Técnicas moleculares para el diagnóstico diferencial de patógenos en organismos

acuáticos

Laboratorio de Referencia Análisis y Diagnóstico en Sanidad Acuícola

(LARADSA)

LARADSA

3

Muestreo aleatorio: Cuando una población es muestreada para determinar su estado de salud/enfermedad y/o prevalencia de un patógeno específico, el número de organismos muestreados está determinado por la prevalencia esperada del patógeno específico tomando en consideración los grados de confianza de una confidencia estadística.

FORMULA SEGUN CANNON Y ROE (2001)

Se

SeDNn

D ))()()(( / 12

111 1 ----@

a

4

Tamaño

de la

población

2%

5%

10%

20%

30%

40%

50%

50 50 35 20 10 7 5 2

100 75 45 23 11 9 7 6

250 110 50 25 11 9 8 7

500 130 55 26 11 9 8 7

1,000 150 55 27 11 9 9 8

1,500 140 55 27 11 9 9 8

2,000 145 60 27 11 9 9 8

4,000 145 60 27 11 9 9 8

10,000 145 60 27 11 9 9 8

>100,000 150 60 30 11 9 9 8

TAMAÑO DE LA POBLACION 4,000

NIVEL DE CONFIANZA 95%

SENSIBILIDAD 95%

PREVALENCIA ESPERADA 2%

TAMAÑO DE MUESTRA (n) 153

5

Muestreo no aleatorio.

En cualesquier otro evento, seleccionar 10 organismos vivos, que exhiban las señales clínicas típicas de la enfermedad en cuestión.

6

Consideraciones de Muestreo

Toma de muestra: Tomar la muestra al amanecer o atardecer Seleccionar organismos de diferentes puntos del

estanque (compuerta de entrada, salida y medio). Fijación de muestra: Agregar cantidad suficiente de

solución fijadora especialmente en el hepatopancreas para evitar el hidrolizado de los órganos y/o tejidos aledaños.

No realizar corte longitudinal ventral

Envío de muestras

7

Histología Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

TECNICAS DE DIAGNOSTICO

PCR

Hibridación

Histología

Cultivos Bacterianos

Actividades Enzimáticas

Hemaglutinación Y Técnicas

Relacionadas

Técnicas con Anticuerpos

RT-PCR

Anticuerpos

Que Genero bacteriano es: Vibrio, Pseudomonas, Aeromonas, etc.

Que Especie de bacteria es: Vibrio algilolyticus, Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus, etc.

Que variedad Vibrio es: Vibrio cholerae

tipo I, Vibrio cholerae tipo II, etc.

Técnicas con anticuerpos

Método rápido de diagnóstico WSSV

Hibridación

1

DNA

Dr. Kary Mullis

1983

Problema Polimerasa

1986

Thermophilus aquaticus

1993

Premio Nobel

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

DNA pol

Transcriptasa

reversa

1. Pool camarones normales 1-9

2. Pool camarones normales 10-19

3. Pool camarones normales 20-29

4. Pool camarones normales 30-39

5. Pool camarones normales 40-49

6. Pool 9 camarones normales + 1 positivo

7. Pool 19 camarones normales + 1 positivo

8. Pool 29 camarones normales + 1 positivo

9. Pool 39 camarones normales + 1 positivo

10. Pool 49 camarones normales + 1 positivo

11. Control positivo kit diagxotics

12. Camarón inoculado wssv

Nota. Todos los camarones se sangraron por separado con 200µl

de anticoagulante + 100 de hemolinfa. De el total solo se tomaron

20 µl de hemolinfa de cada uno de los camarones sagrados.

100 pb

200 pb

multiplex

Ag

ua

ctx

hly

A

01

Marc

ad

or

de P

M

deg.

70 75 80 85 90 95

dF

/dT

0.2

0.15

0.1

0.05

0

Cycle

5 10 15 20 25

Norm

. F

luoro

.

0.35

0.3

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0

Vibrio cholerae 01, todos los primers

01

cxtA

hlyA

01

cxtA

hlyA

PCR en tiempo real

1

2

3

4

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)

Temperatura 60°C Tiempo 1 hora Primers 3 pares

25

Toma de muestra:

Consideraciones de Muestreo

Selección del tejido

26

, ,

, , , , ,

, ,

, ,

, , , , , , ,

, , ,

, , ,

Lab 1

, ,

, , ,

Lab 2

Positivo Negativo

27

Microarreglos

Fred Sanger

Secuenciación de ADN (1975)

preventivo

correctivo

dirigido no dirigido

Tipos de diagnostico

•Calidad de agua

•Cuentas de bacterias

•Presencia de virus en agua

•Calidad de agua •Cuentas de bacterias •Bacterias en organismos •Parásitos •Virus

Jorge Hernández López

Arturo Sánchez Paz

Daniel Eduardo Coronado Molina

Fernando Mendoza Cano

Trinidad Encinas García

Nancy Janeth Sau Acosta

Rosa Isela Vázquez Sánchez

jhlopez04@cibnor.mx

www.cibnor.mx