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I
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA Y CITOTÓXICA DE BIOCONJUGADOS DE PÉPTIDOS
Ib-M CON NANOPARTÍCULAS DE ÓXIDO DE HIERRO CONTRA Escherichia coli
O157:H7 Y CÉLULAS VERO
SERGIO ALFONSO PRADA PRADA
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
MAESTRÍA EN INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS
BUCARAMANGA
2019
II
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA Y CITOTÓXICA DE BIOCONJUGADOS DE PÉPTIDOS
Ib-M CON NANOPARTÍCULAS DE ÓXIDO DE HIERRO CONTRA Escherichia coli
O157:H7 Y CÉLULAS VERO
SERGIO ALFONSO PRADA PRADA
Código: 17861012
TRABAJO DE GRADO PRESENTADO COMO PARTE DE LOS REQUISITOS PARA LA
OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE MAGISTER EN INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES
INFECCIOSAS
TUTORA: MSC. INDIRA POLA HERNÁNDEZ PEÑARANDA
CO-TUTORA: MSC. ANA ELVIRA FARFÁN-GARCÍA
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
MAESTRÍA EN INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS
BUCARAMANGA
2019
III
IV
“Hay una fuerza motriz más poderosa que el vapor, la electricidad y la energía atómica:
La Voluntad”
Albert Einstein
V
DEDICATORIA
Dedico este trabajo a mis padres por siempre darme su apoyo incondicional…
A mis tías por siempre contar con ellas en todos mis proyectos…
A mis amigos por saberme aconsejar y apoyar en todas las situaciones por las que paso…
A todos aquellos que entregan su tiempo en busca de un mejor futuro…
Y a una peke por ahí que nunca me ha dejado solo sin importar las dificultades por las que
pasamos.
VI
AGRADECIMENTOS
A mi tutora, la M. Sc Indira Hernández por enseñarme a ser mejor tanto en lo profesional como
en lo personal.
A la doctora Liliana Torcoroma García, por la dedicación que tiene a su programa y por lo tanto
a los estudiantes que lo cursamos.
A mis docentes por todo el conocimiento que han compartido conmigo.
A mis compañeros de la III Cohorte por sus, consejos, ayuda y acompañamiento durante la
realización de la maestría.
A todos los miembros de los grupos CIBAS y CliniUDES por su apoyo en la realización de este
proyecto.
Y a COLCIENCIAS por la aprobación y financiación de este proyecto.
VII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estructura general y Alineación de la Secuencia de los Péptidos Ib-AMP. .................. 15
Figura 2. Desarrollo de la metodología......................................................................................... 20
Figura 3. Cinética de Crecimiento de E. coli O157:H7 (43888) en presencia de péptidos Ib-M.
Fase de latencia. ............................................................................................................................ 34
Figura 4. Cinética de Crecimiento de E. coli O157:H7 (43888) en presencia de péptidos Ib-M1 y
2. Fase Exponencial. ..................................................................................................................... 36
Figura 5. Cinética de Letalidad de Ib-M1 contra E. coli O157:H7 (43888) ................................. 37
Figura 6. Cinética de Crecimiento de E. coli O157:H7 (43888) en presencia del bioconjugado
IbM1/NpOH@Qui. Fase de latencia ............................................................................................. 38 Figura 7. Cinética de Letalidad de IbM1/NpOH@Qui contra E. coli O157:H7 (43888) ............. 39
Figura 8. Citotoxicidad del bioconjugado IbM1/NpOH@Qui y sus componentes. ..................... 41
VIII
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Factores de virulencia especializados asociados a E. coli ................................................ 2
Tabla 2. Factores de virulencia de ExPEC...................................................................................... 9
Tabla 3. Recopilación de trabajos sobre resistencia de E. coli ..................................................... 12
Tabla 4. Actividad antibacteriana del péptido nativo y sus análogos contra E. coli K-12 en Medio
MH. ...................................................................................................................................... 16
Tabla 5. Actividad antimicrobiana de péptidos Ib-M ................................................................... 32
Tabla 6. Citotoxicidad en células VERO e IS de péptidos Ib-M. ................................................. 40
IX
LISTA DE ABREVIATURAS
AMH: Agar Müller-Hinton
AS: Agar Sangre
AC: Aislado Clínico
CC50: Concentración Citotóxica 50
CI50: Concentración Inhibitoria 50
CMB: Concentración Mínima Bactericida
CMH: Caldo Müller-Hinton
CMI: Concentración Mínima Inhibitoria
DMSO: Dimetilsulfóxido E. coli: Escherichia coli
ECEA: Escherichia coli Enteroagregativa
ECEH: Escherichia coli Enterohemorrágica
ECEI: Escherichia coli Enteroinvasiva
ECEP: Escherichia coli Enteropatógena
ECET: Escherichia coli Enterotoxígenica
Ib-AMP#: De Impatiens balsamina Antimicrobial Peptides, siglas en ingles correspondientes a
péptidos antimicrobianos de Impatiens balsamina.
Ib-M#: Análogo del Péptido Ib-AMP4
IbM1/NpOH@Qui: Bioconjugado de Péptidos Ib-M1 inmovilizados sobre Nanopartículas de
Óxido de Hierro recubiertas con quitosano
IS: Índice de Selectividad
LB: Caldo Luria Bertani
LEE: Siglas en ingles de Locus de Borramiento de Eritrocitos
MTT: Bromuro de 3-(4,5-dimetiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol
NpOH: Nanopartículas de Óxido de Hierro NpOH@Qui: Nanopartículas de Óxido de Hierro recubiertas con Quitosano
RPMI: Medio RPMI
SBFi: Suero Bovino Fetal inactivado
SHU: Síndrome Hemolítico Urémico
SLN 0,9%: Solución Salina Estéril 0,9%
UFC: Unidades Formadoras de Colonias
UFC/mL: Unidades Formadoras de Colonias por mililitro
µM IbM (µg/mL NpOH): Concentración en Micromolar de péptido Ib-M inmovilizado sobre
Microgramos por mililitro de NpOH del Bioconjugado
X
TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................... 1
1. MARCO TEÓRICO.................................................................................................................... 1
1.1 Escherichia coli .................................................................................................................... 1
1.1.1 Patotipos ......................................................................................................................... 2
1.1.1.1 Infecciones intestinales ......................................................................................... 3
1.1.1.2 E. coli Enterotoxigenica (ECET) .......................................................................... 3
1.1.1.3 E. coli Enteropatogena (ECEP) ............................................................................ 3
1.1.1.4 E. coli Enteroagregativa (ECEA) ......................................................................... 4
1.1.1.5 E. coli Enteroinvasiva (ECEI) .............................................................................. 5 1.1.1.6 E. coli Enterohemorrágica o productora de SHIGA/Verotoxinas (ECEH o
ECST/ECVT) .................................................................................................................... 6
1.1.1.7 SEROTIPO O157:H7 ........................................................................................... 7
1.1.1.8 Infecciones Extra Intestinales (ExPEC) ................................................................ 8
1.1.2 Tratamiento antimicrobiano contra E. coli O157:H7 .................................................. 10
1.1.3 Resistencia a antibióticos en E. coli ............................................................................. 11
1.2 Péptidos antimicrobianos .................................................................................................... 12
1.2.1 Mecanismo de Acción.................................................................................................. 13
1.2.2 Familia Ib-AMP ........................................................................................................... 14
1.2.2.1 Análogos de Ib-AMP4 (Familia Ib-M) ............................................................... 15
1.3 Nanopartículas de Óxido de Hierro Funcionalizadas con Quitosano ................................. 16
2. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 19
2.1 OBJETIVO GENERAL ...................................................................................................... 19
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.............................................................................................. 19
3. METODOLOGÍA ..................................................................................................................... 20
3.1. MATERIALES .................................................................................................................. 21 3.2 Compuestos ......................................................................................................................... 21
3.2.1 Familia de Péptidos Ib-M............................................................................................. 21
3.2.2 Bioconjugado IbM1/NpOH@Qui ................................................................................ 21
3.2.3 Antibióticos de referencia ............................................................................................ 22
3.3 Material Biológico .............................................................................................................. 22
3.3.1 Cepas de Escherichia coli O157:H7 ............................................................................ 22
3.3.2 Células Vero................................................................................................................. 23
3.4 Medios................................................................................................................................. 23
3.5 Equipos ............................................................................................................................... 23
3.6 Reactivos ............................................................................................................................. 23
4. MÉTODOS ............................................................................................................................... 24
4.1 Determinación de la Actividad Antimicrobiana ................................................................. 24
4.1.1 Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) ................................................................... 24
4.1.2 Concentración Mínima Bactericida (CMB) ................................................................. 25
4.1.3 Cinética de Crecimiento de E. coli O157:H7............................................................... 26
4.1.3.1 Fase de Latencia ................................................................................................. 26
4.1.3.2 Fase Exponencial ................................................................................................ 27 4.1.4 Cinética de Letalidad de E. coli O157:H7 ................................................................... 27
4.2 Citotoxicidad en Células VERO ......................................................................................... 28
XI
4.3 Análisis Estadístico ............................................................................................................. 29
4.3.1 Actividad Antimicrobiana ............................................................................................ 29
4.3.2 Citotoxicidad en Células VERO .................................................................................. 29
5. RESULTADOS......................................................................................................................... 31
5.1 Actividad de Péptidos Ib-M contra E. coli O157:H7 .......................................................... 31
5.1.1 Concentración Mínima Inhibitoria ................................................................................... 31
5.1.2 Concentración Mínima Bactericida ............................................................................. 32
5.1.3 Cinética de Crecimiento de E. coli O157:H7 en presencia de péptidos Ib-M ............. 33
5.1.4 Fase de Latencia ........................................................................................................... 33 5.1.5 Fase Exponencial ......................................................................................................... 34
5.1.6 Cinética de Letalidad ................................................................................................... 36
5.2 Actividad de Bioconjugado IbM1/NpOH@Qui contra E. coli O157:H7 ........................... 37
5.2.1 Concentración Mínima Inhibitoria y Concentración mínima Bactericida ................... 37
5.2.2 Cinética de Crecimiento de E. coli O157:H7 en presencia del Bioconjugado
IbM1/NpOH@Qui ................................................................................................................ 37
5.2.3 Cinética de Letalidad ................................................................................................... 39
5.3 Citotoxicidad en células VERO .......................................................................................... 40
5.3.1 Péptidos Ib-M............................................................................................................... 40
5.3.2 Bioconjugado IbM1/NpOH@Qui ................................................................................ 41
5.4 Índices de selectividad ........................................................................................................ 42
5.4.1 Péptidos Ib-M............................................................................................................... 42
5.4.2 Bioconjugado ............................................................................................................... 42
6. DISCUSIÓN ............................................................................................................................. 43
7. CONCLUSIONES .................................................................................................................... 49
8. REFERENCIAS ........................................................................................................................ 50
XII
RESUMEN
TITULO: ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA Y CITOTÓXICA DE BIOCONJUGADOS DE
PÉPTIDOS IB-M CON NANOPARTÍCULAS DE ÓXIDO DE HIERRO CONTRA Escherichia
coli O157:H7 Y CÉLULAS VERO
AUTOR: SERGIO ALFONSO PRADA PRADA
PALABRAS CLAVE: O157:H7, Péptidos Ib-M, Nanopartículas de óxido de hierro,
Bioconjugado, Actividad Antibacteriana
DESCRIPCIÓN
Escherichia coli O157:H7 es el patógeno más común aislado en brotes relacionados con
alimentos cárnicos, está directamente asociado con el desarrollo del Síndrome Hemolítico
Urémico (SHU) y posee gran capacidad para desarrollar resistencia antimicrobiana. Péptidos Ib-
M son análogos de Ib-AMP4 (Derivados de Impatiens balsamina) y han mostrado actividad
contra E. coli no patógena. Los péptidos suelen ser susceptibles a ser degradados rápidamente en
entornos fisiológicos; el uso de nanopartículas de óxido de hierro recubiertas con quitosano
(NpOH@Qui) como moléculas transportadoras los protege del efecto de las proteasas y sus
propiedades magnéticas los dirige con mayor especificidad a los órganos blanco.
En este estudio se evaluó la actividad contra E. coli O157:H7 y su citotoxicidad en células
VERO de péptidos Ib-M y del bioconjugado de péptido Ib-M con nanopartículas de óxido de
hierro recubiertas con quitosano (IbM/NpOH@Qui). Para ello, la actividad antibacteriana de los
péptidos Ib-M y de IbM/NpOH@Qui se obtuvo al determinar la Concentración Mínima
Inhibitoria (CMI), Concentración Mínima Bactericida (CMB), Cinética de Crecimiento y
Letalidad. El efecto citotóxico de los compuestos se evaluó por MTT y posteriormente se calculó
la Concentración Citotóxica 50 (CC50) e índices de selectividad (IS).
La CMI de péptidos Ib-M se obtuvo en un rango de 1,6 a 12,5 μM y la CMB de 3,7 a 22,9μM.
Células VERO en presencia de péptidos Ib-M mostraron CC50 en un rango de 197,5 a >400 µM.
Ib-M1 fue el péptido seleccionado para ser inmovilizado en la NpOH@Qui. El bioconjugado
IbM/NpOH@Qui obtuvo una CMI de 12,5 μM contra E. coli O157:H7 y en células VERO una
CC50 >25 µM (357 µg/Ml NpOH@Qui). Los péptidos libres y el bioconjugado presentaron
actividad in vitro contra E. coli O157:H7. El Bioconjugado se considera un nanotransportador
promisorio que una vez sea perfeccionado podría ser llevado a ensayos de experimentación in
vivo.
XIII
ABSTRACT
TITTLE: ANTIBACTERIAL AND CYTOTOXIC ACTIVITY OF BIOCONJUGATES OF IB-
M PEPTIDES WITH IRON OXIDE NANOPARTICLES AGAINST Escherichia coli O157: H7
AND VERO CELLS
AUTHOR: SERGIO ALFONSO PRADA PRADA
KEYWORDS: O157:H7, Ib-M peptides, Iron Oxide Nanoparticles, Bioconjugate, Antibacterial
Activity
DESCRIPTION
Escherichia coli O157:H7 is the most common pathogen isolated in outbreaks related to meat
foods, is directly associated with the development of Hemolytic Uremic Syndrome and has great
capacity to develop resistance to antibiotics. Ib-M peptides are analogs of Ib-AMP4 (Derived
from Impatiens balsamina) and have shown activity against nonpathogenic E. coli. Peptides are
usually susceptible to rapid degradation in physiological environments; the use of iron oxide
nanoparticles coated with chitosan (NpOH@Qui) as carrier molecules protects them from the
effect of proteases and their magnetic properties direct them with greater specificity to target
organs.
In this study the activity against E. coli O157: H7 and its cytotoxicity in VERO cells of Ib-M
peptides and peptide bioconjugate Ib-M with iron oxide nanoparticles coated with chitosan
(IbM/NpOH@Qui) will be evaluated. The antibacterial activity of Ib-M peptides and
IbM/NpOH@Qui was obtained by determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC),
Minimum Bactericidal Concentration (MBC), Growth and Lethality Kinetics. The cytotoxic effect of the compounds was evaluated by MTT and then Cytotoxic Concentration 50 (CC50) and
selectivity indexes were calculated.
The MIC of peptides Ib-M was obtained in a range of 1.6 to 12.5 μM and the MBC of 3.7 to 22.9
μM. VERO cells in the presence of Ib-M peptides showed CC50 in a range of 197.5 to >400 μM.
Ib-M1 was the peptide selected to be immobilized on the NpOH@Qui. The bioconjugate
IbM1/NpOH@Qui obtained a CMI of 12.5 μM against E. coli O157: H7 and in VERO cells a
CC50 >25 μM (357 μg/mL NpOH@Qui). The free peptides and the bioconjugate showed in vitro
activity against E. coli O157:H7. The Bioconjugate is considered a promising nanotransporter
that once perfected could be taken to in vivo experimentation trials.
1
INTRODUCCIÓN
Escherichia coli (E. coli) es el microorganismo cosmopolita más comúnmente encontrado como
comensal en la mayoría de organismos superiores del planeta, se podría estimar que a una sola
persona se podría aislar hasta 1021 bacterias (Conway, 2015). E. coli O157:H7 es una cepa del
patotipo enterohemorrágico que cursa generalmente con diarrea acuosa, con o sin sangre,
calambres abdominales y menos comúnmente náuseas y vómitos (Murray, 2016); su
patogenicidad se debe principalmente a 3 factores de virulencia: el Locus de Borramiento de
Eritrocitos (LEE de sus siglas en ingles), el plásmido pO157 (Lim, 2010) y las toxinas shiga
(Stx1 y Stx2), que son las causantes del Síndrome Hemolítico Urémico (SHU) el cual cursa con
anemia hemolítica, trombocitopenia y falla renal (Farfán-García, 2016). Esta cepa es el patógeno
aislado con mayor frecuencia en brotes relacionados a contaminación de alimentos y se ha
detectado en al menos 21 países incluyendo algunos de América Latina (Bruyand, 2017),
principalmente en los desarrollados (Cobbold, 2004) y/o en los que poseen una gran industria
productora de cárnicos ya que el ganado es un reservorio natural (Lim, 2010). Se estima que
alrededor del mundo anualmente las cepas productoras de toxina shiga causan 2.801.000 casos
de diarrea aguda, 3.890 casos de SHU, 270 casos de fallo renal, y 230 muertes (Majowicz, 2014).
E. coli ha demostrado un progreso en el desarrollo de resistencia a antibióticos a nivel
mundial (Vila, 2016) con países como Corea con reportes de poblaciones pesqueras con cepas
resistentes a ampicilina, cefalotina y tetraciclina (Shin, 2013), Ecuador donde existen cepas
resistentes a 12 antibióticos diferentes (Zhang, 2015) y Brasil con aislamientos clínicos de cepas
resistentes a ampicilina, trimetoprim-sulfametoxazol, tetraciclinas, cloranfenicol y ácido
nalidíxico (Oliveira, 2017); otros países como España y Argentina están tomando medidas en
2
salud pública para combatir el avance de la generación de resistencias con programas para el
control del expendio de antibióticos. En Colombia el Instituto Nacional De Salud creó la Red
Nacional para la Prevención Vigilancia y Control de Infecciones Asociadas a las Atenciones en
Salud (IAAS) y Resistencia a los Antimicrobianos (Instituto Nacional De Salud, 2017) con el fin
de asesorar y apoyar la formulación e implementación de políticas nacionales para la prevención,
vigilancia y control de IAAS y Resistencia a los Antimicrobianos en el ámbito hospitalario y
comunitario y que promueva la articulación de acciones intersectoriales que fortalezcan los
procesos de educación, investigación y divulgación impactando de manera positiva en la
prevención y control de estos eventos de interés en el país.
Los péptidos antimicrobianos (PAM) sobresalen como una alternativa dada la baja
probabilidad de desarrollo de resistencias (Pereira, 2006). De las semillas de Impatiens
balsamina se han logrado aislar los PAM denominados como la familia Ib-AMP, estos se
caracterizan por ser catiónicos, altamente básicos y por la presencia los 2 puentes disulfuro en su
estructura. De esta familia, Ib-AMP4 ha presentado principalmente actividad antifúngica contra
Fusarium culmorum, Neurospora crassa y Botrytis cinerea. (Thevissen, 2005), En 2014 con el
fin de mejorar el efecto antimicrobiano, Flórez y Colaboradores alteraron la carga neta e
hidrofobicidad del dominio C-terminal de este, sintetizando una familia de péptidos análogos de
Ib-AMP4 denominada Ib-M la cual fue probada contra una cepa de E. coli no patógena
mostrando una mejoría en su actividad.
Debido a su propia naturaleza, los PAM son susceptibles a ser diana de proteasas en
diversos entornos fisiológicos (Téllez, 2010). Para evitar que sean fácilmente degradados estos
pueden ser fijados en la superficie de diversas moléculas transportadoras (Bruno, 2013). Las
3
nanopartículas de óxido de hierro (NpOH) en la actualidad son ampliamente investigadas por su
carga eléctrica, propiedades magnéticas, químicas (Huber, 2005) y alta biocompatibilidad
(Vanegas, 2014). Su reactividad con el oxígeno y carga negativa en su superficie han demostrado
capacidad microbicida contra E. coli no patógena sin presentar citotoxicidad (Auffan, 2008), y
por su carácter superparamagnético han sido usadas como transportadores para el
direccionamiento de biomateriales tales como anticuerpos monoclonales (Peng, 2008). Debido a
que las nanopartículas no son estables en ambientes acuosos, para ser usadas como
transportadores estas deben ser funcionalizadas con recubrimientos proteicos, lipídicos,
carboxílicos o polímeros sintéticos (Assa, 2016). El Quitosano, un polisacárido biodegradable,
biocompatible y bioactivo (Gui-yin Li, 2008) ha mostrado, junto con otras moléculas metálicas,
actividad contra E. coli no patógenas (Lifeng Qi, 2004). Este recubrimiento a su vez permite unir
de forma covalente las nanopartículas transportadoras a los péptidos para ser usados como
tratamiento de enfermedades como el cáncer (Bhunchu, 2013.) Este procedimiento es conocido
como bioconjugación, la cual es una estrategia química que consiste en enlazar dos o más
moléculas para crea un conjugado biológicamente activo que combina las propiedades
intrínsecas de los dos componentes que lo conforman (Garrido, 2016). La bioconjugación no
solo protege a los biomateriales de ser degradados, también mejora su actividad disminuyendo
los efectos secundarios de los medicamentos al permitir su acción directa sobre los sitios diana
gracias a la reducción en las concentraciones requeridas para la actividad de estas (Assa, 2016).
Este estudio propone la evaluación de la susceptibilidad in vitro de E. coli O157:H7 al
bioconjugado IbM/NpOH@Qui, conformado por péptido Ib-M inmovilizado con las
nanopartículas de óxido de hierro recubiertas con quitosano, dicho transportador podría proteger
4
a los péptidos de las proteasas y haciendo uso de sus propiedades magnéticas permitiría su
dirección a las áreas donde se requiera el efecto del bioconjugado.
1
1. MARCO TEÓRICO
1.1 Escherichia coli
E. coli es un bacilo Gram negativo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae y es uno
de los microorganismos más estrechamente relacionados con el ser humano (Mandell, 2015;
Murray, 2016). Su amplia distribución a nivel mundial nos permite encontrarla en casi todos los
países del mundo y su capacidad adaptativa le permite desarrollarse en diversos ambientes a los
que puede estar expuesta (Goto, 2011; NandaKafle G, 2018). En este sentido, podemos ver al
microorganismo habitar desde suelos, lagos y otras fuentes hídricas (Hartl, 1984), hasta
compartimientos del cuerpo de organismos superiores como los tractos urogenital y digestivo
(Pitout, 2012; Vila, 2016). Se han identificado cepas comensales y patógenas con nuestra
especie; las comensales permanecen en el lumen intestinal sin causar enfermedad (Jafari, 2012;
Mandell, 2015), con una población cercana de 1020 bacterias (Tenaillon, 2010), siendo posible
que en el humano se puedan aislar hasta 1021 bacterias (Conway, 2015). Las cepas patógenas
generalmente se encuentran confinadas al lumen intestinal al igual que las comensales, pero estas
cepas poseen factores de virulencia característicos que les permiten generar cuadros severos no
solo de gastroenteritis sino también de bacteriemia, infecciones del tracto urinario, meningitis y
sepsis (Murray, 2016) (Tabla 1).
2
Tabla 1. Factores de Virulencia Especializados Asociados a E. coli
Factores de Virulencia Especializados Asociados a E. coli
Patotipo Adhesinas Exotoxinas
ECET
Factores Antigénicos de
Colonización
(CFA/I, CFA/II, CFA/III)
Toxina Termolábil (LT-1);
Toxina Termoestable (STa)
ECEP
Pili de Formación de haces,
Intimina
ECEA
Fimbrias de Adherencia
Agregativa
(AAF/I, AAF/II, AAF/III)
Toxina Enteroagregativa
Termoestable
Toxinas codificadas en
plásmidos
ECEH
Pili de Formación de haces,
Intimina
Toxinas Shiga (Stx1, Stx2)
ECEI Plásmido Invasivo Antigénico Hemolisina (HlyA)
Uropatógenas Pili P; Fimbria Dr
Fuente: Tomada de Murray, 2016
1.1.1 Patotipos
Las cepas patógenas de E. coli han sido clasificadas según los factores de virulencia que
les permiten el desarrollo de la enfermedad gastrointestinal y/o extra intestinal, estos se
encuentran codificados ya sea en plásmidos y/o Fagos que permiten la transmisión de la
información entre cepas (Mandell, 2015; Murray, 2016; Vila, 2016). Existen 5 patotipos
relacionados con la enfermedad gastrointestinal y 1 que reúne, sin diferenciar, todos los cuadros
3
extra intestinales producidos por E. coli; esto patotipos se conocen como E. coli
Enterotoxígenica (ECET), E. coli Enteropatógena (ECEP), E. coli Enteroagregativa (ECEA), E.
coli Enteroinvasiva (ECEI), E. coli Enterohemorrágica o productora de shiga/verotoxinas (ECEH
o ECST/ECVT) y E coli Extraintestinales Patógenas (ExPEC).
1.1.1.1 Infecciones intestinales
1.1.1.2 E. coli Enterotoxígenica (ECET)
Es el patotipo que es el que se aísla con mayor frecuencia, hasta un 30%, en los pacientes
que cursan con la diarrea del viajero, (Murray, 2016) y se adquiere mediante la ingestión de agua
o alimentos muy contaminados, debido principalmente a deficiencias en las condiciones de
salubridad (Mandell, 2015). Puede ser aislada de pacientes asintomáticos y aunque generalmente
la infección se presenta con un cuadro de diarrea acuosa, a veces puede estar acompañada de
cefalea y vómito (Farfán-García, 2016).
La enfermedad se presenta por la adhesión de la bacteria a los enterocitos mediante
adhesinas o factores de colonización o antígenos coli (Mandell, 2015) y la secreción de toxinas
termoestables y termolábiles, de las cuales cada una posee 2 subclases: toxinas termoestables A y
B; y toxinas termolábiles I y II; y de las cuales solo la toxina termoestable B no ha sido asociada
al desarrollo de la enfermedad (Murray, 2016)
1.1.1.3 E. coli Enteropatógena (ECEP)
Este patotipo se aísla generalmente en pacientes menores de 2 años que cursan con un
cuadro súbito de diarrea acuosa severa acompañada de fiebre y vómito (Murray, 2016). Se
4
identificó por primera vez en 1940 como el agente etiológico de diarrea neonatal adquirida por la
comunidad y nosocomial; en la actualidad solo afecta principalmente al continente africano
(Mandell, 2015).
La infección por ECEP se caracteriza por la presencia (Típica) o ausencia (Atípica) de un
plásmido de adherencia que codifica para la formación de pili tipo IV que le confieren al
microorganismo la capacidad de unirse al enterocito de forma localizada formando
microcolonias (Mandell, 2015; Murray, 2016; Farfán-García, 2016) y causando el fenómeno de
“Fijación y Borrado” de las microvellosidades de los enterocitos, mediado por una isla de
patogenicidad llamada Locus LEE que codifica para el sistema de secreción tipo III (SST3), la
adhesina de membrana externa, la intimina, el receptor trasladador de la intimina y proteínas
reguladoras y efectoras (Mandell, 2015).
1.1.1.4 E. coli Enteroagregativa (ECEA)
La invasión del intestino delgado y a veces el colon por este microorganismo se caracteriza
por su forma de “apilarse como ladrillos”, causando diarrea acuosa con moco (Mandell, 2015;
Murray, 2016; Farfán-García, 2016) y a veces hematoquecia (Mandell, 2015); la infección
también cursa con fiebre, náuseas, vómito y dolor abdominal (Murray, 2016). Puede encontrarse
causando diarrea crónica en infantes y pacientes VIH positivo (Mandell, 2015; Murray, 2016;
Farfán-García, 2016) y ha sido relacionada con el retraso del crecimiento. Se encuentra tanto en
países subdesarrollados como desarrollados (Mandell, 2015; Murray, 2016).
Su mecanismo de adhesión depende de: un plásmido que codifica el factor regulador AggR
responsable de la expresión de fimbrias de adhesión (AAF I-IV), un sideróforo presente en
5
especies de Yersinia (Irp2), una enterotoxina de Shigella (ShET1) y dos proteínas Fis y YafK
junto con un sistema de secreción tipo VI; proteínas de la membrana externa resistentes al calor
con actividad aglutinina y adhesina (Hra-1), con actividad adhesina (Hra-2) y una homóloga de
Hra-1 con actividad invasora y adhesina (Tia) (Mandell, 2015; Farfán-García, 2016).
Otros factores de virulencia de esta cepa son la producción de una toxina termo estable que
altera el transporte de iones e incrementan el GMPc (EAST1) y la producción de SPATEs, una
familia de proteasas, involucradas en la colonización intestinal (Pic) mediante el incremento del
número de células caliciformes y la producción de moco que atrapa las bacterias auto-
aglutinándolas en el epitelio intestinal y una toxina codificada en plásmidos (Pet) que es
citotóxica y se une a la espectrina en la membrana del complejo de Golgi, bloqueando su función
y causando el redondeamiento de la célula (Farfán-García, 2016).
1.1.1.5 E. coli Enteroinvasiva (ECEI)
Este patotipo está relacionado filogenéticamente con Shigella y debido a esto sus
mecanismo de patogenicidad también son muy similares (Mandell, 2015; Murray, 2016; Farfán-
García, 2016) al poseer de igual forma un gran plásmido de invasión que codifica un SST3 que
permite a las bacterias invadir las células epiteliales, escapar del fagosoma, multiplicarse en el
citoplasma, usurpar el mecanismo de ensamblaje de los filamentos de actina del huésped y
diseminarse directamente de célula a célula (Mandell, 2015). Su infección produce inicialmente
diarrea acuosa que fácilmente evoluciona en disentería con fiebre consistente, cólico abdominal,
tenesmo y deposiciones con sangre y leucocitos (Murray, 2016)
6
Su cuadro puede ser comúnmente confundido con los característicos de Shigella o por
infección con ECET, es poca la información epidemiológica sobre esta cepa y los reportes son
raros tanto en países desarrollados como subdesarrollados (Murray, 2016) y se asocian más a
brotes y casos aislados de transmisión persona a persona, por ingestión de alimentos y agua
contaminada, convirtiéndose en un patógeno importante en niños sobre seis meses de edad
(Farfán-García, 2016).
1.1.1.6 E. coli Enterohemorrágica o productora de SHIGA/Verotoxinas (ECEH o
ECST/ECVT)
Este patotipo se caracteriza por producir los 2 diferentes tipos de toxinas shiga (Stx1 y 2)
similares a las producidas por Shigella dysenteriae tipo 1 (Farfán-García, 2016), es prevalente en
países desarrollados donde afecta generalmente a niños menores de 5 años, se encuentra en aguas
de consumo/recreo, pero los brotes están relacionados con el consumo de alimentos
contaminados mal procesados/preparados y se requiere la ingesta de no más de 100
microorganismos para provocar enfermedad (Mandell, 2015; Murray, 2016).
La sintomatología va desde una diarrea leve hasta colitis hemorrágica con dolor abdominal
severo y diarrea sanguinolenta resolviéndose sin tratamiento entre los 4 a 10 días (Murray,
2016). Un porcentaje (5%-10%) de los pacientes llega a complicarse desarrollando el Síndrome
Hemolítico Urémico (SHU) el cual produce con anemia hemolítica con esquistocitos,
trombocitopenia, azotemia y falla renal (Murray, 2016; Farfán-García, 2016). Otros órganos
afectados a menudo son: el cerebro (accidentes cerebro vasculares), los ojos (ceguera) y el colon
(isquemia intestinal). En los adultos la afectación del cerebro y de otros órganos suele conducir
al diagnóstico de púrpura trombocitopénica trombótica (Mandell, 2015). Un porcentaje menor
7
puede morir a causa de este (3%-5%) y el 30% de los sobrevivientes tienen secuelas como daño
renal permanente, hipertensión y daño en el sistema nervioso central (Murray, 2016).
Este cuadro clínico está mediado por el uso del SST3 producto del Locus LEE, mismo del
patotipo ECEP que de igual forma le permite tener el efecto de “Fijación y Borrado” y por la
producción de las toxinas shiga Stx1 que es idéntica a la toxina producida por Shigella
dysenteriae tipo 1 y Stx2 que comparte un 60% de semejanza en su secuencias y funcionalidad.
Estas toxinas poseen una subunidad A y cinco subunidades B idénticas que se unen a
globotriaosilceramidas (Gb3) y glucoesfingolípidos de las microvellosidades de los enterocitos y
las células renales. Una vez dentro de la célula al llegar al retículo endoplásmico, la toxina es
cribada y la subunidad A cataliza la despurinización de un residuo específico de adenina en el
ARN ribosómico 28S, haciendo que el ribosoma se vuelve no funcional y para la síntesis de
proteínas (Mandell, 2015; Murray, 2016). Su diseminación más allá del intestino está mediada
por la unión de la toxina a leucocitos. Estos al cruzar por los endotelios los exponen a las toxinas
y al ser susceptibles, su daño lleva a la activación de las plaquetas y sedimentación de la
trombina que resultan en una disminución de la filtración glomerular y el fallo renal agudo
(Murray, 2016).
1.1.1.7 SEROTIPO O157:H7
Del patotipo ECEH, esta cepa se caracteriza por estar presente en la mayoría de brotes
relacionados con el consumo de alimentos contaminados, en especial productos cárnicos.
Además de los factores de virulencia propios de las cepas ECEH, E. coli O157:H7 posee un
plásmido altamente conservado no conjugativo tipo F con un tamaño entre 92 a 104kb que
incrementan el carácter virulento de la cepa: pO157. Este plásmido codifica para una serie de
8
enzimas: Hemolisinas, Catalasa-Peroxidasa, Sistema de Secreción Tipo II (SST2), Proteasa
Sérica, Metaloproteasa; una proteína de unión putativa: ToxB, que apoya la adhesión de la
bacteria a la célula junto al SST2 y un conjunto fragmentos genéticos conservados: Genes-
Positivos eae que codifica para un operón (ecf1-4). De este conjunto: ecf1 codifica una enzima
polisacárido desacetilasa, ecf2 codifica una LPS α-1,7-N-acetilglucosamina transferasa, ecf3
muestra similitud con la proteína de la membrana externa en E. coli K1, asociada con la invasión
bacteriana y ecf4, también llamado msbB2 que codifica la segunda copia del lípido A miristoil
transferasa (Lim, 2010).
1.1.1.8 Infecciones Extra Intestinales (ExPEC)
A demás del cuadro clínico que puede causar las cepas de E. coli patógenas, es posible que
estas colonicen compartimientos a los que no están habituadas, causando meningitis neonatal,
neumonía nosocomial, colecistitis y colangitis, peritonitis, celulitis, osteomielitis y artritis
infecciosa (Mandell, 2016). Este conjunto de E. coli patógenas fue denominado ExPEC (Russo y
Johnson, 2000).
Estas cepas de E. coli pueden ser fácilmente confundidas con cepas comensales y no
pueden ser diferenciadas de ya que las ExPEC tiene la capacidad de usar diferentes
combinaciones de factores de virulencia (Kohler, 2011; Vila, 2016) (Tabla 2).
9
Tabla 2. Factores de Virulencia de ExPEC
Factores de Virulencia de ExPEC
Categoría Funcional Factor
Adhesinas
Fimbrias Tipo 1 (Fim)
Fimbrias P (Pap/Prf)
Fimbrias S/F1C (Sfa/Foc)
Fimbrias específicas de N-acetil d-glucosamina- (Gaf)
M-aglutinina (Bma)
Adhesina/Receptor de enterobactina bifuncional (Iha)
Adhesina Afimbrial (Afa)
Hemaglutinina sensible a la temperatura (Tsh)
Invasinas Invasión del endotelio cerebral (IbeA)
Adquisición del
Hierro
Receptor de sideróforo IreA
Aerobactina (Iuc)
Yersiniabactin (Ybt)
Salmochelin (Iro)
Proteína periplasmática de unión al hierro (SitA)
Toxinas
alfa-hemolisina (HlyA)
Toxina de distensión citoletal IV (CDT 1)
Factor necrotizante citotóxico 1 (CNF-1)
Hemolisina putativa (HlyF)
Colibactin (Clb)
Serina proteasas autotransportadores Sat, Pic
10
Factores de Virulencia de ExPEC
Categoría Funcional Factor
Protectinas
Cápsula K1, Grupo II cápsula incl.
Proteína de exclusión de superficie de transferencia
conyugal (TraT)
Proteasa de membrana externa T (OmpT)
Aumento de la supervivencia sérica (Iss)
Colicina V (Cva)
Otros
d-serina desaminasa (DsdA)
Subunidad del transportador de PTS específico de la
maltosa y la glucosa
IICB (MalX)
Flagelos
Fuente: Tomado de Kohler, 2011. Tabla 1: Factores de Virulencia de ExPEC
1.1.2 Tratamiento antimicrobiano contra E. coli O157:H7
Antibióticos como carbapenems, azitromicina y rifaximina han sido usados como respuesta
a las infecciones por ECEH dependiendo del cuadro clínico del paciente (Bielaszewska, 2012).
Actualmente el tratamiento con antibióticos para infecciones por ECEH, especialmente sobre la
cepa O157:H7, es ampliamente discutido dada la controversia sobre si estos favorecen o no la
secreción de las toxinas shiga (Rahal, 2012; Mir, 2018). Está demostrado que terapias con otros
antibióticos como la fosfomicina (Kurioka, 1999), el meropenem (Corogeanu, 2012) y la
rifamixina (Ochoa, 2007) no incrementan la producción/liberación de las toxinas shiga, las
cuales han sido directamente relacionadas con el SHU. Algunos autores han atribuido el
11
incremento del riesgo a desarrollar SHU a un tipo de antibiótico en específico más que al uso de
estos a nivel general como con el uso los β-lactamicos (Smith, 2012) y de forma similar se ha
demostrado que algunos antibióticos como trimetoprim-sulfametoxazol, azitromicina,
gentamicina, penicilinas, estreptomicina, ciprofloxacina, fosfomicina y cefalosporinas de
espectro expandido incrementan la secreción de las toxinas shiga cuando se administran en
concentraciones inferiores a la inhibitoria (Ochoa, 2007). En este orden de ideas, siempre se debe
evaluar el riesgo de generar SHU que posee cada antibiótico antes de ser usados para el
tratamiento de las infecciones por O157:H7 (Safdar, 2002; Ochoa, 2007).
1.1.3 Resistencia a antibióticos en E. coli
E. coli ha demostrado una gran capacidad para el desarrollo de resistencias a antibióticos
de uso convencional, varios autores alrededor del mundo reportan hallazgos de cepas
provenientes de pacientes diarreicos con pérdida de sensibilidad a uno o varios antibióticos de
uso común (Shin, 2013; Zhang, 2015; Vila, 2016; Oliveira, 2017) (Tabla 3). Las cepas aisladas
de otros tipos de muestras como la orina, pus, esputo, entre otros, también tienen documentado el
desarrollo de resistencia a diversos antibióticos (Mulla, 2011: Bartoloni, 2016). En este orden de
ideas se puede considerar que indiferente de la cepa de E. coli, todas se pueden considerar con la
misma capacidad de desarrollar resistencia a múltiples antibióticos (Tenaillon, 2010). Hablando
puntualmente de O157:H7, se ha reportado resistencia hasta a 18 antibióticos diferentes entre los
aminoglucosidos, β-lactamicos, macrólidos, quinolonas, sulfaminas, tetraciclinas, cloranfenicol,
trimetroprim y fosfomicina entre otros (Mir, 2018).
12
Tabla 3. Recopilación de Trabajos sobre resistencia de E. coli
Autor País Resistencias
Oliveira, 2017 Brasil
Ampicilina (34.7%)
Trimetropin/Sulfametoxazol (23.5%)
Amoxicilina/Ac. Clavulánico (17.3%)
Ac. Nalidíxico (10.2%)
Vila, 2016
Varias
Regiones
Cefalosporinas de 3ra Generación (>70%)
Fluoroquinolonas (>50%).
Zhang, 2015 Ecuador Ampicilina (90% Casos y 62,5% controles)
Shin, 2013 Corea
Ampicilina (34% Controles y 29% Casos)
Cefalotina (36% Casos)
Tetraciclina (41% Controles y 60% Casos)
Ochoa, 2009 Perú
Ampicilina (85%)
Clotrimoxazol (79%)
Tetraciclinas (65%)
Ac. Nalidíxico (28%).
Fuente: El Autor
1.2 Péptidos antimicrobianos (PAM)
Son cadenas cortas de no más de 100 aminoácidos que hace parte del sistema inmune
innato tanto de animales como de plantas y actúan como respuesta ante microorganismos
patógenos (Malanovic, 2015). Están clasificados por su estructura como hélices α o plegamientos
13
β, por su carga como aniónicos o catiónicos (Rivera, 2007) y por su afinidad entre células
bacterianas o de mamífero (Wang, 2009). Normalmente son catiónicos y tienen un lado
hidrofóbico e hidrofílico que permite que la molécula sea soluble en entornos acuosos y pueda
difundir entre en las membranas ricas en lípidos (Izadpanah, 2005). Algunos péptidos son
producidos constitutivamente, mientras que otros son inducidos por citoquinas proinflamatorias
y productos microbianos exógenos, su producción parte de grandes precursores que contienen
una o más copias del segmento activo y que son activadas por proteólisis (Rivera, 2007).
1.2.1 Mecanismo de Acción
El mecanismo de acción de los PAM se basa principalmente en su carga catiónica,
hidrofobicidad e hidrofilicidad (Izadpanah, 2005). La carga catiónica orienta los péptidos
inicialmente a los envoltorios celulares de los microorganismos donde su carácter hidrofóbico e
hidrofílico les permite lisar al microorganismo al saturar la membrana para generar inestabilidad
incrementando la permeabilidad, insertándose en ella para generar poros o canales de iones
(Tam, 2015), o difundiendo por ésta y/o por los poros generados para alcanzar dianas
intracelulares como el material genético y ribosomas (Tellez, 2010). Además de la actividad
antimicrobiana directa, los PAM poseen efectos inmunomoduladores como la regulación de la
respuesta proinflamatoria causada endotoxinas bacterianas como el lipopolisacárido de las
bacterias Gram-negativas, el peptidoglicano y ácido lipoteicoico de las bacterias Gram-positivas
(Riool, 2017).
La ventaja que tiene los péptidos con respecto a los antibióticos de uso convencional es la
baja probabilidad de desarrollo de resistencias que pueden tener los microorganismos contra
estos debido a la complejidad los cambios que requeriría la estructura de las membranas para
14
lograrla (Giuliani, 2007). Los estudios se han basado principalmente en los efectos que los
péptidos pueden tener sobre patógenos Gram negativos como Acinetobacter baumannii (Jiang,
2014) y Pseudomonas aeruginosa (Jiang, 2014; Maisetta, 2017).
Actualmente se han descrito al menos 20 PAM en diferentes fases de investigación
dependiendo de la forma de administración y del tipo de microorganismo a tratar: Neuprex
(rBPI21), Pexiganan (Locilex), MSI 80, OG253 y OG716 en fase de desarrollo; HB1345, AA-
139, NVB333 y NP339 (Novamycin) en fase preclínica; LTX-109 (Lytixar) en fase I/II;
POL7080, SGX 942, C16G2 y P113 en fase II; NP213 (Novexatin) en fase IIa; Omiganan
(CLS001) y Brilacidin en fase II/III y Pexiganan (MSI-78), Omiganan (MBI-226) y Surotomycin
en fase III (Kang, 2014; Sierra, 2017).
1.2.2 Familia Ib-AMP
La familia Ib-AMP consta de 4 miembros que derivan su nombre se las siglas en inglés: I.
Balsamina Antimicrobial Peptides, usadas por Tailor en 1997 en su estudio sobre su actividad
antimicrobiana y su proteína precursora. Todos sus miembros se distinguen entre los demás
péptidos obtenidos de plantas por ser cadenas cortas de solo 20 aminoácidos de longitud,
catiónicos, altamente básicos por sus 3 - 6 residuos de arginina y por los 2 puentes disulfuro
formados entre sus 4 residuos de cisteína, siendo los 4 sintetizados a partir de una única proteína
precursora codificada en un solo gen (Figura 1)
15
Figura 1. Estructura general y Alineación de la Secuencia de los Péptidos Ib-AMP. Tomada de Tailor, 1997
La familia Ib-AMP en su totalidad ha presentado actividad antimicrobiana principalmente
contra diversas especies de hongos, principalmente filamentosos (Thevissen, 2005; Van der
Weerden, 2013) e Ib-AMP1 y Ib-AMP4 han mostrado actividad antibacteriana contra algunas
especies de bacterias Gram positivas y Gram Negativas (Tailor, 1999), siendo destacable en
estos 2 péptidos la presencia de 5 y 6 residuos de arginina respectivamente.
1.2.2.1 Análogos de Ib-AMP4 (Familia Ib-M)
La familia de péptidos Ib-M fue sintetizada por primera vez por Flórez en 2014, tomando
como base la secuencia del péptido Ib-AMP4, al cual le modificó su dominio carboxilo-terminal
mediante el reemplazo de las cisteínas por arginina o triptófano, variando su carga neta e
hidrofobicidad y la eliminación de los puentes disulfuro mediante el reemplazo de los residuos
de cisteína en las posiciones 6 y 7 por metionina (Tabla 4).
16
Tabla 4. Actividad antibacteriana del péptido nativo y sus análogos contra E. coli K-12 en Medio MH.
Fuente: Tomada y Modificada de Flórez, 2014.
En este estudio la actividad antibacteriana de los análogos fue evaluada contra la cepa de
E. coli K12 no patógena mediante la determinación de la Concentración Inhibitoria 50 (CI50),
mostrando una mejora en su actividad para la mayoría de análogos.
1.3 Nanopartículas de Óxido de Hierro Funcionalizadas con Quitosano
Podemos definir un bioconjugado como la molécula producto de un proceso que une
moléculas químicamente compatibles mediante las interacciones de sus grupos funcionales,
siendo generalmente la unión de los grupos expuestos en la superficie de un material metálico
con los grupos libres de diferentes biomoléculas como péptidos, proteínas o ácidos nucleicos
(Hermanson, 2008; Chen, 2014). Es un campo ampliamente explorado en la actualidad, ya que la
unión de nanopartículas metálicas con biomateriales permite que estas moléculas sean usadas
para: descubrimiento de ligandos, diagnóstico y tratamiento de enfermedades, tamizaje de alto
rendimiento y movilización a través de ambientes fisiológicos (Kalia, 2010).
17
Actualmente las nanopartículas metálicas son de gran interés y el hierro se encuentra entre
los materiales magnéticos más analizados. Las Nanopartículas de Óxido de Hierro (NpOH) son
moléculas compuestas por magnetita (Fe3O4) cuyo tamaño no es superior a 40nm. Su carácter
superparamagnético les confiere propiedades químicas y magnéticas únicas (Huber, 2005), que
junto a su baja toxicidad (Peng, 2008), las hacen propicias para un amplio número de
aplicaciones científicas y tecnológicas destacando su función vehículo para el
direccionamiento/transporte de biomoléculas en ambientes fisiológicos (Behera, 2012).
La interacción electrostática de las nanopartículas con las superficies bacterianas cargadas
negativamente las atrae a sus envoltorios celulares y promueve la penetración de las membranas
(Kandi, 2015). Cuando se encuentran en altas concentraciones, su reactividad con el oxígeno
permite la formación de especies reactivas de este, generando estrés oxidativo en los
microorganismos y siendo así un segundo mecanismo de acción sobre estos (Auffan, 2008;
Sathyanarayanan, 2013). El superparamagnetismo de las NpOH permite que estas puedan ser
dirigidas por cambios sutiles en el campo magnético que las rodea, haciendo posible
orientarlas/dirigirlas en las soluciones en las que se encuentran suspendidas. Diferentes tipos de
nanopartículas han sido usadas como modelos para el transporte de biomateriales en ambientes
fisiológicos como la circulación sistémica (Bruno, 2013). Para poder ser usadas como
transportadores, debido a su inestabilidad en ambientes acuosos como la sangre donde suelen ser
blanco de opsoninas (Kumar, 2009), las NpOH deben ser funcionalizadas (recubiertas) con
proteínas, lípidos, carbohidratos o polímeros sintéticos que les permitan permanecer en entornos
fisiológicos (Assa, 2016). Estos recubrimientos deben ser de alta porosidad, biodegradabilidad,
con tasa de degradación predecible, estructuralmente estables, no tóxicos para las células y
biocompatibles (Elieh-Ali-Komi, 2016). Está demostrado que moléculas como el Quitosano, un
18
polisacárido derivado de la quitina (Gao, 2012), mejora la absorción de macro moléculas
hidrofílicas y debido a su peso molecular es poco absorbido evitando efectos secundarios (Bruno,
2013). Gui-yin Li en 2008 describe el procedimiento para recubrir las nanopartículas con este
polisacárido que además de cumplir con las características ya mencionadas no es trombogénico,
inmunogénico o pro inflamatorio; es estable en sangre, evita la activación del sistema inmune y
es aplicable a diversos compuestos biológicos como proteínas, péptidos y nucleótidos (Bruno,
2013).
19
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar la actividad antibacteriana y citotóxica del bioconjugado (IbM/NpOH@Qui)
preparado a partir de péptidos modificados de Impatiens balsamina (Ib-M) y nanopartículas de
óxido de hierro contra Escherichia coli O157:H7 y células VERO respectivamente.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Evaluar la actividad antibacteriana de los péptidos modificados de Impatiens balsamina
contra cepas de E. coli.
2. Evaluar la actividad antibacteriana del bioconjugado (IbM/NpOH@Qui) contra E. coli
O157:H7.
3. Evaluar la citotoxicidad de los péptidos modificados de Impatiens balsamina contra de
células Vero ATCC.
4. Evaluar la citotoxicidad del bioconjugado (IbM/NpOH@Qui) contra células Vero ATCC.
20
3. METODOLOGÍA
El desarrollo de la metodología se llevó a cabo como se muestra en la Figura 2, inicio con
la evaluación de la actividad antibacteriana y citotóxica de los péptidos Ib-M libres mediante los
métodos señalados en la figura para posteriormente determinar los índices de selectividad de los
péptidos libres con el fin de escoger el más apropiado para la síntesis del bioconjugado, este una
vez realizado es evaluado mediante el mismo set de experimentos.
Figura 2. Desarrollo de la metodología. CMI: Concentración Mínima Inhibitoria, CMB: Concentración Mínima
Bactericida, CC50: Concentración Citotóxica 50, IS: Índice de Selectividad
21
3.1. MATERIALES
3.2 Compuestos
3.2.1 Familia de Péptidos Ib-M
Los péptidos Ib-M 1, 2, 4, 5 y 6 fueron sintetizados por Biomatik® acorde al diseño de
Flórez-Castillo en 2014. Las soluciones stock fueron preparadas en Buffer Tris HCl 10 mM pH
7,4 a una concentración de 2 mM y se almacenó a -80°C por un periodo máximo de 7 meses. Las
soluciones de trabajo se preparaban durante cada ensayo con Caldo Müller-Hinton al doble o a
las concentraciones descritas en cada método.
3.2.2 Bioconjugado IbM1/NpOH@Qui
Fue sintetizado y caracterizado por los doctores José Luis Ropero, Johana Marcela Flórez y
la estudiante de química Nathalia Ardila Rosas en el laboratorio de Biotecnología de la UDES
(Ardila, 2019). La concentración fue expresada en términos de la cantidad de péptido Ib-M
inmovilizado a la nanopartícula de óxido de hierro recubierta con quitosano (NpOH@Qui) y la
cantidad de nanopartícula de óxido de hierro (NpOH) presente en el bioconjugado: µM de Ib-M
(µg/mL de NpOH).
El bioconjugado fue preparado y almacenado a -20°C 2 días antes de cada experimento, las
soluciones stock fueron diluidas en agua tipo I en un rango de concentración de 40 a 60 µM de
Ib-M1 (800 µg/ml de NpOH); soluciones de NpOH@Qui y NpOH a una concentración de 800
µg/ml también fueron preparados. Cada vial se acompañaba de una prueba de esterilidad con el
fin de confirmar la inocuidad del procedimiento y asegurar que no existía contaminación con
22
otros microorganismos. Las soluciones de trabajo se preparaban durante cada ensayo con CMH
al doble o a las concentraciones descritas en cada método.
3.2.3 Antibióticos de referencia
La Estreptomicina y Gentamicina se adquirieron de la casa comercial SIGMA-Aldrich. Las
soluciones stock fueron preparadas inmediatamente antes de cada ensayo en CMH a una
concentración de 2 mM. Las soluciones de trabajo se preparaban durante cada ensayo con CMH
al doble o a las concentraciones descritas en cada método.
3.3 Material Biológico
3.3.1 Cepas de E. coli O157:H7
Fueron utilizadas 2 cepas de E. coli O157:H7: 1) Una cepa de referencia adquirida
comercialmente (ATCC® 43888™) y 2) Un Aislado clínico (AC188) obtenido de un paciente
diarreico, la cepa fue suministrada por la M. Sc. Ana Elvira Farfán-García del Laboratorio de
Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas (LIBB) de la Universidad de Santander; AC188
fue aislada en el marco del proyecto “Studies on emergent diarrheagenic E. coli pathogens.
Cinical protocol” Financiado por el NIH. Las cepas se mantuvieron preservadas en tubos
eppendorf a -80°C en caldo LB con 15% de glicerol, Para la reactivación de los
microorganismos, se adicionó 50 µL del material criopreservado en 5 mL de Caldo LB y se
incubó a 35±2°C de 18 a 24 horas antes de cada ensayo.
23
3.3.2 Células Vero
Células VERO (ATCC® CCL-81™) fueron donadas por la Doctora Liliana Torcoroma
García del laboratorio de Biología Celular Virginia Gutiérrez de Pineda de la UDES. Estas
fueron mantenidas en medio RPMI 1640 suplementado con SBFi al 10% e incubadas en una
atmósfera con 5% de CO2 a 35±2°C.
3.4 Medios
Caldo Luria Bertani (Laboratorios Conda, S.A.), Caldo Müller-Hinton (OXOID LTD),
Agar Müller-Hinton (MERCK), Agar Sangre (OXOID LTD), RPMI (GIBCO™) y Suero Bovino
Fetal (GIBCO™).
3.5 Equipos
Micropipetas de 0.5-10, 20-200 y 100-1000 µL; 5mL (Capp); y multicanal (Brand),
Incubadora (Memmert) a 35±2ºC, Cabina de flujo laminar (ESCO Class II BSC),
Espectrofotómetro (Avantes, Modelo: AvaSpec 2048), Lector de Microplacas (Bio-Rad),
Balanza analítica (RADWAG, Modelo: AS 220.R2) y Vortex (Heathrow Scientific, Modelo:
Vortexer).
3.6 Reactivos
Tris HCl (Life Science), Cloruro de Bario (MERCK), Ácido Sulfúrico (MERCK), Cloruro
de Sodio (PanReac/AppliChem), Glicerol (MERCK), Dimetil Sulfoxido (MERCK) y Bromuro
de 3-(4,5-dimetiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT, MERCK).
24
4. MÉTODOS
4.1 Determinación de la Actividad Antimicrobiana
Se determinó la actividad antimicrobiana en las dos cepas de E. coli O157:H7 (43888 y
AC188) mediante ensayos de Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) por técnica de
Microdilución en placa (CLSI, 2012), Concentración Mínima Bactericida (CMB) (CLSI, 1999),
Cinética de Crecimiento (Brudzynski, 2015) y Cinética de Letalidad CLSI (CLSI, 1999).
4.1.1 Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
Se define como la concentración mínima en la cual un agente antimicrobiano de actividad
desconocida inhibe el crecimiento de un microorganismo en un periodo de exposición
establecido, generalmente 24 horas como se describe en el documento M07-A9 (CLSI, 2012).
Las CMI se realizaron por técnica de microdilución en placas de 96 pozos de fondo
redondo con diluciones seriadas (1:2) en Caldo Müller-Hinton (MH) de los péptidos Ib-M 1, 2, 4,
5 y 6 (100 a 0,78 µM), Estreptomicina y Gentamicina (200 a 1,6 µM), IbM1/NpOH@Qui (25 a
1,6 µM de Ib-M1 (±360 a ±22,5 µg/mL de NpOH@Qui)), NpOH@Qui y NpOH (±360 a ±22,5
µg/mL). Posteriormente, se adicionó E. coli a una concentración final de 5x105 Unidades
Formadoras de Colonias por mililitro (UFC/mL) en cada pozo y se incubó a 35±2°C por 24
horas. La concentración requerida en la suspensión bacteriana era obtenida a partir de un
subcultivo en caldo LB con un tiempo de incubación previo al ensayo de 18-24 horas a 35±2°C;
esta era ajustada inicialmente a 1x108 UFC/mL mediante la obtención de una turbidez
equivalente a 0,5 escala de McFarland y/o una absorbancia entre 0,08 a 0,1 a una longitud de
25
onda de 625 nm por lectura espectrofotométrica, luego se realizaba una dilución de 1:200 para
obtener la concentración final utilizada en el ensayo correspondiente a 5x105 UFC/mL en cada
pozo. El volumen final de cada pozo fue de 200 µL conformado por 100µL del inóculo
bacteriano y 100 µL de las diluciones realizadas con péptidos, medicamentos de referencia o
bioconjugado. Se realizaron controles negativos adicionando a los pozos únicamente CMH y
controles de crecimiento con CMH y E. coli. La concentración de bacterias utilizada en el
experimento se verificaba realizando una dilución 1:1000 a partir de uno de los pozos de control
de crecimiento y se sembraba en AMH, 24 horas después se realizaba el conteo de colonias que
debía corresponder a un valor aproximado de 50 UFC. La inocuidad en el procedimiento se
corroboraba mediante la siembra de 100 µL del inoculo utilizado durante el ensayo en AMH, 24
horas después se verificaba que solo se presentara el crecimiento de colonias compatibles con E.
coli.
La CMI se interpretó como la concentración más baja del compuesto evaluado que inhibía
el crecimiento observable de E. coli O157:H7 en los pozos evaluados. Las lecturas eran
corroboradas mediante espectrofotometría, en la cual toda lectura de absorbancia inferior a 0,2 a
una longitud de onda de 595 nm era interpretada como inhibición del crecimiento de E. coli.
Cada concentración fue evaluada por triplicado en dos experimentos independientes.
4.1.2 Concentración Mínima Bactericida (CMB)
Se define como la concentración mínima en la cual un agente antimicrobiano de actividad
desconocida elimina el 99.9% de los microrganismos presentes en una solución durante un
tiempo establecido, generalmente 24 horas (CLSI, 1999).
26
Se realizaron subcultivos por siembra masiva en agar sangre tomando 100 µL de los pozos
evaluados en la CMI que no mostraban crecimiento visible de bacterias, estos se incubaron a
37±2ºC durante 18-24 horas. La CMB fue interpretada como la concentración del compuesto en
el cual el conteo de colonias fue igual o inferior a 10 (CLSI, 1999).
4.1.3 Cinética de Crecimiento de E. coli O157:H7
Las cinéticas se llevaron a cabo para conocer el crecimiento de E. coli en presencia de los
péptidos y el bioconjugado durante el transcurso de 24 horas. Los ensayos fueron realizados con
E. coli 43888 y se evaluó la inhibición de los compuestos en dos momentos del desarrollo del
microorganismo: I) La Fase de Latencia y II) La Fase Exponencial (Mohamed, 2014; Pletnev,
2015).
4.1.3.1 Fase de Latencia
El montaje del experimento se realizó teniendo en cuenta la metodología previamente
descrita para la CMI. En una placa de 96 pozos, E. coli 43888 en caldo MH a 5x105 UFC/mL
fueron expuestos a los péptidos Ib-M o IbM1/NpOH@Qui usando la mitad, una vez y dos veces
la CMI (CMIx0,5, CMIx1, CMIx2 respectivamente) en un volumen final de 200 µL/pozo
durante 24 horas a 37°C, la turbidez del medio fue determinada por lectura espectrofotométrica a
595 nm en los tiempos: 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 24 horas.
27
4.1.3.2 Fase Exponencial
Se llevó a cabo utilizando la metodología descrita en el párrafo anterior, con la diferencia
de que los péptidos preparados a concentraciones de CMIx0,5, CMIx1, CMIx2, CMIx4 y CMIx8
sólo fueron adicionados cuando la absorbancia en los pozos se encontraba en un rango de 0.2 -
0.3 equivalente a ̴ 1x108 - 1x109 UFC/mL (Brudzynski, 2015). Medicamentos de referencia
también fueron evaluados, así como los controles de crecimiento positivo y negativo. No se
determinó el efecto del bioconjugado en la fase exponencial de crecimiento de E. coli por
limitaciones debidas al máximo porcentaje de péptido fijado en la superficie de las
nanopartículas.
4.1.4 Cinética de Letalidad de E. coli O157:H7
A partir de este experimento se determinó el efecto en la reducción en el número de
colonias de E. coli 43888 en presencia del péptido y el bioconjugado en el transcurso de 24
horas.
En una placa de 96 pozos, E. coli (43888) a una concentración de 5x105 UFC/mL fueron
expuestos a CMIx1 y CMIx2 del péptido Ib-M1 o el bioconjugado e incubados a 37°C. Luego,
utilizando el método de recuento por goteo en placa, se realizaron subcultivos en agar sangre de
los pozos tratados y no tratados a las 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 24 horas de exposición, los
subcultivos fueron incubados a 37°C y después de 20 horas se realizó el conteo de colonias. Los
valores fueron expresados en Logaritmo base 10 (Log10) de UFC/mL. La cinética de letalidad fue
interpretada como la disminución en el número de bacterias viables en los intervalos de tiempos
evaluados, el efecto bactericida se determinó al observar una reducción del 99.9% de la
28
población bacteriana, equivalente a una disminución > 3 Log10 de UFC/mL comparado con la
concentración del inóculo inicial (CLSI, 1999).
4.2 Citotoxicidad en Células VERO
El efecto citotóxico de los péptidos se evaluó por el método colorimétrico del Bromuro-
3(4,5-dimetiltiazol-2-il)2,5-difeniltetrazolio (MTT) basado en el ensayo de Mosmann de 1983, el
cual mide la reducción del MTT a formazán mediante la actividad de la enzima succinato
deshidrogenasa mitocondrial de las células viables en el cultivo. Con base en este fundamento,
las Células VERO fueron cultivadas en placas de 96 pozos de fondo plano con medio RPMI
suplementado con Suero Bovino Fetal inactivado al 10% e incubadas a 37°C en atmósfera con
5% de CO2 hasta que alcanzaran una confluencia mayor al 90%. Luego, las células fueron
expuestas a diluciones seriadas 1:2 de los péptidos Ib-M 1, 2, 4, 5 y 6 en concentraciones de 400
µM a 0,78 µM, Estreptomicina y Gentamicina de 3200 a 1,56 µM, IbM1/NpOH@Qui de 25 a
1,6 µM de Ib-M1 (±360 a ±22,5 µg/mL de NpOH@Qui), NpOH@Qui y NpOH de ±360 a ±22,5
µg/mL durante 24 horas. Posteriormente, se adicionaba a cada pozo 20 µL/pozo de MTT a una
concentración de 5 mg/mL y se incubaba durante 4 horas más en las mismas condiciones
descritas, transcurrido el tiempo se removían de los pozos el medio de cultivo y se adicionaban
100 µL/pozo de DMSO para solubilizar los cristales de formazán, el cual se medía por las
absorbancias obtenidas en las lecturas por espectrofotometría a 595nm, para posteriormente
realizar el cálculo del porcentaje de toxicidad utilizando la siguiente formula:
29
Cada prueba realizada constaba de un Control Negativo (Medio RPMI) y un Control de
crecimiento (Células + Medio RPMI).
4.3 Análisis Estadístico
4.3.1 Actividad Antimicrobiana
Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) para comparar las CMI o las CMB obtenidas
entre los diferentes grupos evaluados; el análisis post Hoc fue realizado con el test de Sidak para
detectar diferencias entre dos grupos.
Un valor de p < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Los análisis fueron
realizados con el software GraphPad Prism 7 (©2018 GraphPad Software). Cada concentración
de los compuestos y del medicamento de referencia fue evaluada por triplicado en dos
experimentos realizados de manera independiente. Los resultados fueron expresados en término
del promedio aritmético de cada grupo ± la desviación estándar.
4.3.2 Citotoxicidad en Células VERO
La citotoxicidad de los compuestos evaluados fue expresada en términos de la
concentración citotóxica 50 (CC50), estos fueron calculados por análisis de regresión sigmoidea a
partir de los porcentajes de toxicidad que cada compuesto ejerció sobre las células VERO. Los
cálculos fueron realizados con el complemento XLFit (©2019 IDBS) para el software Excel
(©Microsoft 2019).
30
Posteriormente se calculó el Índice de Selectividad (IS) utilizando la siguiente formula
según describe Bagla en 2014:
Donde:
CC50: Concentración Citotóxica 50
CMI: Concentración Mínima Inhibitoria del compuesto
Los IS se calcularon con las CMI obtenidas en 43888 y AC188. Para el cálculo del IS de
aquellos compuestos cuya CC50 no pudo ser determinada se usó la máxima concentración
evaluada.
31
5. RESULTADOS
5.1 Actividad de Péptidos Ib-M contra E. coli O157:H7
5.1.1 Concentración Mínima Inhibitoria
Las CMI de la familia de péptidos Ib-M contra E. coli O157:H7 fueron obtenidas en un
rango de 4,7 a 12,5 µM y 1,6 a 6,3 µM para 43888 y AC188 respectivamente. En ambas cepas se
observó que Ib-M1/Ib-M2 e Ib-M4 fueron los péptidos que presentaron mejor y menor actividad
inhibitoria respectivamente (Tabla 5).
En E. coli 43888, Ib-M1 e Ib-M2 presentaron una CMI de 4,7±1,7 µM, y mostraron un
mejor efecto inhibitorio que Ib-M4 e Ib-M6 (p<0,0001 y p=0,0208 respectivamente) Ib-M5 no
mostró diferencias en su actividad respecto a los demás péptidos de la familia Ib-M. En relación
a los antibióticos de referencia, Gentamicina presentó mejor actividad que los péptidos Ib-M 4, 5
y 6 (p<0,05). Ib-M 1 y 2 tuvieron un comportamiento similar con Gentamicina y un mejor
desempeño que Estreptomicina (p<0,018).
En E. coli AC188, Ib-M1 con una CMI de 1,6±0,01 µM presentó mejor actividad que los
otros péptidos (p<0,05), excepto con Ib-M2 que mostró una CMI de 3,6±1,3 µM (p=0,089).
Estreptomicina requirió una concentración de 66,7 ± 25,8 µM para inhibir el crecimiento de E.
coli AC188, esta concentración fue 7 veces mayor a la utilizada con E. coli 43888 (9,4 ± 3,4
µM). El comportamiento inhibitorio de Gentamicina en E. coli AC188 fue similar al observado
en E. coli 43888.
32
5.1.2 Concentración Mínima Bactericida
Las CMB fueron obtenidas en un rango de 6,3 a 22,9 µM y 3,7 a 15,6 µM para las cepas
43888 y AC188 respectivamente, el efecto bactericida de los péptidos quedó demostrado al
observar que las CMB no superaron en más de cuatro veces las CMI. Los valores de las CMB
determinadas para todos los péptidos fueron similares tanto en E. coli 43888 como en AC188,
solo Ib-M4 requirió mayores concentraciones que Ib-M1, 2 y 6 para eliminar a E. coli (Tabla 5).
La actividad de Gentamicina en ambas cepas fue similar para todos los péptidos evaluados,
excepto en Ib-M4 e Ib-M5 con la cepa 43888. Por otro lado, la estreptomicina obtuvo una CMB
de 108,3±49,2 µM contra E. coli AC188, esta concentración fue 9 veces mayor que la utilizada
contra E. coli 43888 (11,5±2,6 µM).
Tabla 5. Actividad Antimicrobiana de péptidos Ib-M
Compuestos
Escherichia coli O157:H7
43888 AC188
CMI CMB CMI CMB
(µM ± D.E) (µM ± D.E)
Ib-M1 4,7 ± 1,7 6,3 ± 0,0 1,6 ± 0,01 3,7 ± 1,3
Ib-M2 4,7 ± 1,7 6,3 ± 3,4 3,6 ± 1,3 4,2 ± 1,6
Ib-M4 12,5 ± 0,0 22,9 ± 5,1 6,3 ± 0,0 15,6 ± 10,3
Ib-M5 8,3 ± 3,2 15,6 ± 7,7 4,7 ± 1,7 7,3 ± 2,6
Ib-M6 9,4 ± 3,4 11,5 ± 7,3 4,7 ± 1,7 10,4 ± 3,2
Estreptomicina 9,4 ± 3,4 11,5 ± 2,6 66,7 ± 25,8 108,3 ± 49,2
Gentamicina 1,8 ± 0,6 4,7 ± 1,7 2,3 ± 0,9 4,2 ± 1,6
33
Cada concentración fue evaluada por triplicado en dos experimentos realizados de manera independiente. Los
resultados son expresados en término del promedio aritmético de cada grupo ± desviación estándar. CMI:
Concentración Mínima Inhibitoria, CMB: Concentración Mínima Bactericida, µM: Micromolar, D.E: Desviación
estándar.
5.1.3 Cinética de Crecimiento de E. coli O157:H7 en presencia de péptidos Ib-M
5.1.4 Fase de Latencia
Se observó una inhibición del crecimiento durante las primeras 12 horas de exposición de
E. coli a las concentraciones evaluadas (CMIx2, CMIx1 y CMIx0,5). Luego, a las 24 horas, el
efecto inhibitorio se mantuvo en los pozos tratados con las CMIx2 y CMIx1; mientras que, en los
pozos tratados con CMIx0,5 se observó que solo el péptido Ib-M1 y los antibióticos mantenían la
inhibición del crecimiento de E. coli. (Figura 3).
34
0 2 4 6 8 10 12 240,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,9
1,0
0 2 4 6 8 10 12 240,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,9
1,0
0 2 4 6 8 10 12 240,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,9
1,0
Ab
so
rban
cia
(5
95 n
m)
Tiempo (Horas)
Control
Estrep (4,7 µM)
Gent (0,9 µM)
Ib-M1 (2,4 µM)
Ib-M2 (2,4 µM)
Ib-M4 (6,3 µM)
Ib-M5 (4,2 µM)
Ib-M6 (4,7 µM)
CMIx0.5
Control
Estrep (9,4 µM)
Gent (1,8 µM)
Ib-M1 (4,7 µM)
Ib-M2 (4,7 µM)
Ib-M4 (12,5 µM)
Ib-M5 (8,3 µM)
Ib-M6 (9,4 µM)
Ab
so
rban
cia
(5
95 n
m)
Tiempo (Horas)
CMIx1
Ab
so
rban
cia
(5
95 n
m)
Tiempo (Horas)
Control
Estrep (18,8 µM)
Gent (3,6 µM)
Ib-M1 (9,4 µM)
Ib-M2 (9,4 µM)
Ib-M4 (25 µM)
Ib-M5 (16,6 µM)
Ib-M6 (18,8 µM)
CMIx2
Figura 3. Cinética de Crecimiento de E. coli O157:H7 (43888) en presencia de péptidos Ib-M. Fase de latencia.
Cada concentración fue evaluada por cuadruplicado, los resultados son expresados en término del promedio
aritmético ± desviación estándar. Los datos mostrados corresponden a un experimento representativo de dos
realizados de manera independiente. Control: Medio + E. coli
5.1.5 Fase Exponencial
Péptidos Ib-M1 y 2 a CMIx8 mostraron un efecto inhibitorio contra E. coli en las primeras
8 horas de exposición; 24 horas después, se obtuvieron en los pozos tratados absorbancias de 0,5
a 0,6, estos valores son equivalentes a una inhibición en el crecimiento de E. coli entre un 44 a
un 36%. Bacterias expuestas a CMIx4 solo fueron inhibidas durante las primeras 6 horas de
35
exposición al péptido. Pozos tratados con CMIx2 y CMIx1 no mostraron diferencias con el
control de crecimiento bacteriano. Respecto a los antibióticos se pudo observar inhibición en el
crecimiento de E. coli durante las 24 horas de exposición a todas las concentraciones evaluadas
(Figura 4).
Los pozos tratados con péptidos Ib-M 4, 5 y 6 a CMIx0,5, CMIx1 y CMIx2 presentaron un
comportamiento similar al grupo de control de crecimiento (datos no mostrados),
concentraciones superiores no fueron evaluadas debido a que la turbidez generada por los
péptidos en el medio de cultivo causaba interferencia con la lectura espectrofotométrica.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 240,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 240,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 240,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 240,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Absorb
ancia
(595 n
m)
Tiempo (Horas)
Control
Estrep (9,4 µM)
Gent (1,8 µM)
Ib-M1 (4,7 µM)
Ib-M2 (4,7 µM)
CMIx1
Control
Estrep (18,8 µM)
Gent (3,6 µM)
Ib-M1 (9,4 µM)
Ib-M2 (9,4 µM)
Absorb
ancia
(595 n
m)
Tiempo (Horas)
CMIx2
Absorb
ancia
(595 n
m)
Tiempo (Horas)
Control
Estrep (37,6 µM)
Gent (7,2 µM)
Ib-M1 (18,8 µM)
Ib-M2 (18,8 µM)
CMIx4
Absorb
ancia
(595 n
m)
Tiempo (Horas)
Control
Estrep (75,2 µM)
Gent (14,4 µM)
Ib-M1 (37,6 µM)
Ib-M2 (37,6 µM)
CMIx8
36
Figura 4. Cinética de Crecimiento de E. coli O157:H7 (43888) en presencia de péptidos Ib-M 1 y 2. Fase
Exponencial. Cada concentración fue evaluada por cuadruplicado, los resultados son expresados en término del
promedio aritmético ± desviación estándar. Los datos mostrados corresponden a un experimento representativo de
dos realizados de manera independiente. Control: Medio + E. coli
5.1.6 Cinética de Letalidad
La cinética de letalidad sólo fue determinada con el péptido Ib-M1, dicha selección fue realizada
a partir de los resultados obtenidos en la CMI con la cepa de referencia y el aislado clínico. En
este experimento, luego de 6 horas de exposición a Ib-M1 a CMIx2 se observó una reducción en
el número de colonias de E. coli equivalente al 99.9% (>3 Log10 de UFC/mL), mientras que a
una CMIx1 este evento solo fue observado a las 24 horas de exposición al péptido (Figura 5)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 12 24
0
2
4
6
8
10
12
5060
Log
10 (U
FC
/mL
)
Tiempo (Horas)
Control
CMI x1 (4,7 µM)
CMI x2 (9,4 µM)
37
Figura 5. Cinética de Letalidad de Ib-M1 contra E. coli O157:H7 (43888). Cada concentración fue evaluada por
cuadruplicado, los resultados son expresados en término del promedio aritmético ± desviación estándar. Los datos
que no muestran barras de error corresponden a que son muy pequeños para ser evidenciados en la gráfica. Control:
Medio + E. coli, CMIx1: Ib-M1 a 4,7 µM, CMIx2: Ib-M1 a 9,4 µM
5.2 Actividad de Bioconjugado IbM1/NpOH@Qui contra E. coli O157:H7
5.2.1 Concentración Mínima Inhibitoria y Concentración mínima Bactericida
El bioconjugado mostró un efecto inhibitorio contra E. coli a una concentración de 12,5
µM IbM1 (178,6 µg/mL NpOH@Qui); dicho valor fue 2,7 veces mayor a la CMI del péptido Ib-
M1 libre (4,7 µM). Las NpOH@Qui y las NpOH no presentaron inhibición del crecimiento
bacteriano en ninguna de las concentraciones evaluadas. No se obtuvo CMB a la máxima
concentración evaluada del bioconjugado (25 µM Ib-M1 (357,2 µg/mL NpOH@Qui).
Concentraciones superiores no fueron determinadas debido a que la máxima concentración de
péptido fijado en la superficie de la nanopartícula oscilaba entre 40 a 60 µM.
5.2.2 Cinética de Crecimiento de E. coli O157:H7 en presencia del Bioconjugado
IbM1/NpOH@Qui
Las gráficas muestran inhibición del crecimiento de E. coli a la CMIx2 y la CMIx1 durante
las 24 horas de exposición al bioconjugado. La CMIx0,5 mostro inhibición del crecimiento de E.
coli hasta las primeras 12 horas de exposición, presentando perdida de actividad transcurridas 24
horas. Para todas las concentraciones evaluadas la actividad fue atribuible al bioconjugado dado
que los controles del bioconjugado tuvieron crecimientos muy similares al control de crecimiento
(Figura 6)
38
0 2 4 6 8 10 12 240,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
0 2 4 6 8 10 12 240,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
0 2 4 6 8 10 12 240,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Ab
so
rban
cia
(59
5 n
m)
Tiempo (Horas)
Control
IbM1/NpOH@Qui (6,25 µM)
NpOH@Qui (89,3 µg/mL)
NpOH (89,3 µg/mL)
CMI x2A
bso
rban
cia
(59
5 n
m)
Tiempo (Horas)
Control
IbM1/NpOH@Qui (12,5 µM)
NpOH@Qui (178,6 µg/mL)
NpOH (178,6 µg/mL)
CMI x1
Ab
sorb
an
cia
(595 n
m)
Tiempo (Horas)
Control
IbM1/NpOH@Qui (25 µM)
NpOH@Qui (357,2 µg/mL)
NpOH (357,2 µg/mL)
CMI x0,5
Figura 6. Cinética de Crecimiento de E. coli O157:H7 (43888) en presencia del bioconjugado
IbM1/NpOH@Qui. Fase de latencia. Cada concentración fue evaluada por cuadruplicado, los resultados son
expresados en término del promedio aritmético ± desviación estándar. Los datos mostrados corresponden a un
experimento representativo de dos realizados de manera independiente. Control: Medio + E. coli, NpOH@Qui:
NpOH recubiertas con Quitosano, NpOH: Nanopartículas de Óxido de Hierro
39
5.2.3 Cinética de Letalidad
Las primeras 12 horas de exposición de E. coli al bioconjugado a una CMIx1 y CMIx2
causaron una disminución en el número de colonias del 54,8% y 98.9% respectivamente. Luego,
a las 24 horas, el grupo tratado con una CMIx1 mostró un incremento en el número de colonias
>4 Log10 de UFC/mL. Mientras que, en el grupo de bacterias tratadas con la CMIx2 se redujo la
población en un 99.9% (>3 Log10 de UFC/mL) (Figura 7)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 24
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
55
60
Log
10 (U
FC
/mL)
Tiempo (Horas)
Control
CMI x1 (12,5 µM)
CMI x2 (25 µM)
Figura 7. Cinética de Letalidad de IbM1/NpOH@Qui contra E. coli O157:H7 (43888). Cada concentración
fue evaluada por cuadruplicado, los resultados son expresados en término del promedio aritmético ± desviación
estándar. Los datos que no muestran barras de error corresponden a que son muy pequeños para ser evidenciados en
la gráfica. Control: Medio + E. coli, CMIx1: IbM1/NpOH@Qui a 12,5 µM, CMIx2: IbM1/NpOH@Qui a 25 µM
40
5.3 Citotoxicidad en células VERO
5.3.1 Péptidos Ib-M
Células VERO en presencia de péptidos Ib-M mostraron CC50 en un rango de 310,9 a >400
µM; la menor toxicidad fue observada en células tratadas con Ib-M4 (>400±0,0 µM) e Ib-M1
(395,2±18,3 µM) y la mayor toxicidad fue determinada con Ib-M2 (197,5±18,3 µM). En los
antibióticos de referencia las CC50 fueron >3200 µM.
Tabla 6. Citotoxicidad en Células VERO e IS de péptidos Ib-M.
Compuestos
CC50
(µM ± D.E)
IS
Células VERO 43888 AC188
Ib-M1 395,2 ± 18,3 84,1 247
Ib-M2 197,5 ± 2,4 42 54,9
Ib-M4 >400 ± 0 >32 >63,5
Ib-M5 315,3 ± 49,1 38 67,1
Ib-M6 310,9 ± 4,4 33,1 66,1
Estreptomicina >3200 ± 0 >340,4 >48
Gentamicina >3200 ± 0 >1777,8 >1391,3
Cada concentración fue evaluada por cuadruplicado en dos experimentos realizados de manera
independiente. Los resultados son expresados en término del promedio aritmético de cada grupo ± desviación
estándar o el valor absoluto de un cálculo. Los datos mostrados corresponden a un experimento representativo.
CMI: Concentración Mínima Inhibitoria, CC50: Concentración Citotóxica 50, µM: Micromolar, D.E: Desviación
estándar.
41
5.3.2 Bioconjugado IbM1/NpOH@Qui
No se obtuvo la CC50 del Bioconjugado en células VERO a la máxima concentración
evaluada; sin embargo, los porcentajes de citotoxicidad fueron determinados y como se puede
observar en la figura 8, el bioconjugado a 25 µM Ib-M1 (357,2 µg/mL NpOH@Qui), muestra un
porcentaje de citotoxidad del 43,6%, esto puede ser atribuible a las NpOH, que en una
concentración de 357,2 µg/mL causa una toxicidad celular del 46,5%, el cual es similar a la
observada en el Bioconjugado.
1,6/22,7 3,1/45,4 12,5/181,7 25/363,4
0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
33
36
39
42
45
48
51
Cito
toxic
ida
d (
%)
Concentración (µM / µg/mL)
IbM1/NpOH@Qui
NpOH@Qui
NpOH
Figura 8. Citotoxicidad del bioconjugado IbM1/NpOH@Qui y sus componentes. Cada concentración fue
evaluada por cuadruplicado, los resultados son expresados en término del promedio aritmético ± desviación
42
estándar. Los datos mostrados corresponden a un experimento representativo de dos realizados de manera
independiente. NpOH@Qui: NpOH recubiertas con Quitosano, NpOH: Nanopartículas de Óxido de Hierro
5.4 Índices de selectividad
5.4.1 Péptidos Ib-M
Ib-M 1 mostró el mejor índice de selectividad entre los péptidos evaluados, en E. coli
43888 obtuvo un IS de 84,1 y con E. coli AC188 su IS fue de 247. Ib-M4, 5 y 6 obtuvieron
valores de IS en un rango de 32 a 42 en E. coli 43888, y un rango de 54,9 a 67,1 en E. coli
AC188 (Tabla 7).
Los IS en Gentamicina fueron hasta 55 veces más altos que los obtenidos con los péptidos
Ib-M, esto debido a la baja toxicidad presentada en células VERO y las CMI obtenidas en ambas
cepas (Tabla 6 y 7). Estreptomicina mostró un buen IS con E. coli 43888, y disminuyó con E.
coli AC188 debido principalmente al incremento en la CMI (Tabla 6 y 7)
5.4.2 Bioconjugado
Un IS de 2 fue obtenido con IbM1/NpOH@Qui, la reducción en la selectividad estuvo
asociada principalmente a la toxicidad causada por las NpOH en células VERO.
43
6. DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos en este trabajo demostraron la actividad in vitro de los péptidos
Ib-M y del bioconjugado IbM1/NpOH@Qui en el modelo patógeno E. coli O157:H7 y en células
VERO. Los péptidos libres no sólo demostraron poseer actividad tanto inhibitoria como
bactericida, también sobresalieron por mantener su potencial al ser evaluados contra un aislado
clínico de la misma cepa modelo. En relación con la citotoxicidad se pudo evidenciar la
compatibilidad de la mayoría de los miembros de esta familia con las células VERO, lo cual
permitió la determinación de los IS entre los cuales se destacó el de Ib-M1. El bioconjugado
IbM1/NpOH@Qui mostró actividad inhibitoria a una concentración mayor a la del péptido libre.
En la primera fase del estudio, se evaluó la actividad de los péptidos libres en una cepa de
referencia y en un aislado clínico de E. coli O157:H7, los primeros resultados mostraron la
inhibición del crecimiento del microorganismo por parte de todos los péptidos y se resaltó el
desempeño obtenido por Ib-M1 e Ib-M2. Las diferencias en los resultados obtenidos fueron
observados al compararlos con el trabajo reportado previamente por Flórez (2014), en el cual
evaluó la actividad inhibitoria de los péptidos en la cepa no patógena de E. coli K12, sus
resultados mostraron que Ib-M6 fue el péptido con mejor desempeño con una CI50 de 1 µM; las
diferencias observadas entre E. coli K12 y O157:H7 podrían obedecer a las variaciones
fisiológicas que puede presentar cada cepa como resultado de los diversos genes que expresan
durante su crecimiento, un ejemplo de esto es reportado por Fink en 2011, quien documenta
diferencias en la expresión génica entre E. coli O157:H7 y K-12, hasta un 10,1% y un 8,7%
respectivamente durante la interacción, supervivencia y adhesión a hojas de lechuga.
44
La actividad de los péptidos IbM contra E. coli ha sido principalmente asociada con el
incremento de su carga positiva mediante la inserción de residuos de arginina, así como la
modificación de su hidrofobicidad con la inserción de residuos de triptófano (Flórez, 2014). Los
Péptidos Ib-M presentan un número considerable de argininas en su secuencia, diversos autores
han relacionado la presencia de múltiples residuos de este aminoácido con incrementos en la
actividad antibacteriana de los péptidos, ya sea por el aumento de la carga neta que está
relacionado con la reactividad de los péptidos a los envoltorios microbianos (Chan, 2006; Arias,
2018) o por el incremento en la permeabilidad sobre las membranas que facilita su acción sobre
dianas internas (Schmidt, 2010, Futaki, 2013). Ib-M1 e Ib-M2 difieren de los demás péptidos Ib-
M por las sustituciones de sus residuos de arginina y cisteína por triptófano y arginina realizadas
en las posiciones 18 y 20 respectivamente. Arias en 2014 demostró que las sustituciones de un
mismo aminoácido en diferentes posiciones de una secuencia pueden repercutir en el efecto
antimicrobiano de un péptido, en nuestro caso, las sustituciones de arginina en las posiciones 9,
10 y 20 podrían estar influenciando las diferencias encontradas.
Los hallazgos obtenidos en la CMB proporcionaron información adicional sobre el
potencial de acción in vitro de los péptidos evaluados, ésta prueba permite determinar 2 aspectos
importantes de una molécula: i) el tipo de efecto que posee, bactericida o bacteriostático, y ii) el
efecto atribuible a los componentes en el caso de moléculas compuestas (Pankey, 2004). En este
estudio, los resultados obtenidos en la CMB permiten concluir que todos los péptidos de la
familia Ib-M mostraron un efecto bactericida al obtener valores de las CMB que no superaron en
más de dos diluciones los valores obtenidos en la CMI (CLSI, 1999; Lee, 2017).
45
La respuesta de E. coli a los péptidos Ib-M fue diferente dependiendo de la fase de
crecimiento en la que fue expuesta: en fase de latencia la población bacteriana fue inhibida desde
las 0 hasta las 24 horas a CMIx1 y CMIx2; en la fase exponencial, sólo se obtuvo la inhibición
del crecimiento a CMIx4 y CMIx8 en los péptidos Ib-M1 e Ib-M2 durante las primeras 6 y 8
horas de exposición respectivamente. Los procesos metabólicos son diferentes en cada fase de
crecimiento y evidentemente esto pudo influenciar la respuesta hacia los péptidos Ib-M, la fase
de latencia ha sido relacionada con cambios adaptativos al medio de crecimiento del
microorganismo y a la realización de preparativos necesarios para iniciar su duplicación
(Pletnev, 2015), mientras que, la fase logarítmica, se encuentra metabólicamente más activa dada
la constante expresión de genes relacionados con la duplicación. Lo observado en la fase
logarítmica, podría sugerir un efecto dependiente de la concentración según lo descrito por
Mohamed en 2014 o Brudzynski en 2015.
En la cinética de letalidad, la población bacteriana fue inhibida en más del 95% entre las 2
y las 4 horas de exposición a la CMI de Ib-M1, teniendo en cuenta el tiempo que utilizó el
péptido en reducir el número de colonias de E. coli, se podría pensar que el efecto bactericida
ejercido sería de tipo no lítico y dependiente de la concentración (CLSI, 1999; Mohamed, 2014;
Brudzynski, 2015); está demostrado que otros PAM tienen actividad contra E. coli mediante la
afectación de dianas internas como mecanismo de acción (Moravej, 2018), un ejemplo de ellos
es la BUFORINA II, este péptido ejerce su efecto antimicrobiano mediante su unión al ADN y
ARN bacteriano sin causar ningún tipo de lisis sobre E. coli, como lo demostrado por Park en
1998, quien evaluó concentraciones 5 veces superiores a la CMI sin causar lisis en el
microorganismo. Por el contrario, péptidos como la Magainina II, han sido asociados con
mecanismos de acción lítico sobre E. coli, al causar la ruptura de la membrana celular desde los
46
primeros minutos de exposición (Matsuzaki, 1997). Si bien los resultados obtenidos en la
cinética de letalidad pueden estar asociados al mecanismo de acción del péptido Ib-M1, estudios
adicionales deben ser realizados para dilucidar los mecanismos de acción asociados a la familia
de péptidos Ib-M.
La actividad antimicrobiana de la familia Ib-M fue comparada con la Estreptomicina y la
Gentamicina, en uno de los resultados obtenidos se observó que estreptomicina requirió una
concentración 7 veces mayor a la utilizada en E. coli 43888 para lograr el mismo efecto
inhibitorio obtenido en E. coli AC188; esto se asocia con reportes previos que han mostrado la
resistencia de diversos aislados clínicos a estreptomicina y otros aminoglucósidos (Vila J, 2016;
Mir, 2018) y constituyen un reflejo de la problemática que existe respecto al desarrollo de
resistencia a antibióticos como producto del uso indiscriminado de los mismos en la actualidad.
A diferencia de lo observado con estreptomicina, los péptidos Ib-M mantuvieron CMI similares
en ambas cepas de E. coli O157:H7; al respecto, se ha referenciado que una de las características
que hace a los PAM las moléculas más apropiadas para reemplazar a los antibióticos es la
dificultad que tienen los microorganismos para desarrollar resistencia (Pereira, 2006).
Una de las características de los PAM es que estos tienen mayor afinidad por las
membranas de los microorganismos dada su carga negativa (Wang, 2009), esta característica se
ve reflejada en la baja citotoxicidad presentada por los péptidos libres y la cual se puede
relacionar con los bajos porcentajes de hemolisis documentados por Flórez en 2014, se puede
visualizar con los índices de selectividad.
47
En la segunda fase del trabajo se seleccionó a IbM1 como el péptido para ser inmovilizado
con las NpOH@Qui, este mostró un buen efecto inhibitorio en las dos cepas, baja toxicidad en
células VERO y los mejores índices de selectividad. Posterior a la selección del péptido, se
demostró que el bioconjugado IbM1/NpOH@Qui fue activo contra E. coli O157:H7, el cual
mostró menor actividad que el péptido libre (12,5 Vs 4,7 µM); este aumento en la concentración
requerida para ejercer actividad no era esperado dado que de acuerdo a diversos autores la
bioconjugación de moléculas generalmente mejora el desempeño de las biomoléculas fijadas en
la superficie de estas (Huber, 2005; Assa, 2016). Este patrón no sólo se vio en el efecto
inhibitorio sino también en el bactericida, el cual no pudo ser determinado.
El efecto inhibitorio del bioconjugado fue atribuible sólo al péptido antimicrobiano, ya que
las concentraciones evaluadas de NpOH y NpOH@Qui no mostraron un poder inhibitorio sobre
la bacteria. Al respecto, existen múltiples reportes relacionados con el efecto microbicida de las
NpOH en un amplio rango de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (Arakha M, 2015;
Nehra, 2017) sin embargo, los efectos de las NpOH no sólo están asociadas a su concentración
sino a múltiples factores como las propiedades físico-químicas y sus interacciones con el
organismo de estudio (Huber, 2005). Por otro lado, el efecto microbiano del quitosano suele
presentarse cuando el porcentaje utilizado es mayor al 25%; en nuestro caso, el porcentaje
utilizado en la preparación del bioconjugado fue del 0,5% (Arakha M, 2015).
Los gráficos obtenidos de las cinéticas de crecimiento de E. coli en presencia del
bioconjugado IbM/NpOH@Qui muestran un patrón similar al de la actividad del péptido libre,
con las curvas de los controles de actividad con crecimiento similar al control y la curva del
bioconjugado con valores próximos a cero. Con respecto a las curvas de la cinética de letalidad,
48
en estas podemos corroborar la disminución de actividad del bioconjugado dado que en las 2
concentraciones evaluadas se evidencia una prolongación en el tiempo que la molécula requiere
para ejercer su efecto, el cual no alcanza la eliminación completa del microorganismo para los
dos casos, siendo congruente con los resultados antes mencionados.
En relación al efecto citotóxico del bioconjugado, está directamente relacionada con la
presencia de las NpOH que lo componen y muy probablemente esta mediado por la producción
de especies reactivas de oxígeno (Gao, 2007). Saranya en 2017 demuestra los efectos de las
NpOH sobre las células vero las cuales se vieron afectadas a altas concentraciones de NpOH
(10000-50000 µg/mL), en contraste, las NpOH usadas en este estudio mostraron tener un efecto
citotóxico a concentraciones considerablemente bajas a comparación de Saranya, situación
similar a la descrita por Szalay en 2012, quien documentó niveles de citotoxicidad en
concentraciones entre los 78,1 a los 10000 µg/mL. Ésta misma autora atribuyó el efecto
citotóxico de las NpOH a la producción de radicales libres en el transcurso del tiempo de la
misma forma que lo propuso Gao.
49
7. CONCLUSIONES
Los péptidos Ib-M libres mostraron actividad contra E. coli O157:H7, se destaca su
capacidad antibacteriana tanto en la cepa de referencia 43888 como el aislado clínico AC188,
siendo Ib-M1 e Ib-M2 los péptidos que mostraron un mejor efecto inhibitorio.
Toda la familia de péptidos Ib-M mostró bajos niveles de citotoxicidad, que también se
reflejan en los IS obtenidos.
El bioconjugado IbM1/NpOH@Qui produjo un efecto inhibitorio sobre E. coli O157:H7;
sin embargo, el IS se redujo en comparación al péptido libre debido a la toxicidad celular
ejercida por las NpOH a concentraciones de 363,4 µg/mL.
El Bioconjugado IbM1/NpOH@Qui se considera un nanotransportador promisorio, al que
una vez incrementado el porcentaje de péptido fijado en su superficie mejorará su actividad
antimicrobiana y disminuirá su toxicidad para así poder ser llevado a ensayos de
experimentación in vivo.
50
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