TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

¿QUÉ ES LA TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE?

• El término ADN recombinante hace referencia a la creación de nuevas combinaciones de segmentos o de moléculas de ADN que no se encuentran juntas de manera natural.

• La tecnología del ADN recombinante utiliza técnicas que provienen de la bioquímica de los ácidos nucleicos unidas a metodologías genéricas desarrolladas originalmente para la investigación de bacterias y de virus.

¿CUÁLES SON SUS APLICACIONES?

• Aplicaciones en investigación y medicina - Producción a gran escala de proteínas de utilidad médica - Animales transgénicos - Terapia génica

• Aplicaciones industriales• Aplicaciones en agricultura - Mejora genética de los cultivos - Nuevos insecticidas naturales

2 FUNCIONES BÁSICAS

• CLONAR (OBTENER MULTIPLES COPIAS) UN GEN• EXPRESAR UNA PROTEÍNA (CODIFICADA POR

EL GEN DE INTERÉS)

¿Y CÓMO SE HACE?

2 ELEMENTOS ESENCIALES

• SECUENCIA DE ADN DE INTERÉS • VECTOR

VECTORES

1. Plásmidos

• Inserción de hasta 10kb• Sistema más común

2. Fagos

• Filamentosos (M13, capacidad de inserción 10kb)• Tipo I (T1, capacidad 23kb)• Lamba (capacidad 25kb)•P1 (capacidad 100 kb)

3. Cósmidos

• Capacidad de 44kb• Plásmidos con sitios cos

Agentes que pueden insertar un fragmento de ADN dentro de una célula huésped = MOLÉCULA DE ADN TRANSPORTADORA

4. BAC • Capacidad de 300kb• Cromosoma artificial de bacterias

Células Huésped

GRAM NEGATIVASGRAM NEGATIVAS (E. coli,

P.aeruginosa)

GRAM POSITIVASGRAM POSITIVAS (Bacillus subtilis,

S.aureus, Streptommyces)

Levaduras

Células mamíferas

Bacterias

Saccharomyces cereviseae,Pichia pastoris, etc.

Líneas celulares como CHO ( cél. Ovario Hamster)

1. PlásmidosLos plásmidos son moléculas de ADN de doble cadena circular covalentemente cerrado (ccc) extracromosómicas de origen natural que tienen un origen de replicación (ori+) y que se replican autónomamente en las células bacterianas.

¿Porqué son empleados como vectores?Porque son:-Pequeños.-Producen múltiples copias.

LOS PLÁSMIDOS SON ELEMENTOS DE TRANSFERENCIA DE INFORMACIÓN GENÉTICA ENTRE BACTERIAS

PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE CLONADO

ORIGEN DE REPLICACION

GEN DE RESISTENCIA

AL ANTIBIÓTICO (MARCADOR

DE SELECCION)

GEN LACZ (MARCADOR

DE SELECCIÓN)

SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE

lacZ AmpR

ADN foráneo

PLÁSMIDO DE CLONADO

ORIGEN DE REPLICACIÓN

GEN LACZ

SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE

AMPR

DIGESTIÓN DEL PLÁSMIDO Y DEL FRAGMENTO DE ADN CON

LA MISMA ENZIMA DE RESTRICCION

PRODUCTO DE PCR

PLÁSMIDO DE CLONADO

DIGESTIÓN CON LA MISMA ENZIMA DE RESTRICCION

EcoRI EcoRIEcoRI

PRODUCTO DE PCR

PLÁSMIDO DE CLONADO

DIGESTIÓN CON LA MISMA ENZIMA DE RESTRICCION

PRODUCTO DE PCR DIGERIDO CON EcoRI

PLÁSMIDO DE CLONADO DIGERIDO CON EcoRI

LIGACIÓN

¿CON QUÉ?

ADN LIGASA

TUBO CON MEZCLA DE FRAGMENTO DE ADN Y

PLÁSMIDO DIGERIDOS CON EcoRI

ADN LIGASA

DOS RESULTADOS POSIBLES ….

PLÁSMIDO RECOMBINANTE

PLÁSMIDO NO RECOMBINANTE

TRANSFORMACIÓN BACTERIANA

¿CÓMO?

MÉTODO QUÍMICO O FÍSICO

TUBO CON MEZCLA DE PLÁSMIDOS

RECOMBINANTES Y NO RECOMBINANTES

TUBO CON CULTIVO LÍQUIDO DE BACTERIAS

DOS RESULTADOS POSIBLES ….

BACTERIA NO TRANSFORMADA

BACTERIA TRANSFORMADA

SIEMBRA PLACAS CON MEDIO AGAR LB SUPLEMENTADO CON AMPICILINA, IPTG Y X-gal

INCUBACIÓN A 37°C POR 16 HORAS

TRES RESULTADOS POSIBLES ….

BACTERIA NO TRANSFORMADA

A.

EN UN MEDIO CON AMPICILINA

LA BACTERIA SIN PLÁSMIDO NO CRECE

BACTERIA TRANSFORMADA

CON PLÁSMIDO NO RECOMBINANTE

TRES RESULTADOS POSIBLES ….

B.

EN UN MEDIO CON AMPICILINA

EN UN MEDIO CON IPTG Y Xgal

LA BACTERIA CON PLÁSMIDO CRECE

LA BACTERIA CON PLÁSMIDO NO RECOMBINANTE (GEN LACZ INTEGRO) ES AZUL

BACTERIA TRANSFORMADA CON PLÁSMIDO RECOMBINANTE

TRES RESULTADOS POSIBLES ….

C.

EN UN MEDIO CON AMPICILINA

EN UN MEDIO CON IPTG Y Xgal

LA BACTERIA CON PLÁSMIDO CRECE

LA BACTERIA CON PLÁSMIDO NO RECOMBINANTE (GEN

LACZ DISRUPTO) ES BLANCA

PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE EXPRESIÓN

COMPONENTES:

1.ORIGEN DE REPLICACIÓN2.GEN DE RESISTENCIA AL ANTIBIÓTICO (para seleccionar las bacterias que contienen el plásmido; ej. ampicilina)3.SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE 4.PROMOTOR (debe ser fuerte para tener una expresión elevada)5.SEÑAL DE TERMINACIÓN (finalización del ARNm)

PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN EN BACTERIAS

6. GEN REPORTERO7. GEN DE RESISTENCIA AL ANTIBIÓTICO (para seleccionar las células que hayan incorporado el plásmido a su genoma; ej. neomicina)

PARA LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA EN

BACTERIAS

PARA LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA EN

CÉLULAS DE MAMÍFEROS

PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE EXPRESIÓN

PLÁSMIDO DE EXPRESIÓN EN BACTERIAS

PLÁSMIDO DE EXPRESIÓN EN BACTERIAS: PROTEÍNAS DE FUSIÓN

¿SE PUEDEN EXPRESAR PROTEÍNAS HUMANAS O DE MAMÍFEROS EN BACTERIAS?

• Las células bacterianas son extremadamente útiles para la traducción activa de proteínas de mamíferos, immunológicamente activas.

• La expresión de genes de mamíferos en bacterias necesita resolver los problemas siguientes:

1. Las proteínas producidas por estos métodos no presentan modificaciones post-tranduccionales.

2. los promotores eucariotas no son reconocidos por las ARN polimerasas bacterianas.3. los genes eucariotas contienen intrones.4. los ARNm eucariotas no son todo el tiempo traducidos por los ribosomas bacterianos.

5. las proteínas presentes en grandes cantidades en las bacterias forman cuerpos de inclusión insolubles 6. las proteínas eucariotas pueden ser reconocidas como cuerpos extraños por las proteasas de la bacteria y ser degradadas.

EL CASO DE LA INSULINA HUMANA

SELECCIÓN DEL PROMOTOR

• Según la célula huésped: - Bacteria - Célula eucariotas• Según el tipo de ARN deseado en células

eucariotas: - ARNm: ARN POLIMERASA tipo II -ARNsh: ARN POLIMERASA tipo III

PLÁSMIDOS DE EXPRESIÓN EN CÉLULAS DE MAMÍFEROS

PLÁSMIDOS DE EXPRESIÓN EN CÉLULAS DE MAMÍFEROS

MÉTODOS DE TRANSFECCIÓN

TRANSFECCION ESTABLE Y TRANSITORIA• Se denomina trasfección transitoria aquella en la que el

plásmido no ha sido integrado a uno de los cromosomas eucarióticos.

• Se habla de transfección estable cuando el plásmido se ha integrado a uno ó más cromosomas eucariotas.

CO-TRANSFECCIONLa co-transfección es la transfección simultánea de varios plásmidos. Mediante la co-transfección se puede verificar si la transfección se ha realizado correctamente. Para lograrlo se co-transfecta un plásmido cuya presencia es verificada por una reacción rápida y simple que indica que el plásmido de interés ha sido bien transfectado.

GENES REPORTEROS O MARCADORES

GENES REPORTEROS O MARCADORES

GENES REPORTEROS O MARCADORES

2. FAGOS

¿ Qué son los virus ?

ESTRUCTURA DE LOS FAGOS

FAGOS HELICOIDALES

FAGOS ICOSAEDRICOS

CICLO LITICO

VS. CICLO

LISOGÉNICO

CLASIFICACION DE LOS FAGOS• El genoma de los fagos puede ser:

- RNA simple cadena (MS2, Qß), - RNA doble cadena (phi 6), - DNA simple cadena (phi X174, fd, M13) o - DNA doble cadena (T3, T7, lambda , T5, Mu, T2, T4).

• Los fagos pueden ser:

-líticos,-temperados o lisogénicos

PARA PENSAR …..

LOS FAGOS UTILIZADOS COMO VECTORES

¿SON LÍTICOS O LISOGÉNICOS?

PLÁSMIDO

FAGOS

3.Cósmidos

4. BACBACTERIAL ARTIFICIAL CHROMOSOME