Post on 30-Sep-2018
Técnicas de genética molecular
- Detección de secuencias de ADN y ARN
- Localización de un gen
- Estructura y función de una región genómica
- Expresión génica
Se requieren métodos para trabajar con una pequeña
parte del ADN o del ARN
Técnicas de genética molecular
Separación de moléculas por tamaño y carga eléctrica
Permite visualizar fragmentos de ADN:
electroforesis en gel de agarosa
electroforesis en gel de poliacrilamida
electroforesis capilar
Electroforesis
Preparación:
Electroforesis en gel de agarosa
Electroforesis horizontal:
Electroforesis en gel de agarosa
Escaleras de fragmentos de tamaño conocido
100 pb p-GEM PhiX-HaeIII
Marcadores de tamaño molecular
Preparación:
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Electroforesis vertical:
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Secuenciador automático
ABI 3130
Electroforesis capilar
Agentes intercalantes emisores de fluorescencia en
transiluminador de luz UV
Visualización de los fragmentos de ADN
Bromuro de etidio (Sharp en 1973):
- molécula plana capaz de unirse al ADN
- agente carcinogénico y mutagénico.
- se une al ADN de dos formas:
- unión fuerte intercalándose entre los pares
de bases,
- unión débil, “no intercalante”, luego de que
los sitios de intercalación están saturados.
Agentes intercalantes
Intercalación de la molécula de
BrEt- entre dos bases contiguas en
la molécula de ADN.
Luego de la unión, la fluorescencia
del colorante a la luz UV aumenta
casi 20 veces.
Máximo de emisión del BrEt- a
595 nm.
Agentes intercalantes
Riesgo de exposición al BrEt: cancerígeno
Utilización de colorantes inocuos:
Sybr Green, Sybr Gold, Sybr Safe, GelRed, GelGreen.
Agentes intercalantes
Marcación radioactiva del ADN con 32P y
detección por autorradiografías
1 2 3 E 4 5 6 7 8 9 10
Visualización de los fragmentos de ADN
Nitrato de plata, con transiluminador de luz visible
Visualización de los fragmentos de ADN
Marcación con fluoróforos + lector láser
Visualización de los fragmentos de ADN
Obtención de moléculas de ADN genómico
Etapas generales de una extracción de ADN:
-ruptura de membranas
-digestión proteica
-purificación
-precipitación
-resuspensión del ADN
Obtención de moléculas de ADN genómico
Obtención de moléculas de ADN genómico
Fuentes de ADN
• Sangre: • leucocitos de mamíferos (camélidos: eritrocitos
nucleados) • Eritrocitos y leucocitos de otros grupos
Fuentes de ADN
• Otros fluidos corporales: • Líquido amniótico • Semen • Orina
Fuentes de ADN
• Pelos: • Con folículo: ADN nuclear y mitocondrial • Sin folículo: ADN mitocondrial
Fuentes de ADN
• Epitelio bucal: • hisopado de mucosa bucal • enjuague bucal • hisopado de objetos
Fuentes de ADN
• Hueso: • exhumaciones • restos arqueológicos
Fuentes de ADN
• Materia fecal:
Fuentes de ADN
• Material vegetal: • Hojas • Semillas • Flores, etc.
Fuentes de ADN
• Microorganismos: • Cultivos de laboratorio • Material arqueológico (sarro dental antiguo)
Obtención de ARN
Minimizar la actividad de ARNasas (¡muy estables!) - uso de material descartable libre de ARNasas - tratamiento del material de vidrio y las soluciones con DEPC 0,1% - uso de inhibidores de ARNasas (tiocianato de guanidina y agentes reductores) - trabajar rápido, en baja temperatura, con tapas cerradas - utilización permanente de guantes