes de U1 snRNA, denominadas ∆-U1 ∆-U1 y CT-U1, y CT-U1, y las variantes complementarias y las variantes complementarias ATM-ATM-∆ y ATM-CT induce el procesamiento ∆ y ATM-CT induce el procesamiento
normal del intrón in vivonormal del intrón in vivo
OBJETIVOOBJETIVO
Interacción funcional entre Interacción funcional entre U1 snRNA e ISPEU1 snRNA e ISPE
Interacción funcional entre U1 snRNA e ISPEInteracción funcional entre U1 snRNA e ISPE
MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS
Amplificación de DNA genómico y preparación de plásmidos pATM-WT, Amplificación de DNA genómico y preparación de plásmidos pATM-WT, pATM-∆ y pATM-CT con minigenespATM-∆ y pATM-CT con minigenes
Creación de las variantes ∆-U1 y CT-U1 empleando el clon pG3U1 Creación de las variantes ∆-U1 y CT-U1 empleando el clon pG3U1 (clon parental de U1 snRNA)(clon parental de U1 snRNA)
Co-transfección de células Hep3B con las variantes de los Co-transfección de células Hep3B con las variantes de los minigenes de ATM y conminigenes de ATM y con las mutantes del U1 snRNA (cantidades las mutantes del U1 snRNA (cantidades diferentes)diferentes)
Preparación del RNA total mediante extracción con Preparación del RNA total mediante extracción con ácido guanidino-fenol y transcripción por RT-PCRácido guanidino-fenol y transcripción por RT-PCR
Visualización mediante geles de agarosaVisualización mediante geles de agarosa
RESULTADOSRESULTADOS
+, 0,5 +, 0,5 µg; µg; ++, 1,5 µg, 1,5 µg
La interacción entre pATM-La interacción entre pATM-∆ y pATM-CT con sus ∆ y pATM-CT con sus respectivas variantes complementarias del U1 snRNA respectivas variantes complementarias del U1 snRNA
produce la omisión del exón crípticoproduce la omisión del exón críptico
Interacción funcional entre U1 snRNA e ISPEInteracción funcional entre U1 snRNA e ISPE
La restauración de la complementariedad La restauración de la complementariedad entre U1 snRNA e ISPE genera un splicing entre U1 snRNA e ISPE genera un splicing
normal, es decir, permite la remoción normal, es decir, permite la remoción eficiente de los introneseficiente de los intrones
CONCLUSIÓNCONCLUSIÓN
Conversión de exones en intronesConversión de exones en intrones
OBJETIVOOBJETIVO
Analizar el efecto del ISPE en un contexto diferente Analizar el efecto del ISPE en un contexto diferente
HIPÓTESISHIPÓTESIS
Si la interacción de U1 snRNP con el ISPE Si la interacción de U1 snRNP con el ISPE provoca la correcta remoción de intrones, provoca la correcta remoción de intrones,
entonces su localización en un exón entonces su localización en un exón convertiría secuencias exónicas en convertiría secuencias exónicas en
secuencias intrónicassecuencias intrónicas
Conversión de exones en intronesConversión de exones en intrones
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 1ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 1
Introducción de la secuencia core del ISPE Introducción de la secuencia core del ISPE en diferentes posiciones del exón 9 del gen en diferentes posiciones del exón 9 del gen CFTR, utilizando una versión modificada del CFTR, utilizando una versión modificada del
minigen minigen globina-fibronectina EDB globina-fibronectina EDB
Conversión de exones en intronesConversión de exones en intrones
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 1ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 1
Conversión de exones en intronesConversión de exones en intrones
ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOSANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS
RT-PCRRT-PCR
mRNAmRNA
RTRT
cDNAcDNA
AmplificaciónAmplificación
Conversión de exones en intronesConversión de exones en intrones
OBSERVACIONESOBSERVACIONES
En células transfectadas con En células transfectadas con pCFpCF, el análisis por RT-PCR , el análisis por RT-PCR muestra un predominio de muestra un predominio de inclusióninclusión del exón 9 del exón 9
En células transfectadas con En células transfectadas con pCF-ISPE 5´pCF-ISPE 5´ y en las y en las transfectadas con transfectadas con pCF-ISPE 3´pCF-ISPE 3´ se observa un predominio de se observa un predominio de exclusiónexclusión del exón 9 del exón 9
En células transfectadas con En células transfectadas con pCF-ATM pCF-ATM y en las y en las transfectadas con transfectadas con pCF-ATM CTpCF-ATM CT, se observa un aumento , se observa un aumento importante de importante de exclusiónexclusión del exón 9 con respecto al pCF del exón 9 con respecto al pCF
Conversión de exones en intronesConversión de exones en intrones
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 1ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 1
Co-transfección de las variantes ISPEs con Co-transfección de las variantes ISPEs con su respectivo U1 snRNP complementario su respectivo U1 snRNP complementario
utilizando la línea celular Hep 3Butilizando la línea celular Hep 3B
Conversión de exones en intronesConversión de exones en intrones
ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOSANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS
RT-PCRRT-PCR
Conversión de exones en intronesConversión de exones en intrones
OBSERVACIONESOBSERVACIONES
La co-transfección de las dos variantes ISPE La co-transfección de las dos variantes ISPE con sus respectivas U1 snRNP complementarias con sus respectivas U1 snRNP complementarias muestran una inhibición específica de la inclusión muestran una inhibición específica de la inclusión del exón 9del exón 9
La presencia del ISPE en un exón lo convierte La presencia del ISPE en un exón lo convierte en un intrónen un intrón
La interacción entre ISPE y U1 sn RNP también La interacción entre ISPE y U1 sn RNP también convierte secuencia exónicas en intrónicas en un convierte secuencia exónicas en intrónicas en un contexto heterólogocontexto heterólogo
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
CONCLUSIONES FINALESCONCLUSIONES FINALES
Se identificó un nuevo mecanismo que provoca A-T y Se identificó un nuevo mecanismo que provoca A-T y que involucra un elemento procesador del splicing que involucra un elemento procesador del splicing intrónico (ISPE) en ATMintrónico (ISPE) en ATM
La deleción GTAA dentro del ISPE interrumpe la La deleción GTAA dentro del ISPE interrumpe la interacción no canónica U1 snRNP y activa un exón interacción no canónica U1 snRNP y activa un exón aberrante, manteniendo los sitios de splicing consenso aberrante, manteniendo los sitios de splicing consenso 5´ y 3´ potenciales adyacentes5´ y 3´ potenciales adyacentes
La deleción ocurre 12 pb río abajo y 53 pb río arriba La deleción ocurre 12 pb río abajo y 53 pb río arriba respecto de los sitios de splicing del exón críptico respecto de los sitios de splicing del exón críptico (esas secuencias ya están presentes en el intrón wild-(esas secuencias ya están presentes en el intrón wild-type)type)
PERSPECTIVASPERSPECTIVAS
Se sabe que Se sabe que U1 snRNPU1 snRNP también está implicada también está implicada en otros eventos del procesamiento de pre-mRNA:en otros eventos del procesamiento de pre-mRNA:
Regulación de la formación del sitio 3´ terminalRegulación de la formación del sitio 3´ terminal
Refuerzo de los bordes intrónicos por unión a tripletes GRefuerzo de los bordes intrónicos por unión a tripletes G
Inhibición del splicing por unión a moduladores Inhibición del splicing por unión a moduladores negativos del splicing de intrones en ROUS sarcoma virusnegativos del splicing de intrones en ROUS sarcoma virus
Splicing tejido específico de los transcriptos del Splicing tejido específico de los transcriptos del elemento P de Drosophilaelemento P de Drosophila
PERSPECTIVASPERSPECTIVAS
El complejo que forma El complejo que forma U1 snRNPU1 snRNP con la secuencia con la secuencia ISPE debe interferir con los posibles complejos en ISPE debe interferir con los posibles complejos en sitios crípticos de splicing adyacentessitios crípticos de splicing adyacentes
En transcriptos de elementos P de Drosophila, el En transcriptos de elementos P de Drosophila, el reclutamiento de reclutamiento de U1 snRNPU1 snRNP a un sitio que nunca es a un sitio que nunca es utilizado para splicing resulta en una concomitante utilizado para splicing resulta en una concomitante reducción del complejo U1 snRNP/ISPE en el sitio reducción del complejo U1 snRNP/ISPE en el sitio apropiado de slicingapropiado de slicing
PERSPECTIVASPERSPECTIVAS
Se requiere una distancia crítica entre los sitios 3´ y 5´ de Se requiere una distancia crítica entre los sitios 3´ y 5´ de splicing para definir un exónsplicing para definir un exón
Elementos que contienen sitios de splicing 3´ y 5´ Elementos que contienen sitios de splicing 3´ y 5´ adyacentes (similares al ISPE) pueden representar una señal adyacentes (similares al ISPE) pueden representar una señal de re-splicing que regula y asegura el correcto procesamiento de re-splicing que regula y asegura el correcto procesamiento de intrones largos (Drosophila Ubx) ó comportarse como un de intrones largos (Drosophila Ubx) ó comportarse como un sitio (aceptor y donor) de splicing alternativositio (aceptor y donor) de splicing alternativo
En este contexto, los sitios de pseudo-splicing En este contexto, los sitios de pseudo-splicing frecuentemente encontrados en intrones deben ser frecuentemente encontrados en intrones deben ser considerados no solo como “falsos exones” sino también considerados no solo como “falsos exones” sino también como elementos importantes para el eficiente procesamiento como elementos importantes para el eficiente procesamiento intrónicointrónico
UN NUEVO TIPO DE MUTACIÓN UN NUEVO TIPO DE MUTACIÓN CAUSA UN DEFECTO EN EL CAUSA UN DEFECTO EN EL
SPLICING DEL GEN SPLICING DEL GEN ATMATM
MUCHAS GRACIAS!MUCHAS GRACIAS!