TECNICAS INMUNOLÓGICAS CELULARES

Prof. Caroline Weinstein

AISLAMIENTO DE LINFOCITOS

AISLAMIENTO DE LINFOCITOS

ENSAYO INCORPORACIÓN TIMIDINA TRITIADA (FUNCIONAL)

INCORPORACIÓN DE TIMIDINA TRITIADA

ENSAYO DE CITOTOXICIDAD (FUNCIONALIDAD)

ENSAYO MTT:ENSAYO MTT:

ALTERNATIVAS AL ENSAYO DE INCORPORACIÓN DE TIMIDINA TRITIADA:

CITOMETRIA DE FLUJO: UNA POTENTE HERRAMIENTA EN INMUNOLOGÍA

CITOMETRIA DE FLUJO: UNA POTENTE HERRAMIENTA EN INMUNOLOGÍA

Forward Angle Light Scatter

FALS Sensor

Laser

Purdue University Cytometry Laboratories

Flow Cell

Injector Tip

FluorescenceFluorescencesignalssignals

Focused laserFocused laserbeambeam

Sheath fluid

Purdue University Cytometry Laboratories

Forward Angle Light Scatter

FALS Sensor

Laser

Purdue University Cytometry Laboratories

90 Degree Light Scatter

FALS Sensor

90LS Sensor

Laser

Purdue University Cytometry Laboratories

Laser

Fluorescence Detectors

Fre

q

Fluorescence

FALS Sensor

Fluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.)

Purdue University Cytometry Laboratories

PMT

PMT

PMT

PMT

DichroicFilters

BandpassFilters

Example Channel Layoutfor Laser-based FlowCytometry

Laser

1

2

3

4

Flow cell

original from Purdue University Cytometry Laboratories;modified by R.F. Murphy

CELLULAR ANTIGENS

Sensory AdhesionMetabolic

Log FITC

1000 100 10 1

11

0

.1

Co

un

t

3

0 7

0

0

1

5

0

ImmunophenotypingImmunophenotyping

Log FITC Fluorescence (CD8).1 1 10 100 1000

Lo

g P

E F

luo

resce

nce

(C

D4

)

.1 1

1

0 1

00

1 2

3 4

45% 2%

26%

CD4/CD8 Quadstats

27%

Otras aplicaciones citometria de flujo

• Evaluación funcional de la capacidad oxidasas (NADPH dependiente) de los neutrófilos

dihidrorodaminaneutrófiloneutrófilo

PMA

DIHIDRORODAMINA OXIDADA

 

Control- Unstim(Top),

Stimulated(Bottom)

Twin #1 (AD)Unstim(Top), Stimulated(Bottom)

Twin #2 (JD)Unstim(Top), Stimulated(Bottom)

                       

        

                       

       

                       

       

                        

       

                        

      

                        

      

Neutrophil oxidative index (NOI) = 1,614

                          NOI=1 

                            NOI=2 

HEMOGLOBINURIA PAROXÍSTICA NOCTURNA

CD59 CD55

Healthy  Control

                               

   

                              

   

Patient

                               

   

                              

   

PROLIFERACIÓN DE LINFOCITOS POR CITOMETRÍA DE FLUJOPROLIFERACIÓN DE LINFOCITOS POR CITOMETRÍA DE FLUJO:

Ejemplo: inmunohistoquímica para HER-2

SEPARACIÓN MAGNÉTICA DE CÉLULAS

EJERCICIOS:

La figura anterior representa un resultado de un ensayo de citotoxicidad para linfocitos CD8. Al respecto explique:

Fundamento del método.

Identifique que curva representa una menor actividad citotóxica

EJERCICIOS:

Dibuje una nube de puntos en el siguiente gráfico que represente los resultados de citometría de flujo de un paciente que no posee linfocitos CD8

CD8

CD4

EJERCICIOS:

Con respecto a la prueba de incorporación de timidina tritiada:a. Explique el fundamento del método b. Métodos alternativos. c. Cómo espera encontrarla en un individuo cuyo informe de citometría de flujo es

el siguiente. Fundamente su respuesta.

CD8

CD4

Un científico japonés sostiene que el cáncer se produce por una inmunodepresión. Describa un ensayo que le permita detectar una respuesta inmune deprimida ante tumores.

EJERCICIOS:

Usted ha sido contratado para ser el jefe del laboratorio de seguimiento de pacientes HIV positivos. Debe implementar una técnica para analizar las subpoblaciones linfocitarias. Describa la técnica escogida, haciendo un análisis crítico (ventajas y desventajas)

EJERCICIOS: