Post on 09-Oct-2015
Tema 5. Recuento de microorganismos
Tema 5: Recuento de microorganismos
Microbiologia Microbiologia MICC, Grau en Nanocincia i Nanotecnologia
Medidas de masa celular: mtodos directos e indirectos
Recuento del nmero de microorganismos: recuento de
totales y recuento de viables.
Tema 5: Recuento de microorganismos
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Mesures de la massa cellular
- Mtodes directes
- Pes humit (poc precs)
- Pes sec (15-20% de lhumit, ms precs, 1 mg 109 cllules)
- Quantificaci dun constituent concret - DNA, RNA, protenes, clorofilla, peptidglic, etc.
- til si la substncia s constant a cada cllula
- Mtodes indirectes
- Consum / producci dun metabolit (O2, CO2 / producci dcids)
- Mtodes ptics (mesura de la terbolesa dun cultiu). Mtodes rpids, fcils i sensibles
-Espectofotmetre / colormetre. Mesures de densitat ptica (DO = Absorbncia)
Quantificaci del creixement
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Massa cellular. Mtodes indirectes: Espectofotmetre
- Mesures de densitat ptica (DO = Absorbncia)
- Dispersi de la llum proporcional a la massa del cultiu
Ms cllules
Ms llum dispersada
Menys llum detectada
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Recompte del nombre de cllules
- Recomptes directes
- Cambres de recompte Petroff-Hausser/ recompte de Breed
- Comptadors electrnics: Coulter counter
- Recomptes cllules viables
- Mtodes sembra
- Mtodes membranes filtraci
Quantificaci del creixement
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Cambres de Petroff- Hausser
- Fcil, barat i rpid
- til per a procariotes i eucariotes
- No es diferencien cllules vives de mortes
Recompte de Breed:
Nombre de cllules. Recomptes directes
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Muestras diluidas (con muy bajo n de cfu/ml)
Procedimiento de filtracin por membrana:
- pasar muestra a travs del sistema (filtro)
- depositar filtro sobre la superficie de una placa de Petri con medio slido.
- al cabo del tiempo se formarn sobre el filtro tantas colonias como
individuos quedaron retenidos a partir del filtrado de la muestra original.
Nombre de cllules. Recompte de viables
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Nombre de cllules. Recompte de viables
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A partir del cultivo original se hacen
diluciones seriadas.
De algunas de ellas se siembra un cierto
volumen (normalmente 0,1 ml) en placas de
Petri.
Se cuentan las placas que tengan entre 20 y
300 colonias.
Se estima el n de unidades formadoras de colonias/ml (CFU/ml).
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Mtode
Mtode sembra per extensi
Sample is pipetted onto surface of agar plate (0.1 ml or less)
Sample is spread evenly over
surface of agar using sterile
glass spreader
Mtode sembra en profunditat
Typical spread-plate results
Surface
colonies
Incubation
Surface
colonies
Solidification
and incubation Subsurface
colonies
Typical pour-plate results Sterile medium is added and
mixed well with inoculum Sample is pipetted into
sterile plate
- simple
- usat per recompte de viables
- resultats imprecisos si les cllules sagrupen
- resultats com a unitats formadores colnies (CFU)
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Desventajas de esta metodologa
No podemos garantizar que cada colonia no proceda de ms de
un individuo (especialmente en bacterias que forman
agrupaciones de 2 o ms clulas).
El recuento se refiere no a clulas viables reales sino a unidades formadoras de colonia (UFC).
Por lo tanto, una UFC corresponde, como mnimo, a una
bacteria,
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DILUCIONES SERIADAS
0.1 ml + 0.9 ml buffer =
0.1 ml en 1 ml final
(dilucin 1/10) = 10-1
0.1 ml + 9.9 ml buffer =
0.1 ml en 10 ml final
(dilucin 1/100) = 10-2
10-4 10-6 10-8 10-10 10-12
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Mostra(ml) 0.5 0.05 0.05 0.5
Ringer (ml) 4.5 5 5 4.5
FD 10 -1 10 -2 10 -2 10 -1
FDA 10 -1 10 -3 10 -5 10 -6
Mostra BANCO DE
DILUCIONES
0.1 ml 0.1 ml
FD: factor de dilucin
FDA: factor de dilucin acumulado
cfu/ml = (n colonias x Factor dilucin acumulado) / volumen sembrado
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1/10-fold serial dilution
23 2
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23 2
Conveniente sembrar duplicados de cada dilucin
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Precauciones a la hora de sembrar y
de leer las placas sembradas:
- slo leer placas con n adecuado de colonias (20-300)
- comprobar que los factores de dilucin coinciden con los valores
de nmeros de colonias obtenidas
- tener en cuenta el volumen de las respectivas diluciones
sembrado en las placas
- conveniente sembrar varias placas rplica de cada dilucin para
hacer medias y tener valores representativos