SEPARACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Metodología del DNA Recombinante

CROMATOGRAFÍAMétodo fisicoquímico, que tienen como finalidad la separación de mezclas basándose en la diferente capacidad de interacción de cada componente con otra sustancia.

Elementos de la Cromatografía Fase Móvil

Eluyente.Contiene el analito y migra a través de la fase estacionaria.

Fase EstacionariaAdsorbente.Permanece inmóvil.

Separación del analito Cromatografía de partición

Distribución de los componentes entre las fases móvil y estacionaria

Cromatografía de adsorbciónAdsorción por la fase estacionaria

Cromatografía de intercambio iónicoEfectos de intercambio iónico

Cromatografía de afinidadUnión selectiva a la fase estacionaria

High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Utilizada para la separación de oligonucleótidos.Es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatografíca.

Cromatografía de Adsorbción Los ác. nucleicos se unen selectivamente a

sílice o vidrio, en presencia de sales caotrópicas.

Se utiliza hidroxiapatita, es una forma de fosafato de calcio Ca5(PO4)3(OH)2 .

El DNA de doble cadena tiene especial afinidad por el; el DNA puede aislarse mediante el pasaje del lisado de células a través de la columna.

Se recuperan los ác. nucleicos con una solución hiposalina.

Cromatografía de AfinidadEs una adaptación de la cromatografía de adsorbción.Un ligando inmovilizado reconoce y se une al analito de interés, se realizan lavados que remueven los componentes no unidos y un elución final que permita separa el analito.

Ejemplo: Aislamiento de RNAmSe utiliza una

columna de celulosa que presenta cadenas de oligo(dT).Se carga el ARN con un tampón EDTA-SDS con NaC.Los RNAm retenidos pueden ser eluidos con un tampón Tris-EDTA.

Cromatografía de Intercambio IónicoUn ácido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unirá a un intercambiador iónico con grupos cargados positivamente.Se eluirán primero de la columna las moléculas cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al añadir el tampón de elución eluirán las moléculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta.

Se utilizan dos tipos de intercambiadores ióicos:

Metilaminoetanol Dietilaminoetil

Permite la concentración y purificación de DNA de calidad.

Rápida y eficaz.

Cromatografía de Exclusión (Filtración en gel) Se basa en el tamaño de las partículas.

Moléculas grandes Migran más rápidoMoléculas pequeñas Se retienen en los poros.

Permite la separación de ácidos nucleicos a partir de substancias de bajo peso molecular.

Emplea columnas de sílice o de polímeros orgánicos.

Purificación en gel de agarosa de un ác. nucleico de determinado tamaño.

Utilizado en la clonación de vectores.

ELECTROFORESISEs una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica.

Proceso general de Electroforesis1. Preparar un gel de agarosa o

acrilamida a la concentración requerida.

2. Mezclar las muestras a analizar con un buffer de carga adecuado.

3. Cargar las muestras en el gel.4. Realizar la corrida electroforética al

voltaje pertinente.5. Visualizar.

Elementos necesarios para la Electroforesis Cámara de electroforesis

Permite la generación de un campo eléctrico alrededor de un gel en el que se depositan las muestras.Cuenta con dos polos que se conectan a una fuente de energía.

GelDa soporte para evitar perturbaciones mecánicas durante la separación.

Electroforesis en Gel de Agarosa

100pb a 25 kbNo tóxicoPermite analizar pesos moleculares

variadosMenor poder de resolución de la

poliacrilaminda

Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (PAGE)Polímero sintéticoPolimerización de acrilamida y

bisacrilamidaTóxicoPoros de menor tamaño que la agarosaPuede ser utilizado para

secuenciación.

La poliacrilamida se forma por copolimerización de dos compuestos, la acrilamida y la bis-acrilamida (N,N'-metilén-bis-acrilamida), en una reacción iniciada por la tetrametiletiléndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio. El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al monómero de acrilamida para que polimerice.

A 150 ml de la solución de poliacrilamida al 5% se le agregan 1 ml de solución de persulfato de amonio al 10% y 100 µl de TEMED.

1. Tanque externo2. Conectores tipo banana3. Soporte para geles4. Cuña5. Tapa6. Cables fijos

Buffer de corrimientoProporciona el medio para la transmisión de la corriente eléctrica y mantiene el pH sin variaciones mientras se realiza el corrimiento. En el caso de los ácidos nucleicos, pueden emplearse:TBE TAE

Tris base, ácido bórico y EDTA, y se maneja a

un pH de 7.2.

Tris base, ácido acético y EDTA,

ajustadoa pH 8.5.

Buffer de carga Tiene como fin brindar peso, densidad y color

a la muestra, lo que facilita su depósito en el pocillo y evita su salida del gel.Relación 1:3 respecto a la muestra

Tris, azul de bromofenol, azul de xileno y glicerol

Electroforesis en ácidos nucleicos Las movilidad dependerá únicamente de la longitud

(pb). Se realiza con voltajes de 25 y 100V. Se monitorea en avance por la visualización de los

colorantes. molecular de las moléculas de DNA que se va a

separar. Para el caso de productos de PCR (entre 100 pb y 1.5

kb) se recomienda usar voltajes comprendidos entre 75 y 100V.

Para muestras de DNA genómico y plasmídico (> 2 kb) se recomienda aplicar valores de entre 25 y 75 V.

Visualización de las muestras Utilización de bromuro de etidio Incorporar antes de

solidificar(0.5mg/ml)Luego del corrimientos, incubando el

gel en una solución que contenga 0.5mg/ml

Emite fluorescencia naranja al exponerse a UV con longitud de absorción de 254nm y longitud de emisión de 366nm.

Electroforesis en Gel de Campo Pulsante (PFGE)

Permite resolver moléculas de DNA de hasta 10 millones de pb.La polaridad de lo s electrodos se revierte periódicamente , y cada pulso dura ente 0.1 y 1000 s

Colorantes Azul de bromofenol

Por su menor tamaño, se mueve más rápido que las proteínas o que la mayoría de moléculas de DNA (siempre que éstas sean superiores a 300 pb), es decir, marca el "frente de avance".

Bromuro de etidioSe trata de un compuesto intercalante, es decir, que tiene afinidad para unirse al DNA, pues se introduce entre sus bases apiladas. interacciona también con DNA monocatenario.

Su utilidad deriva asimismo de su fluorescencia. Se excita con luz ultravioleta de onda corta, 254 nm, y emite su fluorescencia como luz visible, de color rosado-anaranjado.

GelRedSe excitan con luz ultravioleta de onda corta, 254 nm, y emiten luz visible, de color rojo (de ahí el nombre del reactivo).Se puede bañar el gel tras la electroforesis en una disolución de GelRed™, o bien incorporar éste a la disolución de agarosa con la que se prepara el gel.

Transluminador Ultravioleta

Bibliografía Voet;Voet.(2011).Biochemistry.4th Edition.USA,

JOHN WILEY & SON,INC. Salazar; Sandoval; Armendáriz (2016)Biología

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Pérez, D. M. (2000). Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos,. Obtenido de bvs.sld.cu/revistas/uni/vol1_2_00/uni07200.pdf

Wink. (2009)An Introduction to Molecular Biotechnology. Fundamentals, Methods and Aplications.2 Edition.Willey-Blackwell