Post on 23-Jan-2016
Tema 16 INHIBICIÓN ENZIMÁTICA II
1. Inhibición pseudoirreversibles2. Inhibición irreversible
2.1 Inhibidores irreversibles o venenos catalíticos2.2 Análisis de la velocidad de inactivación enzimática
2.3. Tipos de mecanismos de inhibición irreversible
1.-Inhibición irreversible simple.
2. Inhibición irreversible simple en presencia de Sustrato.
3.-Inhibición irreversible simple tiempo dependiente
4.-Inhibición irreversible simple tiempo dependiente en presencia de Sustrato.
1. Inhibición Pseudoirreversible
Inhibidores [I] no es >>> [E]
Inhiben a concentraciones parecidas a la enzima
Ki <<<<< Ki de Inhibidores reversibles
Orden 10-12 a 10-14 Unión fuerte a los enzimas
Pseudoirreversible el equilibrio está completamente desplazado hacia la formación del complejo [EI]
E +I EI Io= I + EI
Eo=E + EI
[EI] no es despreciable
a razón de velocidades máximas en presencia y ausencia de inhibidor
00 E
E
kcatE
kcatE
vo
via 0aEE
Io= I + EI
Eo=E + EI
EI = Eo – E
EI = Eo – aEo
EI = Eo (1-a)
)1()1(
)1()1(
aEoa
aKiaEo
aEo
aEoKiIo
E
EIKiI
0aEE
EoKiaa
Io
1
)1(
Dividiendo los dos miembros por (1-a)
1/a
Eo
)1( a
Io
m=Ki
a valores experimentales
Eo
KiEEoIoKiIoKiEoa
2
04)( 2
Io=0
Io=3,0 nM
Io=1,5nM
Io=4,5nM
Eo nM
vo
1,5 3,0 4,5
Representación de Willian y Morrison: Inhibición pseudoirreversible
Inhibidor titula a la enzima
2. Inhibidores irreversibles 2.1 Venenos Catalíticos
* Los inhibidores irreversibles o venenos catalíticos son sustancias que se unen a la enzima de manera tal que reducen su actividad prácticamente a
cero.
* Muchas enzimas son “envenenadas” por trazas de metales pesados, y por esta razón, es una práctica común utilizar sustancias complejantes, p. ej.,
EDTA, en los tampones de ensayo, para secuestrar estos metales pesados.
- Esto es de particular importancia en los procesos de purificación de enzimas:
Inhibidores se unen por enlaces covalentes a centro activo de la enzima
Inhibidor irreversible une a la enzima por un proceso irreversible* (constante de disociación 10-9 mol l-1)
Inhibición suele ser progresiva. Depende del tiempo
aspi
rin
a
Prostaglandin-H-
Sintasa
-La aspirina inhibe la formación de Protaglandina-G2, gracias a la metilación de la subunidad o dominio responsable de la actividad ciclooxigenasa, de la
Prostaglandina-H-sintetasa.
Penicilina
La enzima modificada por la penicilina no puede unir el puente de poli-Gly
2.2. Análisis de la velocidad de la inhibición irreversible
[I]>>>[E] El I esta en exceso no cambia durante la inhibición
[I] =[Io]
La cinética de la inhibición irreversible puede ser modelada usando un modelo de primer orden de la forma
E +I EI* Se forma este complejo que es inactivo
[EI]*=[ET] (1-exp-k`T)
K`(s-1) tendrá un significado diferente dependiendo del
mecanismo exacto de inhibición Tiempo (s)
[EI]* M
Cinética
2.3. Tipos de mecanismos de inhibición irreversible
1.-Inhibición irreversible simple.
E + I EI*
2.-Inhibición irreversible simple en presencia de Sustrato.
E + I EI*
E + S ES
3.- IInhibición irreversible simple tiempo dependiente
E + I EI EI*
4.- Inhibición irreversible simple tiempo dependiente en presencia de Sustrato.
E + I EI EI*
E + S ES
1.-Inhibición irreversible simple. ki
E + I EI*
ki constante de inhibición de segundo orden (M-1 s-1)
Ecuación diferencial que describe la formación de complejo EI
k`=ki [Io]
Ecuación diferencial de primer orden describe el cambio en la concentración de [EI] en el tiempo
*
*
EIEE
EIkidt
EId
T
*`**
EIEkEIEIokidt
EIdTT
I =Io
Reacción de segundo orden
Integración de la ecuación
tEI
o Tdtk
EIE
EId0
*´
*
*
)exp1(* t̀kTEEI
[EI]* M
Tiempo (s)
k`=ki [Io]Calcula k`
Iok
ki`
Se obtiene una constante de inhibición de segundo orden
2. Inhibición irreversible simple en presencia de Sustrato.
E + I EI*
E + S ES
ki
Ks
Ecuación diferencial que describe la formación de complejo EI*
Substrato puede proteger a la enzima de la inhibición irreversible
ESEIEE
ES
SEKm
EIkidt
EId
T
*
*
SKm
KmEIEtE
*
Sustituyendo y despejando
I = Io
*´*
**
EIEkdt
EIdSKs
KmEIEtIoki
dt
EId
T
Io
SKm
kiKmk
`
Integración de la ecuación
tEI
o Tdtk
EIE
EId0
*´
*
*
)exp1(* t̀kTEEI
[EI]* M
Tiempo (s)
Calcula k`
SKs
kiKs
Io M
k`(s-1)
m
IoSKs
kiKsk
`
Graficando k` frente a diferentes concentraciones de Inhibidor
ki
S y Ks constantes se pueden calcular idenpendientemente
3.-Inhibición irreversible simple tiempo dependiente
E + I EI EI*
Rápido equilibrio reversible entre E y el I seguida de una reacción lenta e
irreversible de inactivación [EI]*Ecuación diferencial que describe la formación de complejo EI*
Ki ki
EIEIEE
EI
IEKi
EIkidt
EId
T
*
*
Ioki
EIEtEI
/1
*
*`*
/1
**
EIEkdt
EId
Ioki
EIEtki
dt
EId
T
Ioki
kik
/1´
KiIo
Iokik
`
Integración de la ecuación
tEI
o Tdtk
EIE
EId0
*´
*
*
)exp1(* t̀kTEEI
[EI]* M
Calcula k`
KiIo
Iokik
`
Graficando k` frente a diferentes concentraciones de Inhibidor
Io M
k`(s-1)
Hipérbola rectangular
Ki y ki Procedimientos de regresión no linear
4.-Inhibición irreversible simple tiempo dependiente en presencia de Sustrato.
E + I EI EI*
E + S ES
Ki ki
Ks
ESEIEIEE
ES
SEKs
EI
IEKi
EIkidt
EId
T
*
*
KsS
IoKi
EIEtEI
11
*
Sustituyendo y despejando
*`*
11
**
EIEkdt
EId
KsS
IoKi
EIEt
dt
EId
T
KsS
IoKiki
k11
´
Integración de la ecuación
tEI
o Tdtk
EIE
EId0
*´
*
*
)exp1(* t̀kTEEI
[EI]* M
Calcula k`
KsS
IoKiki
k11
´
Graficando k` frente a diferentes concentraciones de Inhibidor
Hipérbola rectangular
Ki y ki Procedimientos de regresión no linear
Io M
k`(s-1)
Como distinguirías entre una Inhibición irreversible tiempo dependiente y otra Inhibición irreversible tiempo independiente
k`(s-1)
Io MIo M
k`(s-1)
RESUMEN
● Existen unos inhibidores denominados pseudoirreversibles que no cumplen todas las condiciones de Michaelis, puesto que la concentración inicial de inhibidor [Io] es efectiva al mismo orden de magnitud que la concentración inicial de enzima.En este tipo de inhibición la Ki presenta valores que van desde 10-8 -10-12.
Se comportan como inhibidores pseudoirreversibles la gran mayoria de inhidores de naturaleza proteica, así como los anticuerpos obtenidos frente a las proteínas enzimáticas. El comportamiento cinético es diferente de los inhibidores reversibles.
● Los inhibidores suicidas son compuestos que son inactivos como inhibidores en ausencia de enzimas, se activan específicamente por la enzima a la que van a inhibir , uniéndose covalentemente a la proteína enzimática.
● Análisis de la velocidad de la inhibición irreversible. Muestra un comportamiento dependiente de la presencia de substrato y de la posibilidad que el parámetro tiempo influya en el proceso de unión covalente. Así se distinguen desde el punto de vista cinético:
Inhibición irreversible simple Inhibición irreversible simple en presencia de Sustrato. Inhibición irreversible simple tiempo dependiente Inhibición irreversible simple tiempo dependiente en presencia de Sustrato