Transcript of Técnicas de Aislamiento y Purificación de Cultivos Bacterianos.
Prof. Encargado. Presentado por:
Asistente técnico C.I: 22-998-942
resto que le acompañan.
Agar XLD: agar más nutrientes, usado para cultivar microorganismos
o pequeñas
plantas como la briofita Physcomitrella patens.
Cultivos puros: contienen un solo tipo de microorganismo, obtenidas
de colonias
aisladas por resiembras (pase de un medio de cultivo a otro).
Pipeta: instrumento de laboratorio que se utiliza para medir o
transvasar
pequeñas cantidades de líquido. (Suelen ser de vidrio).
Placa de Petri: recipiente redondo de cristal o plástico con
una cubierta de la
misma forma pero algo más grande de diámetro, para poder cerrar el
recipiente.
Siembra para aislamiento: se utiliza parar obtener cultivos
puros en placas de
petri, que contienen medios de cultivos sólidos.
Siembra para inoculación: consiste en tomar una pequeña porción de
la muestra
y diluirla para dispersarla y que crezca con más facilidad en el
medio de cultivo
(líquido o solido).
GENERAL:
Aislar Bacterias puras del tracto bucal, utilizando caldos y
agar lactobacilos.
Aislar Bacterias puras de aguas residuales, utilizando
caldos y agar lauril
sulfato.
selenito cistina y agar XLD.
Determinar el número más probable de bacterias residuales a
partir de los
tubos múltiples.
experiencias anteriores, utilizando agar inclinado TSI (hierro tres
azucares).
MATERIALES Y MÉTODOS
Practica 1.- Aislamiento de bacterias puras del tracto bucal,
utilizando caldos y
agar lactobacilo.
Se realizó un cepillado bucal y se introdujo el cepillo en una
suspensión de
buffer fosfato salino, agitando por aproximadamente de 2 a 4
minutos inoculando
un mililitro, usando una pipeta de 2 ml en medios de cultivo con
caldo lactobacilo y
se encubó a 37ºC por 24 horas.
Posteriormente, se realizó un estriado en placas de Petri con agar
lactobacilo y
encubados a 37 °C por 24 horas, luego de ello se seleccionaron tres
colonias las
cuales fueron sembradas con un aza metálica estéril en tubos de
ensayos con
caldo lactobacilos e encubados a 37 °C por 24 horas, este
procedimiento se
realizó varias veces hasta obtener colonias puras.
Finalmente estos fueron sembrados por punción y estriado utilizando
una aguja
metálica estéril en tubos de ensayo con agar inclinado TSI (hierro
tres fosfato) e
encubado a 37° C. Identificando bioquímicamente las colonias
sembradas y
comparadas con la bibliografía correspondiente (Ver figura
1).
.
Figura 1.- Procedimiento de aislamiento de bacterias puras a partir
de muestras
bucales.
Aza metaliza estéril se
Pruebas Bio uímicas con a ar inclinado TSI
Agar lactobacilos
Agar lactobacilos
Caldo lactobacilos
Caldo lactobacilos
Practica 2.- Aislamiento de bacterias puras de aguas tratadas,
utilizando caldos y
agar lauril sulfato.
A partir de muestras de aguas tratadas se extrajo un
mililitro con una propipeta,
y se añadió en 50 ml de caldo lauril sulfato, contenidos en una
fiola, esta se
encubo a 37 °C por 24 horas. Pasado el tiempo correspondiente se
produjo un
cultivo polimicrobiano, del cual se tomó una muestra con un aza
metálica
previamente estéril y se realizó un estriado en una placa de Petri
con agar lauril
sulfato, encubado por 37 °C por 24 horas.
Pasadas las 24 horas se observaron los resultados y se
seleccionaron 3
colonias diferentes, cada una de ellas fueron aisladas con una
aguja metálica
previamente estéril en tubos de ensayos con caldo lauril sulfato e
incubadas a 37
°C por 24 horas. Seguidamente los tres tubos con colonias fueron
resembrados
por estriado en placas de Petri con agar lauril sulfato,
encubándolas a 37 °C por
24 horas, este procedimiento se repitió varias veces hasta obtener
colonias puras.
Una vez puras las colonias seleccionadas al inicio, fueron
sembradas con una
aguja estéril por punción y estriado en tubos de ensayos con agar
inclinado hierro
tres azucares (TSI), e incubados a 37 °C por 24 horas.
Identificando
bioquímicamente las colonias sembradas y comparadas con la
bibliografía
correspondiente (Ver figura 2).
Figura 2.- Procedimiento de aislamiento de bacterias puras de
aguas residuales,
utilizando caldos y agar lauril sulfato.
Caldo Lauril
Aza metaliza estéril se
Pruebas Bio uímicas con a ar inclinado TSI
Agar Lauril
Practica 3.- Determinación de baterías puras a partir de estriado
de Agar XLD.
A partir de aguas residuales se tomó una muestra con una
propipeta de 5 ml
los cuales se añadieron en 50 ml de caldo enriquecido de selenito
cistina y se
incubo a 37 °C por 24 horas, pasado el tiempo correspondiente se
tomó una
muestra con una aza metálica estéril y se realizó un estriado en
una placa de Petri
con agar XLD, encubados a 37 °C por 24 horas.
Se tomaron dos muestras de colonias puras, resultado del estriado
en las
placas de Petri con agar XLD, y se sembró por punción y estriado en
cada tubo de
ensayo con agar inclinado hierro tres azucares (TSI), utilizando
una aguja metálica
previamente estéril, y se encubo por 37° C por 24 horas.
Determinando el género
Figura 3.- Procedimiento de aislamiento de bacterias puras de
aguas residuales,
utilizando agar XLD.
Agar XLD
C1 C2
Practica 4.- Determinación del número más probable de bacterias de
aguas
residuales, a partir de los Coliformes totales y fecales con tubos
múltiples.
A partir de agua residual de efluente de una planta de
tratamiento, se procedió
a tomar con una propipeta 10 ml de muestra y se añadieron en tres
tubos de
ensayo con 10 ml de caldo bilis verde brillante (50% de muestra),
de igual forma
se añadieron 1 ml en tres tubos de ensayos con 10 ml de caldo bilis
verde brillante
(10 % de muestra); por último, se tomó 1 ml de la muestra y se
diluyo en 9 ml de
buffer fosfato salino contenidos en un tubo de ensayo, y de este se
extrajo 1 ml y
se añadió en otros tres tubos de ensayos con caldo bilis verde
brillante (0.1 % de
la muestra), todos los tubos fueron encubados a 37 °C por 24 horas,
pasado el
tiempo correspondiente los tubos que resultaron positivos para
Coliformes totales
fueron resembrados utilizando un aza metálica estéril e incubados a
44 °C (baño
de maría) por 24 horas determinando el crecimiento de Coliformes
fecales (ver
figura 4).
Se determinó el número más probables (NMP/100 ml) comparando los
tubos
que dieron positivos a diferentes concentraciones (10 ml, 1 ml y
0,1 ml) con las
referencias aportadas por el profesor de la materia.
Figura 4.- Procedimiento de la determinación del número más
probable de
bacterias de aguas residuales, a partir de tubos múltiples.
Efluente de
Aguas tratadas
Encuban a
10 ml 10 ml 10 ml
9 ml
1 ml
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Aislamiento de bacterias puras del tracto bucal, utilizando
caldos y agar
lactobacilo.
Figura 5.- Colonias puras en agar lactobacilo.
En la figura 5 se nota la presencia de colonias de color blanco
que
posiblemente pueden ser Lactobacilos casei ,
Lactobacilos leichmannii ,
Lactobacilos plantarum o Enterococcus faecalis según
The Himedia manual
(1998).
Aislamiento de bacterias puras de aguas tratadas, utilizando
caldos y agar lauril
sulfato.
Figura 6.- Colonias estriadas en agar Lauril sulfato.
En la figura 6, se nota la presencia el crecimiento de colonias de
una variedad
de bacterias de las cuales se seleccionaron tres (3): C1: colonia
con forma de
nube, color azul con una tonalidad verdosa; C2: colonia circular,
color blanquecina
y muy grumosa y C3: colonia en forma de cotufa blanquecina con los
bordes
transparentes muy grumosa.
Figura 7.- Tubos de ensayo con crecimiento de bacterias en caldo
Lauril sulfato.
En la figura 7 se observó cambio de coloración comparado con el
tubo control,
de igual forma se nota la presencia de gas, lo cual indico
digestión bacteriana, con
depósitos de sedimento en el fondo comparando estos resultados con
The
Himedia manual (1998), que posiblemente podrían ser Enterobacter
aerogenes,
Escherichia Coli , Salmonella typhimuriun, Staphylococcus
aureus o Enterococcus
faecalis.
Determinación de baterías puras a partir de estriado de Agar
XLD.
Figura 8.- Presencia de colonias puras en placa de agar XLD.
En la figura 8, Se obtuvo como resultado la observación del
crecimiento de
colonias de color amarillo las cuales son posibles Proteus
vulgaris, Proteus
mirabilis y la presencia de colonias rojas las cuales
posiblemente sean Salmonella
parahyphy a, Salmonella parahyphi b, Shiguella
sonnei o Shiguella dysenteriae
según The Himedia manual (1998).
Prueba bioquímica con agar inclinado TSI (hierro tres
azucares):
Figura 9.- Prueba bioquímica en agar inclinado TSI con muestras de
agar
Lactobacilo y agar Lauril sulfato.
En la figura 9, en la colonia 1 (C1) se nota la presencia de
oxígeno y
producción de sulfuro de hidrogeno, en la C2 y C3 se nota la
formación de sulfuro
de hidrogeno, esto indica que la glucosa en fermentado con
producción de sulfuro
de hidrogeno según Infante (2011), por otra parte, en el Manual de
Difco (1984) y
The Himedia manual (1998) posiblemente sean las colonias de Proteus
vulgaris o
Salmonella enteritidis.
Figura 10.- Prueba bioquímica en agar inclinado TSI, con muestras
de agar XLD.
En la figura 10 se nota en C1, la presencia de gas y cambios de
coloración a
amarillo en comparación con el control, indicando una fermentación
de la glucosa,
lactosa y/o sacarosa (Infante, 2011), mientras que en C2 se nota la
presencia de
gas, formación de sulfuro de hidrogeno, y cambio de coloración a
negro lo que
indica glucosa fermentada con producción de sulfuro de hidrogeno y
gas (Infante,
2011). En comparación con The Himedia manual (1998), indica que
posiblemente
puedan ser C1: Escherichia coli y C2: Salmonella
typhimurium.
C1 C2
Determinación del número más probable de bacterias de aguas
residuales, a partir
de los coliformes totales y fecales con tubos múltiples.
Tabla 1.- Número más probable bacterias de aguas tratadas a
temperaturas de 37
°C y 44°C.
ml Coliformes
37°C 3/3 3/3 3/3 >1100 Totales
44°C 3/3 3/3 3/3 >1100 Fecales
En la tabla 1, se nota el crecimiento de coliformes totales a
temperaturas de
37ºC, en las concentraciones de 10ml (50%), 1ml (10%) y 0,1ml
(0,1%)
respectivamente de igual forma a 44ºC se presentó el crecimiento de
coliformes
CONCLUSIÓN.
En conclusión puedo agregar que en el tracto bucal las placas de
agar lactobacilo
obtuvo presencia de bacterias que posiblemente sean
Lactobacilos casei,
Lactobacilos leichmannii, Lactobacilos plantarum o Enterococcus
faecalis según
The Himedia manual (1998).
En las bacterias puras de aguas tratadas, utilizando caldos y agar
lauril sulfato
crecimiento de colonias de una variedad de bacterias .Tubos de
ensayo con
crecimiento de bacterias en caldo Lauril sulfato se observó
presencia de gas, lo
cual indico digestión bacteriana, con depósitos de sedimento en el
fondo
comparando estos resultados con The Himedia manual (1998), que
posiblemente
podrían ser Enterobacter aerogenes, Escherichia Coli, Salmonella
Typhimuriun,
Staphylococcus aureus o Enterococcus faecalis.
En las placas de agar XLD resultado la observación del crecimiento
de colonias de
color amarillo las cuales son posibles Proteus vulgaris, Proteus
mirabilis y la
presencia de colonias rojas las cuales posiblemente sean Salmonella
parahyphy a,
Salmonella parahyphi b, Shiguella sonnei o Shiguella dysenteriae
según The
Himedia manual (1998).
En las prueba bioquímicas todas resultaron + y en el cuadro
comparativo el
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.
Clavell Luis A., Pedrique de Aulacio Magaly. (1999). Microbiología
manual de
métodos generales. Primera reimpresión revisada. Facultad de
Farmacia.
Universidad Central de Venezuela, Caracas.
Consulta en línea: http://www.pomif.com/pages/.../
aislamientos. Consulta 02/12/2013.
Manacorda, Cuadros y Álvarez. (2007). Manual práctico de
microbiología - tomo
II: microbiología ambiental ii. Capítulo 3. Técnica de fermentación
en tubo
múltiple (NMP) para miembros del grupo de los coliformes:
colimetría.
Manual difco. (1984), Medios de cultivos deshidratados y reactivos
para la
microbiología décima edición Detroit michigan. Usa.
Sasson, Albert (1984). Las biotecnologías: desafíos y promesas
Investigaciones Biológicas. La Habana.
The HiMedia Manual for Microbiology Laboratory Practice.
(1998).editorial
HiMedia. 524pp.
Consulta: 02/12/2013
Wikipedia® Fundación Wikimedia, Inc., una organización sin
ánimo de lucro
.http://es.wikipedia.org/wiki/Tubo_de_ensayo . Consulta
02/12/2013.