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Caracterização química e propriedades antioxidantes de
amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in
vitro e in vivo em diferentes habitats
Sara Vanessa da Cruz Pinto
Dissertação apresentada à Escola Superior Agrária de Bragança para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia
Orientado por
Maria João Sousa
Isabel C. F. R. Ferreira
Bragança
2012
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats ii
Este trabalho insere-se no projeto de investigação PTDC/AGR-ALI/110062/2009, financiado
pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT, Portugal) e pelo Programa
COMPETE/QREN/EU.
Aos meus Pais e ao meu namorado….
Agradecimentos
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats iii
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais por me terem permitido continuar com os estudos, fazendo um
grande esforço financeiro, e por me terem dado todo o apoio que sempre precisei.
Ao meu namorado por me ter dado todo o apoio e coragem para continuar.
Aos meus amigos que sempre me deram apoio nas horas mais difíceis deste
percurso, principalmente à Tânia Brito, à Raquel Leal e ao José Pinela.
Às minhas orientadoras, Professoras Doutoras Maria João Sousa e Isabel
Ferreira que sempre acreditaram nas minhas capacidades e que me deram toda a força e,
por isso, um muito obrigado.
À coordenadora do Departamento de Biologia e Biotecnologia da Escola
Superior Agrária de Bragança (ESA), Professora Doutora Ana Carvalho, e à
responsável pelo laboratório de Biologia, Professora Doutora Anabela Martins, por
permitirem a execução deste trabalho e por todo o apoio logístico.
À responsável pelo Laboratório de Química e Bioquímica Aplicada da ESA
(BioChemCore), Professora Doutora Isabel Ferreira, e à Doutora Lillian Barros por todo
o apoio prestado neste trabalho; foi uma ajuda imprescindível, obrigada por tudo.
Ao Professor Doutor Luís Pedro do Laboratório do Centro de Biotecnologia
Vegetal da Faculdade de Ciências de Lisboa, pelo apoio nas análises das frações
voláteis do fungo Lepista nuda.
À Dona Isabel e Amélia que nas horas de mais dificuldade deram todo o apoio.
E por fim, mas não os últimos, aos meus amigos de licenciatura e mestrado que
ao longo destes últimos anos foram tão importantes.
Obrigado !!!!
Índice de Geral
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats iv
ÍNDICE GERAL
AGRADECIMENTOS ................................................................................................................. iii
ÍNDICE DE TABELAS ................................................................................................................vi
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................ vii
ABREVIATURAS ........................................................................................................................ x
RESUMO ..................................................................................................................................... xii
ABSTRACT ................................................................................................................................ xiv
I. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 2
1.1. Morfologia e classificação de fungos ............................................................................ 2
1.2. Produção de macrofungos ............................................................................................ 7
1.3. O macrofungo Lepista nuda ........................................................................................ 11
1.4. Compostos voláteis em macrofungos ......................................................................... 12
1.5. Macrofungos como fonte de compostos bioativos .................................................... 16
1.6. Objetivos ..................................................................................................................... 19
II. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................................... 21
2.1. Material biológico e preparação das amostras ........................................................... 21
2.1.1. Corpos frutíferos silvestres e comerciais ............................................................ 21
2.1.2. Produção in vitro do micélio ............................................................................... 21
2.2. Avaliação do crescimento do micélio em diferentes meios de cultura sólidos .......... 23
2.2.1. Determinação da curva de crescimento do micélio de Lepista nuda com base no
raio obtido em diferentes meios de cultura sólidos ........................................................... 23
2.2.2. Determinação da curva de crescimento do micélio de Lepista nuda com base
nas massas fresca e seca obtidas em diferentes meios de cultura sólidos......................... 25
2.2.3. Aplicação de condições de stresse à amostra comercial em diferentes meios de
cultura sólidos ..................................................................................................................... 26
2.3. Padrões e Reagentes ................................................................................................... 27
2.4. Determinação de voláteis obtidos por destilação-extração Likens-Nickerson (LN) ... 28
2.5. Determinação da composição proximal...................................................................... 30
2.6. Determinação de ácidos gordos .................................................................................. 30
2.7. Determinação de açúcares .......................................................................................... 31
2.8. Determinação de ácidos orgânicos ............................................................................. 32
2.9. Determinação de compostos fenólicos ....................................................................... 32
2.10. Determinação de tocoferóis .................................................................................... 33
2.11. Avaliação da atividade antioxidante ....................................................................... 34
Índice de Geral
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats v
2.11.1. Aspetos gerais ..................................................................................................... 34
2.11.2. Ensaio Folin Ciocalteu.......................................................................................... 34
2.11.3. Ensaio do ferricianeto/azul da Prússia ................................................................ 35
2.11.4. Ensaio da atividade captadora de radicais DPPH ................................................ 35
2.11.5. Ensaio do β-caroteno/linoleato .......................................................................... 35
2.11.6. Ensaio TBARS ....................................................................................................... 36
2.12. Análise estatística .................................................................................................... 36
III. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................. 39
3.1. Avaliação do crescimento do micélio de Lepista nuda em diferentes meios de cultura
sólidos. .................................................................................................................................... 39
3.1.1. Avaliação do crescimento do micélio de Lepista nuda com base no raio obtido
em diferentes meios de cultura sólidos .............................................................................. 39
3.1.2. Avaliação do crescimento do micélio de Lepista nuda com base nas massas
fresca e seca obtidas em diferentes meios de cultura sólidos............................................ 43
3.1.3. Avaliação do crescimento do micélio de Lepista nuda obtido a partir da amostra
comercial, em diferentes meios de cultura sólidos sob condições de stresse de
temperatura ........................................................................................................................ 55
3.2. Composição em voláteis nas amostras de Lepista nuda comerciais e silvestres
provenientes de diferentes habitats ....................................................................................... 57
3.3. Composição proximal e ácidos gordos maioritários nas amostras de Lepista nuda
comerciais e silvestres provenientes de diferentes habitats .................................................. 62
3.4. Composição química dos corpos frutíferos e dos micélios de Lepista nuda............... 64
3.5. Atividade antioxidante dos corpos frutíferos e dos micélios de Lepista nuda ........... 69
IV. CONCLUSÕES E PERSPETIVAS FUTURAS .......................................................................... 72
V. BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................................... 75
VI. ANEXOS ........................................................................................................................... 83
Índice de Tabelas
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats vi
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Classificação dos fungos do Filo Basidiomycota . .......................................... 7
Tabela 2. Resultados de crescimento obtidos nos diferentes meios de cultura a
diferentes temperaturas. .................................................................................................. 56
Tabela 3. Composição da fração volátil, obtida por destilação-extração, de amostras de
Lepista nuda comerciais e silvestres provenientes de carvalhal e pinhal ....................... 61
Tabela 4. Composição proximal e ácidos gordos maioritários dos corpos frutíferos de
Lepista nuda obtidos em diferentes habitats. ................................................................. 63
Tabela 5. Composição em açúcares, ácidos orgânicos, compostos fenólicos e tocoferóis
dos corpos frutíferos de Lepista nuda provenientes de diferentes habitats e do micélio
obtido, in vitro, em diferentes meios de cultura. ............................................................ 67
Tabela 6 Atividade antioxidante dos corpos frutíferos de Lepista nuda provenientes de
diferentes habitats e do micélio obtido, in vitro, em diferentes meios de cultura. ......... 70
Índice de Figuras
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats vii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Representação do corpo frutífero, micélio e hifas. .......................................... 4
Figura 2. Divisão dos organismos proposta por Whittaker (1969). ................................ 5
Figura 3. Estrutura do micélio e os basidiósporos suspensos no chapéu do cogumelo. .. 6
Figura 4. Produção de diversos macrofungos em Portugal. ............................................ 8
Figura 5. Macrofungo Lepista nuda . ............................................................................ 11
Figura 6. Aparelho de Clevenger modificado. .............................................................. 14
Figura 7. Aparelho de destilação-extração Likens-Nickerson. ...................................... 14
Figura 8. Estrutura química do 1-octen-3-ol ................................................................ 16
Figura 9. Estrutura química dos tocoferóis.................................................................... 17
Figura 10. Frutificações de Lepista nuda. ..................................................................... 21
Figura 11. Excisão de porções do corpo frutífero ........................................................ 22
Figura 12. Crescimento contínuo e ramificado das hifas nos diferentes meios de
cultura. ............................................................................................................................ 23
Figura 13. Esquema representativo do procedimento usado na placa de Petri para a
determinação da curva de crescimento do micélio de Lepista nuda. ............................. 24
Figura 14. Determinação da curva de crescimento do micélio de Lepista nuda em
diferentes meios de cultura. ............................................................................................ 24
Figura 15. Inóculo em celofane usado na determinação das massas de micélio. .......... 26
Figura 16. Inóculos de micélio a diferentes temperaturas: (A) frio 4 °C; (B) quente 37
°C. ................................................................................................................................... 27
Figura 17. Destilador de Likens-Nickerson. ................................................................. 28
Figura 18. Micélio da amostra comercial de Lepista nuda utilizada para extração de
compostos voláteis. ......................................................................................................... 29
Figura 19. Curva de crescimento do micélio obtido em diferentes de meio de cultura a
partir de corpos frutíferos de Lepista nuda provenientes de prado. ............................... 40
Figura 20- Curva de crescimento do micélio obtido em diferentes meios de cultura, a
partir de corpos frutíferos comerciais de Lepista nuda. ................................................. 41
Figura 21. Taxa Relativa de Crescimento com base no raio do micélio obtido a partir da
amostra de Lepista nuda proveniente de prado. ............................................................. 42
Figura 22. Taxa Relativa de crescimento com base no raio do micélio obtido a partir da
amostra comercial de Lepista nuda. ............................................................................... 42
Índice de Figuras
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats viii
Figura 23. Crescimento do micélio de Lepista nuda proveniente de prado, com base nas
massas fresca e seca obtidas em meio de cultura MMN completo. ............................... 44
Figura 24. Crescimento do micélio de Lepista nuda proveniente de prado, com base nas
massas fresca e seca obtidas no meio de cultura MMN incompleto. ............................. 45
Figura 25. Crescimento do micélio de Lepista nuda proveniente de prado, com base nas
massas fresca e seca obtidas em meio de cultura PACH. ............................................... 46
Figura 26. Crescimento do micélio de Lepista nuda proveniente de prado, com base nas
massas fresca e seca obtidas em meio de cultura FAD. ................................................. 47
Figura 27. Crescimento do micélio de Lepista nuda proveniente de prado, com base nas
massas fresca e seca obtidas em meio de cultura PDA. ................................................. 48
Figura 28. Crescimento do micélio de Lepista nuda comercial, com base nas massas
fresca e seca obtidas em meio de cultura MMN completo. ............................................ 49
Figura 29. Crescimento do micélio de Lepista nuda comercial, com base nas massas
fresca e seca obtidas em meio de cultura MMN incompleto. ......................................... 50
Figura 30. Crescimento do micélio de Lepista nuda comercial, com base nas massas
fresca e seca obtidas em meio de cultura PACH. ........................................................... 51
Figura 31. Crescimento do micélio de Lepista nuda comercial, com base nas massas
fresca e seca obtidas em meio de cultura FAD. .............................................................. 52
Figura 32. Crescimento do micélio de Lepista nuda comercial, com base nas massas
fresca e seca obtidas em meio de cultura PDA. .............................................................. 52
Figura 33. Taxa Relativa de crescimento com base na massa de micélio obtida a partir,
da amostra de Lepista nuda proveniente de prado. ........................................................ 54
Figura 34. Taxa Relativa de crescimento com base na massa de micélio obtida a partir
da amostra comercial de Lepista nuda. .......................................................................... 55
Figura 35. Resultados obtidos no crescimento do micélio nos diferentes meios de
cultura e diferentes temperaturas, e a cor obtida. ........................................................... 57
Figura 36. Estrutura química do composto 2-pentilfurano. ........................................... 58
Figura 37. Estrutura do linolol (3,7-dimetil-1,6-octadieno-3-ol) . ................................ 59
Figura 38. Estrutura química da pulegona. .................................................................... 59
Figura 39. Estrutura química do limoneno. ................................................................... 60
Figura 40. Perfil em ácidos gordos do corpo frutífero de Lepista nuda silvestre
proveniente de carvalhal.. ............................................................................................... 64
Índice de Figuras
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats ix
Figura 41. (A) Perfil em açúcares da amostra comercial e do micélio MMN completo
(B) Perfil em ácidos orgânicos da amostra comercial e do micélio MMN completo (C)
Perfil em tocoferóis da amostra de carvalhal e da amostra de micélio FAD.................. 68
Abreviaturas
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats x
ABREVIATURAS
Absorvância A
Atividade captadora de radicais ACR
Associação Oficial de Química Analítica (Association of Official
Analytical Chemists) AOAC
Inóculo inicial cw1
Crescimento do micélio por raio cw2
Detetor de díodos DAD
Desvio padrão DP
2,2-difenil-1-picril-hidrazilo DPPH
Ácido desoxirribonucleico DNA
Massa seca dw
Por exemplo (Exempli gratia) e.g.
Concentração de extrato correspondente a 50% de atividade
antioxidante ou 0,5 de absorvância no ensaio do poder redutor EC50
Estados Unidos da América EUA
Meio Ferry & Das FAD
Ésteres metílicos de ácidos gordos (Fatty Acid Methyl Esters) FAME
Fonte comercial FC
Detetor de ionização de chama (Flame Ionization Detector) FID
Carvalhal FO
Pinhal FP
Massa fresca fw
Cromatografia gasosa (Gas Chromatography) GC
Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa GS-MS
Cromatografia líquida de alta eficiência (High-Performance Liquid HPLC
Abreviaturas
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats xi
Chromatography)
International Union of Pure and Applied Chemistry IUPAC
Destilação-extração Likens-Nickerson LN
Radical peroxilo LOO•
Malondialdeído MDA
Meio sólido Melin-Norkans modificado completo MMN
completo
Meio sólido incompleto Melin-Norkans MMN
incompleto
Espetrometria de massa (Mass Spectrometry) MS
Ácidos gordos monoinsaturados (Monounsaturated Fatty Acids) MUFA
Número n.º
Não detetado nd
Meio sólido Pachlewski PACH
Meio Potato Dextrose Agar PDA
Ácidos gordos polinsaturados (Polyunsaturated Fatty Acids) PUFA
Detetor de índice de refração (Refraction Index) RI
Espécies reativas de azoto (Reactive Nitrogen Species) RNS
Espécies reativas de oxigénio (Reactive Oxygen Species) ROS
Rotações por minuto rpm
Ácidos gordos saturados (Saturated Fatty Acids) SFA
Ácido tiobarbitúrico (Thiobarbituric acid) TBA
Substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico (Thiobarbituric Acid
Reactive Substances) TBARS
Taxa Relativa de Crescimento TRC
Cromatografia líquida ultra rápida UFLC
Relação volume/volume v/v
Relação massa/volume w/v
Resumo
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats xii
RESUMO
O macrofungo Lepista nuda (Bull), também conhecido como Clitocybe nuda,
pertence ao filo Basidiomycota, à classe Basidiomycetes, à ordem Agaricales, à família
Tricholomataceae e ao género Lepista, e tem como nome comum “pé-azul”. Trata-se de
um fungo comestível saprófita/decompositor com muito interesse comercial devido, não
só, ao seu valor nutricional, mas também ao seu aroma intenso e característico.
O objetivo do presente trabalho foi comparar a composição química e o
potencial antioxidante de amostras de Lepista nuda provenientes de diferentes habitats
do Nordeste de Portugal (corpos frutíferos silvestres provenientes de carvalhal e pinhal,
e comerciais), e do micélio obtido por cultura in vitro a partir dos corpos frutíferos
provenientes de prado e comerciais, usando cinco meios de cultura diferentes.
Pretendeu-se, ainda, analisar efeitos de condições de stresse, relativamente à
temperatura, no crescimento do micélio. Na determinação da composição química, deu-
se especial atenção aos voláteis, ácidos gordos, açúcares, ácidos orgânicos, compostos
fenólicos e tocoferóis. Na avaliação das propriedades antioxidantes determinou-se o
poder redutor, o efeito captador de radicais livres e a inibição da peroxidase lipídica em
homogeneizados cerebrais.
.Verificou-se que o micélio apresentou um maior crescimento radial e de massa
no meio MMN completo. Por outro lado, o micélio obtido a partir da amostra comercial
cresceu com maior rapidez em relação ao obtido a partir da amostra proveniente de
prado; mas foi o micélio obtido a partir dessa amostra que teve uma maior produção de
massa.
Nas condições de stresse, o fungo sujeito a altas temperaturas, só cresceu em
meio PACH; já a baixas temperaturas, cresceu em todos os meios de cultura testados.
Os compostos voláteis dos cogumelos têm sido pouco estudados, embora eles
contribuam significativamente para o sabor e propriedades organoléticas destas
espécies. Foram identificados 22 componentes voláteis nas amostras comerciais e
silvestres provenientes de carvalhal e pinhal, constituindo 84-94% da fração volátil. As
diferenças entre os voláteis das amostras silvestres e comercial foram principalmente
quantitativas. O linalol (17-26%), a pulegona (12-14%) e limoneno (10-11%) foram os
três principais componentes em todas as amostras. A grande diferença foi observada na
percentagem de 2-pentilfurano, presente em pequena quantidade nas amostras silvestres
(2% e 5% nas amostras provenientes de carvalhal e pinhal, respetivamente), mas em
Resumo
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats xiii
quantidade considerável na amostra comercial (15%), sendo o segundo componente
maioritário. Os compostos C8 são voláteis ubíquos entre fungos e responsáveis pelo seu
aroma; o 1-octen-3-ol tem sido descrito como o mais abundante. No entanto, no
presente estudo, este composto foi detetado em pequenas quantidades em todas as
amostras (2%), tendo sido o linalool, o limoneno e pulegona os componentes principais
nas amostras em estudo.
A amostra comercial revelou a maior contribuição energética, maior conteúdo de
PUFA, devido à contribuição de ácido linoleico, e também maior concentração de
compostos fenólicos. A amostra silvestre de carvalhal deu os maiores níveis de ácidos
orgânicos. As amostras de micélio mostraram ter níveis mais elevados de glucose,
tocoferóis e maior atividade antioxidante. Particularmente, o meio de cultura PACH
provou ser melhor para a produção de glucose, os meios de cultura PDA, PACH e FAD
para β e -tocoferóis, o meio de cultura MMN completo para compostos fenólicos e o
meio de cultura MMN incompleto para as propriedades antioxidantes.
No geral, a cultura in vitro poderia ser explorada para obtenção de compostos
bioativos de macrofungos para aplicações industriais, no controlo das condições
ambientais para produzir maiores quantidades desses compostos e com o intuito de
superar a diversidade na composição química observada em amostras recolhidas em
diferentes habitats.
Abstract
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats xiv
ABSTRACT
The macrofungi Lepista nuda (Bull), also known as Clitocybe nude belongs to
the phylum Basidiomycota, class Basidiomycetes, order Agaricales, family
Tricholomataceae and gender Lepista, and has the common name "blewit". It is an
edible saprophytic/decomposer fungus with high commercial interest due not only to its
nutritional value, but also to its intense and characteristic aroma.
The aim of this study was to compare the chemical composition and antioxidant
potential of samples of Lepista nuda from different habitats in the Northeast of Portugal
(commercial and wild fruiting bodies from oak and pine forests), and of the mycelium
obtained by in vitro culture from commercial and meadow wild fruiting bodies, using
five different culture media. Furthermore, the effects of stress conditions related to
temperature, on mycelia growth were also evaluated. In the chemical composition
evaluation, particular attention was given to the determination of volatile compounds,
fatty acids, sugars, organic acids, phenolic compounds, and tocopherols. Regarding the
antioxidant properties, reducing power, free radical scavenging effects and inhibition of
lipid peroxidation in brain homogenates were evaluated.
Mycelium cultured in solid complete Melin-Norkans medium showed the
highest growth and radial mass. Otherwise, the mycelium obtained from commercial
sample grew faster compared to the one obtained from wild meadow samples, but it was
the mycelium obtained from this sample that gave the highest mass production.
Under conditions of stress with high temperatures, the fungi only grew in
medium PACH; applying low temperatures, mycelia grown in all the tested culture
media.
Volatile compounds from mushrooms have been little studied, although they
contribute significantly to the flavour and organoleptic properties of these species.
Twenty two volatile components were identified in the commercial and wild samples
(obtained from oak and pine forests), constituting 84-94% of the volatile fraction. The
differences between the commercial and wild samples volatiles were mostly in
quantities. Linalool (17-26%), pulegone (12-14%) and limonene (10-11%) were the
main components in all the samples. The major difference was observed in the
percentage of 2-pentylfuran, present in small amounts in wild samples (2% and 5% in
samples from oak and pine forests, respectively), but in considerable amounts in the
commercial sample (15%), being the second main compound. C8 compounds are
Abstract
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats xv
ubiquitous volatiles in fungi and have been pointed out as responsible for their aroma;
1-octen-3-ol has been described as the most abundant. However, in this study, this
compound was detected in small amounts in all the samples (2%); linalool, limonene
and pulegone were the major components in the analyzed samples.
The commercial sample (cultivated) gave the highest energetic contribution and
PUFA contents due to the contribution of linoleic acid, as also of phenolic compounds;
the wild sample from oak forest gave the highest levels of organic acids. Mycelia
samples showed to have higher levels of glucose, tocopherols and antioxidant activity.
Particularly, PACH medium proved to be better for glucose production, PDA, PACH
and FAD for β- and -tocopherols, complete MMN for phenolic compounds and
incomplete MMN for antioxidant properties
Overall, in vitro culture could be explored to obtain bioactive compounds from
macro fungi for industrial applications, controlling environmental conditions to produce
higher amounts of these compounds and to overcome the diversity in chemical
composition observed in samples collected in different habitat.
Introdução
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 2
I. INTRODUÇÃO
1.1. Morfologia e classificação de fungos
Desde sempre que os fungos despertaram um grande interesse. Já desde os
tempos imemoriais que lhes são atribuídos inúmeros atributos, devido à sua estranha e
misteriosa vida, à sua diversidade de cores, de formas, aos aromas e sabores
característicos. Por várias vezes, tentou-se explicar a sua aparência peculiar e a sua
origem, sendo atribuído a fenómenos mágicos e até a intervenções do demónio (Keizer,
2000).
Para desmistificar o mistério em volta dos fungos e para os compreender iniciou-
se o estudo dos fungos - micologia, que surgiu como um ramo da botânica.
Historicamente, os fungos foram classificados e identificados como plantas inferiores,
da divisão Thallophyta por Linnaeus. Atualmente, estudos demostram que os fungos
têm características próprias, que são suficientemente e significativamente distintas,
permitindo assim criar um reino separado, o reino Myceteae (Chang & Miles, 2004).
Estima-se que existam cerca de 1,5 milhões de espécies de fungos na terra e
cerca de 100 000 espécies são conhecidas em todo o mundo, no qual 800 espécies estão,
atualmente designadas como novas espécies para a ciência (Hawksworth, 2001). Isto
torna os cogumelos, um dos recursos da biodiversidade menos estudados/explorados do
nosso planeta (Webster & Weber, 2007). Para além disso, existe uma grande variedade
dentro da mesma espécie, por exemplo, ao nível morfológico poderão ser similares, mas
ser distintos relativamente aos seus metabolitos. Ou seja, alguns metabolitos podem ser
produzidos por todas as variedades de uma espécie em particular e outros metabolitos
serem específicos de uma única variedade. No entanto, é importante referir que
dependendo das condições pelo qual o organismo se desenvolve, a sua composição
química pode alterar-se (Hanson, 2008).
Extraordinariamente, os fungos conquistaram em larga escala uma enorme série
de habitats, desempenhando diferentes e importantes papeis nos ecossistemas (Dix &
Webster, 1995). Os fungos são ubíquos em habitats terrestres e de água doce, mas
também existem no gelo do Antártico (Feofilova, 2001; Webster & Weber, 2007).
Detêm um importante papel na ecologia, reciclando o material orgânico, uma vez que
não conseguem produzir o seu próprio alimento, como as plantas, a partir de materiais
inorgânicos simples, como o dióxido de carbono, água, nitratos e usando a energia do
Introdução
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 3
sol. Assim, os fungos alimentam-se de material orgânico complexo (Chang & Miles,
2004; Webster & Weber, 2007; Hanson, 2008).
Os fungos são organismos eucariotas com um núcleo distinto, sem clorofila e
com uma nutrição heterotrófica. Ao contrário dos animais que se alimentam por
ingestão, os fungos obtêm os nutrientes através de digestão extracelular realizada por
enzimas excretadas, absorvendo os produtos solubilizados. Assim, os fungos podem ser
saprófitas, alimentam-se de matéria orgânica morta ou decomposição; parasitas,
colonizam animais, vegetais ou mesmo de outros fungos, vivendo à custa destes; e
simbiontes, que estabelecem uma associação de interesse com outros organismos vivos,
com benefícios mútuos (Frade & Alfonso, 2005; Webster & Weber, 2007; Hanson,
2008).
É comum dividir os fungos em dois grupos conforme a sua estrutura, os
unicelulares e os filamentosos. Os unicelulares são os mais abundantes na natureza,
como por exemplo as leveduras. Já os filamentosos são menos abundantes. Têm uma
estrutura tubular, que se denomina de hifas. As hifas podem crescer apenas nas pontas
ou regiões especializadas. Através de ramificações, e em algumas espécies, por meio de
anastomose ou fusão de hifas, é formada uma rede desses filamentos à qual se dá o
nome de micélio (Figura 1) (Chang & Miles, 2004). Geralmente são bastante uniformes
nos diferentes grupos taxonómicos dos fungos. Uma das poucas características que nos
permitem a sua distinção é a presença ou ausência de paredes transversais designadas
por septos (Webster & Weber, 2007).
A reprodução dos fungos ocorre por norma através de esporos, mas também
pode desenvolver-se de forma vegetativa, isto é, ocorre através de fragmentos de
micélio. Embora muitos esporos sejam disseminados pelo vento, outros podem
necessitar da intervenção de vetores como insetos ou outros animais. Desta forma,
podem ser pigmentados e alguns podem ter um revestimento gelatinoso de
polissacáridos para facilitar a sua disseminação por um “transportador” e a sua ligação a
um hospedeiro (Hanson, 2008).
Os cogumelos são a parte visível de determinados fungos (Martins, 2004).
Define-se cogumelo ou carpóforo como um macrofungo com um corpo frutífero distinto
que pode ser epígeo (acima do solo) ou hipógeo (dentro do solo) e suficientemente
grande para ser visto a olho nu (Chang & Miles, 2004).
A estrutura que normalmente se chama de cogumelo é na realidade o corpo
frutífero do fungo (Figura 1) (Chang & Miles, 2004); o tipo mais comum de cogumelo é
Introdução
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 4
em forma de guarda-chuva, com píleo e estipe, e algumas espécies têm adicionalmente
um anel, uma volva, ou ambos. Por baixo do chapéu apresentam uma superfície de
consistência mole, o himénio (que pode apresentar diferentes formas: lâminas ou
lamelas, tubos ou poros, pregas mais ou menos definidas, superfícies lisas, entre outras),
onde se produzem os esporos (Martins, 2004). Contudo, esta estrutura não se aplica a
todas as espécies; alguns cogumelos são em forma de taças flexíveis, outros são
redondos como bolas de golfe, existem ainda aqueles que se assemelham a uma orelha
humana. Existe pois, uma grande variedade de formas (Chang & Miles, 2004).
Figura 1. Representação do corpo frutífero, micélio e hifas (Web 1).
Em 1969, Whittaker propôs uma classificação dos organismos em cinco reinos
em que pela primeira vez os fungos aparecem como um reino à parte (Figura 2). No
entanto, estudos novos levaram à descoberta que, a nível molecular, a vida na terra pode
ser classificada em três grupos, designados por domínios, dos quais dois são
procarióticos e o terceiro eucariótico. Os fungos são, assim, reconhecidos como um dos
cinco reinos eucariotas, sendo os outros Animalia, Plantae, Chromista e Protozoa
(Carlile et al., 2001). Atualmente, a classificação retirou do Reino Fungi todos os
organismos que possuem celulose na sua parede e reestruturou a classificação dos seres
vivos. O reino Fungi mantém-se mas, com alterações.
Introdução
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 5
Figura 2. Divisão dos organismos proposta por Whittaker (1969) (Web 2).
O reino dos fungos foi recentemente dividido em sete filos: Chytridiomycota,
Zygomycota, Blastocladiomycota, Neocallimatigomycota Glomeromycota, Ascomycota
e Basidiomycota (Seif et al., 2005; James et al., 2006a; James et al., 2006b).
O fungo estudado neste trabalho pertence ao filo Basidiomycota, classe
Agaricomycetes. O filo Basidiomycota é composto por cerca de 30000 espécies. Grande
parte dos cogumelos comestíveis e tóxicos pertencem a este grupo constituído por
espécies terrestres, aquáticas e também espécies microscópicas que parasitam plantas. A
maioria é saprófita e está envolvida na decomposição da matéria morta e madeira, mas
há também agentes patogénicos das árvores (Webster & Weber, 2007).
São fungos nos quais o processo sexual envolve a produção de basidiósporos
(Figura 3), contidos num basídio, nos quais o núcleo sofre meiose. Geralmente, existem
quatro esporos por basídio (Worrall, 1999).
Introdução
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 6
Figura 3. Estrutura do micélio e os basidiósporos suspensos no chapéu do cogumelo (Web 3).
A maioria dos fungos identificados no campo e nos bosques são da classe
Agaricomycetes. A nível microscópio, nesta classe existem duas particularidades muito
vulgarizadas pelo grupo que caracterizaram. Uma dessas particularidades é presença de
“clamp connections”, que aparentemente ligam células adjacentes ou hifas. A outra
particularidade é que os basidiósporos são normalmente balistosporos, ou seja, são
ativamente lançados do basídio. A classificação dos Agaricomycetes é um pouco
controversa. Antes consideravam-se três classes inseridas no Filo Basidiomycota:
Basidiomycetes, Teliomycetes e Ustomycetes. Hoje, a designação Basidiomycetes torna-
se antiquada e, quando utilizada, refere-se ao Filo Basidiomycota. Assim, os
Basidiomycetes são atualmente classificados como Agaricomycetes (Carlile et al.,
2001).
Existem várias ordens dentro dos macrofungos Agaricomycetes tais como os
Agaricales, Boletales, entre outros (Tabela 1). Os fungos pertencentes à família
Trichololataceae têm como características aspeto fibroso, chapéu, pé cilíndrico e
esporos brancos. São abundantes os géneros Lepista, Calocybe, Clitocybes, Pleurotus,
Leucopaxillus e Marasmius, mas também têm alguns fungos micorrízicos (Tricholoma e
Hygrophorus) e parasíticos (Armillaria) (Rueda, 2007).
Introdução
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 7
Tabela 1. Classificação dos fungos do Filo Basidiomycota (Kirk et al., 2008).
Reino Filo Sub-filo Classes Ordens Famílias Género F
un
gi
Ba
sid
iom
yco
ta
Agaricomycotina
Agaricomycetes
Agaricales Trichololataceae Lepista
Atheliales
Auricularialis
Boletales
Cantharellales
Corticiales
Geastrales
Gomphales
Hymenochetales
Hysterangialis
Phallales
Polyporales
Russulales
Sebacinales
Thelephorales
Dacrymycetes
Tremellomycetes
Pucciniomycotina
Agaricostilbomycetes
Atractiellomycetes
Classiculomycetes
Cryptomycocolacomycetes
Cystobasidiomycetes
Microbotryomycetes
Mixiomycetes
Pucciniomycetes
Ustilaginomycotina
Exobasidiomycetes
Entorrhizomycetes
Ustilaginomyce
1.2. Produção de macrofungos
A produção mundial de cogumelos cultivados em 2000/2001 foi estimada por
algumas autoridades em mais de 9 milhões de toneladas. Um estudo não oficial de 2001
indica uma produção de 7.818.000 toneladas de cogumelos cultivados na China. É de
salientar que os números de produção em cada país não estão facilmente disponíveis
Introdução
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 8
(Chang & Miles, 2004). No geral, a produção mundial de cogumelos aumentou mais de
12,5 por cento entre 1981 e 2002 (Web 4). Em Portugal a produção de macrofungos em
2009, já era considerável, com alguma variedade de cogumelos comestíveis produzidos
e comercializados (Figura 4).
Figura 4. Produção de diversos macrofungos em Portugal (Quadrante Natural, 2010).
Em laboratório, a obtenção e estabelecimento de fungos, particularmente dos
Agaricomycetes, é possível por excisão de porções do corpo frutífero e colocação destas
em meio de cultura apropriado. O crescimento contínuo e ramificado das hifas resulta
na produção de micélio indiferenciado na superfície e interior do meio de cultura com
agar. Este processo de crescimento do micélio é um pouco invasivo mas é o mais
eficiente para que os fungos se disseminem por todo o substrato. A colónia geralmente
continua a crescer radialmente, a uma taxa uniforme até encontrar um impedimento (por
exemplo, o bordo da caixa de Petri ou outra colónia). Contudo, a taxa de crescimento
pode diminuir gradualmente e o crescimento pode mesmo cessar sem que todo o meio
seja consumido. Este efeito pode dever-se à produção de metabolitos tóxicos
nomeadamente, iões de hidrogénio ou amónia. No entanto é de referir, que em vez de se
expandirem, como durante o crescimento pelo meio, as hifas podem agregar-se (Carlile
et al., 2001). Não existe grande conhecimento sobre os fatores que levam a um
Introdução
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 9
crescimento sincronizado das hifas em grupo. No entanto, especula-se que se baseia no
desenvolvimento de hifas adjacentes, em que uma dada hifa é capaz de induzir a
expressão génica de hifas adjacentes, através de secreções de mensageiros químicos
(Moore, 1994).
A metodologia in vitro de cultura (produção de micélios) pode proporcionar
diversas vantagens na obtenção e estudo de compostos bioativos, facilitando a sua
extração e purificação o que aumenta o seu valor económico. Do ponto de vista
ecológico, a cultura in vitro evita a sob exploração de espécies ameaçadas ou raras, o
que representa uma metodologia promissora que salvaguarda a conservação sustentável
e utilização racional da biodiversidade (Matkowski, 2008).
O meio de cultura utilizado para o desenvolvimento do fungo pode ser natural ou
sintético. Um meio de cultura sintético tem uma fonte de carbono (normalmente um
açúcar) e uma fonte de azoto (por exemplo, um sal amónio). A produção de metabolitos
pode ser bastante sensível aos constituintes do meio de cultura, tal como às condições
do meio ambiente quando in vivo; assim, os metabolitos produzidos por uma mesma
espécie num determinado meio de cultura, podem ser diferentes quando desenvolvida
num meio de cultura diferente (Hanson, 2008).
Os fungos, no decurso da evolução, diversificaram a exploração de uma grande
variedade de habitats. Espécies diferentes, portanto, exigem diferentes condições de
crescimento ideal. O modo como os fatores físicos e químicos afetam o crescimento de
fungos diferentes tem que ser considerado. A temperatura, a concentração de iões de
hidrogénio (pH), a humidade e a luz são alguns dos parâmetros que têm de ser mantidos
e controlados (Carlile et al., 2001; Chang & Miles, 2004).
De todos os fatores que afetam o crescimento de fungos, a temperatura é
certamente um dos mais importantes, e o mais frequentemente estudado. Os extremos
de temperatura (máxima e mínima) são de grande importância na determinação da
sobrevivência e na distribuição das espécies de fungos na natureza. A temperatura ótima
para o crescimento, produção de metabolitos e esporulação são os fatores de interesse
mais frequentes para os investigadores.
Um aumento na temperatura, geralmente, aumenta a atividade enzimática.
Temperaturas altas resultam numa inativação enzimática, com um efeito resultante
sobre o metabolismo e, consequentemente, sobre o crescimento. Por exemplo, a
incapacidade de um fungo crescer a uma temperatura elevada pode ser o resultado da
sua incapacidade para sintetizar uma determinada enzima.
Introdução
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 10
Os fungos são classificados de acordo com as suas temperaturas ideais:
Psicrófilos - com um mínimo de crescimento abaixo de 0 °C, um ótimo
na faixa de 17 °C, e a ausência de crescimento a temperaturas superiores
a 20 °C;
Mesófilos - com mínimo de crescimento acima de 0 °C, máximo abaixo
de 50 °C, e a ótima entre 15 e 40 º C (sendo este o maior grupo);
Termófilos - com mínima acima de 20 °C, máxima de 50 °C ou superior
e ótima em torno de 35 °C ou superior. (Chang & Miles, 2004).
O pH também tem grandes efeitos sobre o desenvolvimento morfológico. Em
geral, a maioria dos fungos cresce melhor num meio ligeiramente ácido, normalmente
numa gama de pH 4 a pH 8. Naturalmente, a gama de pH pode variar de espécies para
espécie. Os fungos estão aptos para lidar com mudanças de pH externo, reagindo
melhor do que as células de plantas ou de animais nos seus ambientes protegidos. Nos
fungos, o pH citoplasmático varia muito pouco ao longo de uma vasta gama de valores
de pH extremos. Não está completamente esclarecido como o pH citoplasmático é
estável próximo da neutralidade. Existe uma falta de informação sobre o efeito do pH
no crescimento de fungos, ao contrário de uma literatura considerável sobre o
crescimento em relação ao pH inicial do meio. A concentração hidrogeniónica num
meio pode afetar o crescimento indiretamente, pelo seu efeito na disponibilidade de
nutrientes, ou diretamente através de uma ação sobre as superfícies celulares. É
provável que, sendo satisfeitos os requisitos nutricionais, a maioria dos fungos se
desenvolva bem numa ampla gama de pH desde ácido até à neutralidade, por exemplo,
pH 4-7. Alguns fungos, tais como os que produzem ácidos orgânicos, são capazes de
tolerar mais condições de acidez (Carlile et al., 2001; Chang & Miles, 2004).
Os fungos, na sua maioria, são expostos a períodos alternados de luz e escuridão.
Alguns, contudo, estão situados na escuridão do solo (trufas) ou dentro dos tecidos de
um hospedeiro. O crescimento da maioria dos fungos não é sensível à luz, no entanto,
luz forte pode inibir o seu crescimento (possivelmente devido a um efeito de
temperatura). Tem sido reportado que esta inibição por uma luz forte pode ser eliminada
pela adição de compostos biológicos ao meio, tais como extrato de levedura. Uma
possível interpretação deste fenómeno é a de que a luz pode destruir certas vitaminas. O
papel mais importante da luz no crescimento de fungos está relacionado com a
Introdução
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 11
formação de estruturas reprodutivas. O desenvolvimento dos corpos frutíferos de
Basidiomycetes é, muitas vezes, acionado pela luz (Chang & Miles, 2004).
A maioria dos fungos, principalmente Basidiomycetes, necessita de altos níveis
de humidade (e.g. uma humidade relativa de 95 a 100% e um teor de humidade do
substrato entre os 50 e 75%) (Chang & Miles, 2004).
1.3. O macrofungo Lepista nuda
O macrofungo Lepista nuda, (Bull. ex Fr). Cooke também conhecido como
Clitocybe nuda e, vulgarmente por “Pé-azul”, pertence ao filo Basidiomycota, à classe
Basidiomycetes, à ordem Agaricale, à família Tricholomataceae e ao género Lepista
(Figura 5). Encontra-se habitualmente em montados, prados e florestas naturais,
azinheiras e sobreiros, o seu período de frutificação é no Outono, Inverno e Primavera;
sabe-se também que é saprófita/decompositor. É um fungo comestível, o que lhe
confere um interesse comercial devido não só, ao seu valor nutricional, mas também ao
seu intenso e característico aroma (Rueda, 2007).
Figura 5. Macrofungo Lepista nuda (Web 5).
É o segundo fungo comestível mais popular na Europa Central. Na França, tem
um potencial económico bastante considerável (Stott et al., 2005). Já em Portugal,
apesar de não ser uma referência de produção em grande quantidade (Figura 4), é o
segundo cogumelo mais caro.
Trata-se de um cogumelo comestível que apresenta inúmeras qualidades
organoléticas, incluindo um sabor delicado e uma boa conservação pós-colheita, aspetos
importantes que influenciam as vendas e os preços dos cogumelos (Guinberteau et al.,
Introdução
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 12
1989). O seu aroma forte, a sua textura e coloração violeta apresentam alguma
originalidade que estimula o consumo e, até mesmo, o cultivo deste cogumelo (Audouin
et al, 1989, Noel-Suberville, 1996). O corpo frutífero de L. nuda contém vitamina B1,
triterpenoides, esteróis e compostos organo-halogenados. A sua infusão é utilizada para
prevenir o beribéri, enquanto a decocção é utilizada para o tratamento de abscessos e
feridas. O extrato metanólico revelou propriedades antimicrobianas (Dulger, et al, 2022;
Barros et al., 2008) e antioxidantes (Elmastas et al., 2007; Barros et al., 2008).
Importa ainda destacar que, segundo vários autores, as propriedades químicas ou
bioativas dos macrofungos podem ser afetadas pelo habitat em que cresceram
(Nikkarinen & Mertanen, 2004; Pereira et al., 2012).
1.4. Compostos voláteis em macrofungos
Alguns compostos voláteis nos cogumelos contribuem para as suas propriedades
organoléticas; outros comportam-se como atraentes de insetos ou impedem a nutrição
do fungo. Existem ainda outros compostos que contribuem para a relação de um fungo
com os seus concorrentes.
Embora os voláteis, nomeadamente monoterpenos e compostos aromáticos
simples, sejam produzidos por fungos, são mais abundantes em plantas. Os fungos
produzem diferentes proporções dos componentes comuns voláteis. Alguns organismos
têm um odor característico que pode ser usado para os identificar. A tecnologia de
espectrometria de massa acoplada com nariz eletrónico tem sido utilizada para
rapidamente revelar a presença de fungos indesejados em alimentos tais como cereais e
produtos de panificação (Hanson, 2008).
Os óleos essenciais, também designados por essências, são misturas complexas
de inúmeros compostos voláteis com propriedades odoríferas e outras características de
interesse para o Homem. Atualmente, o consumo de óleos essenciais é tão impercetível
quanto omnipresente, mas a sua importância pode ser comprovada pelas 45 000 a 50
000 toneladas que são produzidas e transacionadas anualmente. A nível mundial, o
valor económico dos óleos essenciais reflete-se nos óleos que são obtidos para usos
terapêuticos (farmacológicos), perfumarias, cosmética, indústrias alimentares,
fabrico/produção de sabonetes, detergentes, entre outros. A variabilidade química dos
compostos voláteis advém dos diversos fatores que influenciam a sua biossíntese,
existindo mesmo quimiotipos definidos pelas percentagens de óleos essenciais com
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Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 13
composições muito distintas. Esses fatores são de natureza diversa: alguns como os
ambientais ou edáficos e outros da fisiologia dos seres vivos que os produzem. A
insolação, a relação temperatura, humidade do ar e o tipo de solo são, dos fatores
edafoclimáticos, os que mais afetam a produção dos óleos essenciais (Cunha, 2005;
Cunha et al, 2007).
A indústria recorre a diversas metodologias para extrair os compostos voláteis
dos seres vivos. A destilação é das metodologias mais usadas para a extração dos
compostos voláteis. O conceito de óleo essencial, enquanto mistura volátil obtida por
destilação, é ultrapassado e outros métodos de extração são utilizados para o isolamento
de compostos voláteis com vista a diferentes estudos. A hidrodestilação é a metodologia
mais utilizada; por um lado, porque permite a diferença de escalas, permite reproduzir
as técnicas usadas nos processos industriais e obter óleos essenciais com características
similares, mas por outro lado porque os destiladores são isentos de compostos
orgânicos, simplificando os processos de preparação de amostras para fins analíticos. A
simplicidade e funcionamento do destilador proposto para esse fim, o aparelho
Clevenger modificado inscrito na Farmacopeia Portuguesa VIII (Figura 6), fez com que
fosse bem aceite pelos investigadores. Outra metodologia usada é a destilação-extração
em aparelho de Likens-Nickerson (LN) (Figura 7), técnica usada neste trabalho. Nesta
técnica, o vapor gerado na hidrodestilação é sujeito a extração pelo vapor de um
solvente orgânico apolar de baixo ponto de ebulição e imiscível com a água (e.g., o
pentano). Durante o processo, os compostos voláteis são arrastados pelo vapor de água e
retirados da fase orgânica, o que limita os artefactos e as perdas devidas ao refluxo da
fase aquosa condensada e à cristalização nas superfícies do condensador. No entanto,
não evita a decomposição de compostos termolábeis mas tem a desvantagem, em
relação à hidrodestilação, do óleo essencial ser obtido em solução e que, para ser
recuperado, implica a remoção do solvente (Cunha, 2005).
Introdução
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 14
Figura 6. Aparelho de Clevenger modificado.
Figura 7. Aparelho de destilação-extração Likens-Nickerson.
Como referido anteriormente, os óleos essenciais são misturas complexas de
compostos voláteis, muitas vezes com centenas de constituintes de todas as classes
Introdução
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 15
funcionais e onde coexistem isómeros geométricos, posicionais e óticos, com
propriedades físicas e químicas similares. Para além das dificuldades que decorrem da
complexidade química, também acrescem as que resultam da existência frequente de um
elevado número de componentes minoritários e vestigiais que podem ser responsáveis
pelas propriedades biológicas e sensoriais. Assim, a escolha da metodologia analítica
depende da finalidade do estudo. Devido à enorme diversidade e complexidade das
misturas, por norma, a análise envolve duas etapas sequenciais, como o fracionamento
das amostras e/ou a individualização de constituintes, geralmente, por recurso a
métodos cromatográficos, seguidos de processos analíticos, químicos ou
espectroscópicos nas frações ou compostos isolados. O recurso a um único método pode
não ser suficiente para viabilizar a melhor análise e garantir a obtenção máxima de
informação sobre a composição da amostra (Cunha, 2005).
Atualmente, a cromatografia gasosa (GC) é o método mais comum na separação
de compostos permitindo a análise até a um máximo de 1500 unidades de massa; os
compostos com massa molecular muito baixa, considerados gases permanentes (até às
200 unidades de massa), são considerados compostos voláteis e, a partir destas
unidades, são compostos semi-voláteis. Segundo Marriott (2001), a GC é o método
analítico mais apropriado para a separação dos compostos dos óleos essenciais apesar
das inúmeras estruturas com diferentes modificações químicas que levam a
sobreposições nos índices de retenção. Esta metodologia de separação é complementada
com a espectrometria de massa (GC-MS) para identificação dos compostos,
metodologia também usada neste trabalho para identificação de compostos voláteis. Os
cogumelos têm sido muito utilizados como alimento ou materiais aromatizantes por
causa do seu excecional sabor/odor e, por essa razão, têm sido extensivamente
estudados (Wojtasiak, 2004). Os compostos voláteis presentes nos cogumelos têm sido
também investigados, com a identificação de quase 150 compostos voláteis diferentes
em várias espécies. Entre os diversos componentes voláteis, uma série de compostos
alifáticos C8 (compostos oxigenados), tais como o 1-octen-3-ol (Figura 8), 2-octen-1-ol,
3-octanol, 1-octanol, 1-octen-3-ona e 3-octanona, foram referidos como sendo os
principais responsáveis pelas características de sabor dos cogumelos. Os perfis dos
componentes voláteis podem variar com as espécies, mas também podem ser
influenciados pelas condições de cultivo/habitat (Cho et al., 2008). Alguns aromas
típicos agradáveis ou desagradáveis de cogumelos são também devido a compostos
alifáticos, aromáticos e heterocíclicos voláteis, por exemplo, sulfureto de dimetilo,
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Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 16
benzaldeído, álcool benzílico, (E)-2-nonenal, lactonas e escatol (3-metilindole)
(Breheret et al., 1997).
Figura 8. Estrutura química do 1-octen-3-ol (Web 6).
1.5. Macrofungos como fonte de compostos bioativos
Do ponto de vista nutricional, os cogumelos são conhecidos em todo o mundo
por serem ricos em água, minerais, proteínas, fibras e glúcidos, e por serem alimentos
de baixo teor calórico, devido ao reduzido teor em lípidos. Existem disponíveis na
literatura vários estudos que descrevem a análise de nutrientes em diferentes espécies de
cogumelos provenientes de todo o mundo (Kalač, 2009; Ouzouni et al., 2009). Em
Portugal, o grupo de investigação em que se inseriu este trabalho, tem-se dedicado ao
estudo de espécies provenientes do Nordeste de Portugal, uma das regiões europeias
com maior biodiversidade de cogumelos silvestres, a maioria deles com grande
importância gastronómica (Barros et al., 2007; Barros et al., 2008; Heleno et al., 2009;
Heleno et al., 2011; Pereira et al., 2012). Além disso, vários estudos concluíram que os
cogumelos possuem compostos bioativos nomeadamente antioxidantes: compostos
fenólicos, tocoferóis, ácido ascórbico e carotenoides (Ferreira et al., 2009). Por essa
razão, os cogumelos têm sido reconhecidos como alimentos funcionais e como fonte
para o desenvolvimento de medicamentos e nutracêuticos.
Dos compostos fenólicos fazem parte um grande grupo de compostos como:
ácidos fenólicos, cumarinas e flavonoides, que na sua maioria são antioxidantes. Os
compostos fenólicos são produtos naturais que derivam das vias do xiquimato e do
acetato, podendo assim conter moléculas muito simples, como os ácidos fenólicos, ou
moléculas complexas, como lenhinas (Bravo, 1998). Vários estudos têm revelado que
os ácidos fenólicos são os principais compostos fenólicos nos cogumelos (Ferreira et al.,
2009).
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A eficácia de um antioxidante fenólico natural depende da reação do hidrogénio
fenólico, isto é da estabilidade do radical que se forma durante a reação, mas também da
substituição química presente na estrutura da molécula (Hall, 2001; Wright et al., 2001).
Os tocoferóis, mais conhecidos por vitamina E, podem ser encontrados em
alimentos “gordos”, pois é uma vitamina lipossolúvel. Estruturalmente tem um anel
cromanol e uma cadeia lateral de unidades isopreno. Na natureza, pode ser encontrada
de quatro formas diferentes: α-, β-, γ- e δ- tocoferóis (Figura 9), sendo o α- tocoferol a
forma antioxidante mais amplamente distribuída. Os tocoferóis têm sido reconhecidos
como um dos mais importantes antioxidantes, isto deve-se à sua capacidade de captar
radicais, isto é, eles inibem a produção de radicais peroxilo lipídicos produzidos por
espécies reativas de oxigénio (ROS), protegendo assim as células da peroxidação dos
ácidos gordos polinsaturados (PUFA) (Fang et al., 2002; Pinto, 2010).
Figura 9. Estrutura química dos tocoferóis.
Os carotenoides são, de uma maneira geral, tetraterpenos que compreendem
compostos formados por ligações de oito unidades isoprénicas, que possuem no mínimo
dez duplas ligações conjugadas, o que lhe confere uma grande sensibilidade à oxidação
e a sua tonalidade característica, amarela ou laranja. Estes compostos podem ser ainda
acílicos, como por exemplo o licopeno (C40H56), composto apenas constituído por
carbonos e hidrogénios, mas também terem na sua composição um ou dois anéis penta
ou hexacíclicos numa das extremidades ou nas duas.
Do ponto de vista químico, os carotenoides podem dividir-se em carotenos,
compostos só com carbonos e hidrogénios (e.g., licopeno, referido anteriormente) e os
Introdução
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seus derivados oxigenados, as xantofilas. Os carotenoides são corantes naturais, que
podem ser encontrados nos alimentos com pigmentação amarela, laranja ou vermelha
(tomates, laranjas, abóboras, entre outros). Alguns carotenoides, além de serem
precursores de vitamina A (retinol), possuem propriedades antioxidantes e melhoram a
resposta imunológica (Cunha, 2005; Pinto, 2010).
As propriedades antioxidantes dos carotenoides fundamentam-se na sua
estrutura, principalmente no sistema de ligações duplas conjugadas (Cunha, 2005),
tornando possível a captação de radicais livres, principalmente o radical peroxilo
(LOO•) (Young & Lowe, 2001; Tapiero et al., 2004). Atualmente existe interesse no
estudo dos antioxidantes devido, principalmente, às descobertas sobre o efeito dos
radicais livres no organismo, pois a oxidação é parte importante da vida de muitos
organismos nomeadamente, durante a produção de energia que ocorre nos processos
biológicos. Os radicais livres são produzidos naturalmente ou por alguma disfunção
biológica (Barreiros et al., 2006).
Assim, um radical livre é definido como qualquer átomo ou molécula que possui
eletrões desemparelhados na orbital exterior (Gutteridge & Halliwell, 2000). Os radicais
livres de oxigénio e de azoto, ou mais genericamente, espécies reativas de oxigénio
(ROS) e de azoto (RNS) são os produtos do metabolismo celular, em condições
normais. Estes radicais são muito instáveis e muito reativos (Miller et al., 1990). As
ROS e RNS têm características benéficas e prejudiciais nos organismos vivos. Em
concentrações baixas atuam nas respostas celulares a danos infeciosos e na indução de
respostas mitogénicas, sendo benéficas para os organismos. Os efeitos prejudiciais
traduzem-se no stresse oxidativo e nitrosativo que ocorrem quando há uma
sobreprodução de ROS e RNS, ou quando não existem antioxidantes enzimáticos ou
estão em concentrações muito baixas (Valko et al., 2007). O equilíbrio da produção de
radicais livres e das defesas antioxidantes (enzimáticas e não enzimáticas), são uma
condição importante para o normal funcionamento do organismo.
O excesso de radicais livres, como já referido, é prejudicial, pois pode provocar
danos ao nível dos lípidos celulares, proteínas e DNA, o que afeta o funcionamento dito
normal das células, gerando inúmeras doenças. Assim, a presença de antioxidantes
numa dieta rica de vegetais e fruta com vitaminas A, C e E, carotenoides, polifenóis e
flavonoides pode ajudar o sistema de defesa endógeno, a reduzir os danos oxidativos
(Temple, 2000; Fang et al., 2002; Liu, 2003).
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Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 19
Não só os corpos frutíferos, mas também os micélios acumulam vários dos
compostos bioativos referidos (Lindequist et al., 2005) que podem ser isolados para
posteriores utilizações.
1.6. Objetivos
No presente trabalho estudaram-se exemplares (corpos frutíferos) comerciais e
silvestres de Lepista nuda provenientes de diferentes habitats – carvalhal, pinhal e
prado (amostras in vivo), bem como o micélio produzido in vitro a partir desses
exemplares.
Os principais objetivos foram:
i) Estabelecer as condições ótimas para a cultura in vitro de Lepista nuda, com
base nas curvas de crescimento do micélio, obtidas a partir do crescimento radial e das
massas fresca e seca;
ii) Caracterizar os voláteis das amostras obtidas in vivo e in vitro após
destilação-extração Likens-Nickerson (LN); a análise dos voláteis foi feita por
cromatografia gasosa (GC) e cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa
(GC-MS).
iii) Caracterizar os ácidos gordos, açúcares, ácidos orgânicos, compostos
fenólicos e tocoferóis das mesmas amostras após extração sólido-líquido e análise por
cromatografia gasosa acoplada a deteção por ionização de chama (GC-FID) ou
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) acoplada a deteção por índice de
refração (RI), díodos (DAD) ou fluorescência.
iv) Avaliar as propriedades antioxidantes, utilizando técnicas químicas e
bioquímicas: poder redutor, efeito captador de radicais livres e inibição da peroxidação
lipídica em homogeneizados cerebrais.
Em suma, foi feita uma comparação dos resultados da composição química e do
potencial antioxidante de corpos frutíferos de Lepista nuda provenientes de diferentes
habitats, e do seu micélio obtido por cultura in vitro usando distintos meios de cultura.
Material e Métodos
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 21
II. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Material biológico e preparação das amostras
2.1.1. Corpos frutíferos silvestres e comerciais
Os exemplares (corpos frutíferos) da espécie de cogumelo silvestre Lepista nuda
(Figura 10) foram obtidos em diferentes habitats: prado, pinhal e carvalhal, na região de
Bragança (Nordeste Transmontano), no outono de 2010 e 2011 e na primavera de 2011.
As espécies comerciais foram obtidas num supermercado local, em setembro de 2011. A
identificação taxonómica dos esporocarpos foi realizada de acordo com Moser (1983),
sendo depositados exemplares no herbário da Escola Superior Agrária do Instituto
Politécnico de Bragança. As amostras dos corpos frutíferos foram liofilizadas (FreeZone
4.5 model 7750031, Labconco) e por fim reduzidas a pó.
Figura 10. Frutificações de Lepista nuda (Web 7).
2.1.2. Produção in vitro do micélio
O micélio, obtido através do esporocarpo de cada corpo frutífero (Figura 11) em
condições de assepsia em câmara de fluxo laminar, foi isolado em cinco meios de
cultura diferentes: meio sólido Melin-Norkans modificado (MMN completo; Anexo 6.1)
pH 6,6 (Marx, 1969), meio sólido incompleto (MMN incompleto; Anexo 6.2) pH 6,6
Material e Métodos
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 22
(Marx, 1969), meio Potato Dextrose Agar (PDA; Anexo 6.3) pH 5,6 (Biolab), meio
Pachlewski (PACH; Anexo 6.4) pH 5,4 (Pachlewski & Pachlewski, 1974), e meio Ferry
& Das (FAD; Anexo 6.5) pH 5,0 (Ferry & Das, 1968). As amostras foram mantidas em
placas de Petri (8 cm de diâmetro) contendo os meios referidos anteriormente e foram
armazenados no escuro, à temperatura de 25ºC.
Figura 11. Excisão de porções do corpo frutífero (Quadrante Natural, 2010).
Depois da incubação, o crescimento contínuo e ramificado das hifas resultou na
produção de micélio indiferenciado na superfície e interior do meio de cultura (Figura
12).
Material e Métodos
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 23
Figura 12. Crescimento contínuo e ramificado das hifas nos diferentes meios de cultura.
2.2. Avaliação do crescimento do micélio em diferentes meios de cultura
sólidos
2.2.1. Determinação da curva de crescimento do micélio de Lepista nuda
com base no raio obtido em diferentes meios de cultura sólidos
Na determinação da curva de crescimento em diferentes meios de cultura,
usaram-se os meios anteriormente referidos (MMN completo; MMN incompleto;
PACH; FAD e PAD). Transferiu-se o micélio das amostras de L. nuda obtidas em prado
e comerciais, de placas em que o inóculo se encontrava em crescimento em meio de
cultura MMN completo, para placas de 8 cm de diâmetro. Em cada placa, com os meios
de cultura referidos anteriormente, foi colocado um inóculo, no centro destas,
recorrendo ao auxílio de um bisturi estéril numa câmara de fluxo laminar em condições
de assepsia. O inóculo era de pequeno diâmetro (~0,5 cm). As placas foram
Ampliação 0,75x
Ampliação 0,65x
Ampliação 1,25x
Ampliação 1,25x
Ampliação 1,25x
Ampliação 1,25x
Ampliação 0,30x Ampliação 0,44x
Material e Métodos
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 24
devidamente identificadas, marcadas e divididas em quatro partes (R1, R2, R3 e R4; em
que cada raio media cerca 4 cm), para efetuar as medições (Figura 13).
A primeira medição foi efetuada ao fim de três dias, e posteriormente, de dois
em dois dias. A medição do crescimento terminou quando o micélio atingiu o limite da
placa de Petri, 8 cm de diâmetro (Figura 14).
Figura 13. Esquema representativo do procedimento usado na placa de Petri para a determinação da
curva de crescimento do micélio de Lepista nuda.
Figura 14. Determinação da curva de crescimento do micélio de Lepista nuda em diferentes meios de
cultura.
Obteve-se a média dos dados e realizou-se uma análise da Taxa Relativa de
Crescimento (TRC) a partir da fórmula (Coelho, 1999):
( )
Ampliação 0,41x Ampliação 0,62x
Material e Métodos
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 25
Sendo cw1= Inóculo inicial usado, (T0=0,25 cm) e cw2= Crescimento do micélio
por raio ao fim de 21 dias e o Número de dias de crescimento= 21 dias.
A determinação da curva de crescimento foi realizada pela média dos quatro
raios, nos diferentes meios, referidos anteriormente.
Sendo cw1= Inóculo inicial usado, (T0= 0,25 cm) e cw2= Crescimento do
micélio por raio ao fim de 21 dias e o Número de dias de crescimento= 21 dias. A
determinação da curva de crescimento foi realizada pela média dos quatro raios, nos
diferentes meios referidos anteriormente.
2.2.2. Determinação da curva de crescimento do micélio de Lepista nuda
com base nas massas fresca e seca obtidas em diferentes meios de
cultura sólidos
Na determinação da curva de crescimento, por massa de micélio em crescimento
(massa fresca e massa seca), os meios de cultura e as amostras usadas foram as mesmas
referidas anteriormente: MMN completo, MMN incompleto, PACH, FAD e PDA; e
amostras de L. nuda provenientes de prado e comerciais. Em cada placa de Petri,
aplicou-se uma pelicula de celofane para assim poder facilmente separar o micélio do
meio de cultura (Figura 15).
Para a realização do procedimento, o inóculo usado foi retirado de placas com
meio MMN completo. Determinou-se a massa inicial do inóculo (no tempo zero). Foi,
posteriormente, colocado em placas de 8 cm de diâmetro devidamente identificadas.
Determinou-se a massa ao fim de 72h (3 dias) e, depois, de 48 em 48h (2 dias)
durante três semanas (21 dias). Em cada pesagem de micélio fresco (massa fresca, fw),
removeu-se a película de celofane e colocou-se numa estufa, a 60ºC durante 72h para
obter a massa seca (dw) da amostra.
A determinação da curva de crescimento nos diferentes meios de cultura foi
obtida pela massa fresca e seca do micélio, a partir da média obtida nos diferentes dias
de crescimento. Construíram-se gráficos com a massa média fresca e seca nos diferentes
meios de cultura e nas diferentes amostras referidas anteriormente.
Material e Métodos
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 26
Calculou-se a Taxa Relativa de Crescimento (RGR) (Coelho, 1999), a partir da
fórmula:
( )
Sendo dw1= massa seca no 1º semana e dw2= massa seca na última semana.
Figura 15. Inóculo em celofane usado na determinação das massas de micélio.
2.2.3. Aplicação de condições de stresse à amostra comercial em
diferentes meios de cultura sólidos
Inóculos de micélio da amostra comercial foram colocados em 20 placas de Petri
com diferentes meios de cultura (MMN completo, MMN incompleto, PACH, FAD e
PDA). 10 Placas de Petri com o inóculo foram colocadas numa estufa a 37ºC e as
restantes 10 foram colocadas num frigorífico a 4ºC (mantidas no escuro durante 30 dias)
(Figura 16), tendo-se verificado as suas condições de manutenção e a reação dos
Ampliação 0,75x Ampliação 0,56x
Ampliação 0,70x Ampliação 0,63x
Ampliação 0,75x Ampliação 0,56x
Material e Métodos
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 27
inóculos às condições de stresse. Após 30 dias, as placas foram colocadas à temperatura
ambiente durante mais 22 dias, no escuro.
Figura 16. Inóculos de micélio a diferentes temperaturas: (A) frio 4 °C; (B) quente 37 °C, (ampliação 2x
para a da esquerda e 3x para a da direita).
Os resultados foram posteriormente obtidos por registo de crescimento ou não
crescimento do micélio.
2.3. Padrões e Reagentes
O reagente utilizado na destilação-extração (LN), foi o n-Pentano a 99,62%
(Fisher Scientific) que, antes de ser utilizado foi destilado. Os solventes acetonitrilo
99,9%, n-hexano 95% e acetato de etilo 99,98%, de grau HPLC, foram fornecidos pela
Lab-Scan (Lisboa, Portugal). A mistura padrão com 37 ésteres metílicos de ácidos
gordos (FAME) (norma 47885-U) foi adquirida na Sigma (St. Louis, MO, EUA), assim
como outros isómeros individuais de ácidos gordos e, padrões de açúcares (D(-)-frutose,
D(+)-glucose anidra, D(+)-manitol e D(+)-trealose), tocoferóis (isoformas α-, β-, γ- e δ-
), ácidos orgânicos (ácidos cítrico, fumárico, málico, oxálico e quínico), compostos
fenólicos (ácidos gálico, p-hidroxibenzoico e cinâmico), e trolox (ácido 6-hidroxi-
2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico. O tocol racémico, 50 mg/mL, foi adquirido na
Matreya (PA, EUA). O 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH) foi obtido na Alfa Aesar
(Ward Hill, MA, EUA). Todos os outros produtos químicos e solventes usados eram de
grau analítico e foram adquiridos a partir de fontes comuns. A água foi tratada com um
sistema de purificação Milli-Q (TGI Pure Water Systems, EUA).
Material e Métodos
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 28
2.4. Determinação de voláteis obtidos por destilação-extração Likens-
Nickerson (LN)
Os compostos voláteis presentes nos corpos frutíferos e micélios foram extraídos
num destilador Likens-Nickerson (Figura 17). A temperatura da extração do pentano foi
ajustada à fervura e o condensador ajustado à temperatura constante de 5ºC. Após a
extração dos voláteis em condições constantes por 3h foi recolhido o pentano destilado
com os óleos dissolvidos, condensada a amostra num evaporador rotativo (BÜCHI 461
Water Bath, made in Swttzerland) e recolhida em vial com teflon, congelada e
posteriormente analisada. A análise foi efetuada por cromatografia gasosa (GC) e
cromatografia gasosa espectrometria de massa (GC-MS). Embora se tenham extraído
compostos voláteis a partir de corpos frutíferos e micélio, foi apenas possível a análise e
identificação dos compostos nas amostras de corpos frutíferos. Por falta de tempo
tendo-se no entanto conservado essas amostras para posterior analise, já não no âmbito
desta tese.
Figura 17. Destilador de Likens-Nickerson.
Material e Métodos
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 29
Figura 18. Micélio da amostra comercial de Lepista nuda utilizada para extração de compostos voláteis.
Os voláteis isolados foram analisados usando um cromatógrafo Perkin Elmer
Autosystem XL (Perkin Elmer, Shelton, CT) equipado com dois detentores de chama
(FID), sistema de tratamento dos dados e um injetor de vaporização no qual foram
instaladas duas colunas de diferente polaridade:
- DB-1 de sílica fundida, de fase imobilizada em metilsilicone (30 m × 0,25 mm
d.i.espessura de filme 0,25 μm; J & W Scientific Inc.);
- DB-17HT de fase imobilizada em fenilmetilsilicone (30 m × 0,25 mm d.i.,
espessura de filme de 0,15 μm; J & W Scientific Inc.).
A temperatura do forno foi programada de 45ºC a 175ºC, com incrementos de
3ºC/min, e subsequentemente a 15ºC/min até 300ºC. Atingidos os 300ºC a temperatura
foi mantida durante 10 min. As temperaturas do injetor e dos detetores foram
programadas para 280ºC e 300ºC, respetivamente. Foram injetados volumes de
amostras na ordem dos 0.1 μl. O hidrogénio foi utilizado como gás de arrastamento,
ajustado para uma velocidade linear de 30cm/s e utilizada uma relação de repartição de
fluxo 1:50. A composição percentual dos óleos foi determinada pela integração das
áreas dos picos sem utilização de fatores de correção. Os valores apresentados
correspondem ao valor médio de duas injeções.
Nas análises de GC-MS, utilizou-se um cromatógrafo Perkin Elmer Autosystem
XL, equipado com uma coluna de sílica fundida DB-1 (30 m × 0,25 mm d.i., espessura
de filme 0,25 μm; J & W Scientific Inc.) ligado a um espectrómetro de massa Perkin
Elmer Turbomass (versão do software 4.1). A temperatura do forno foi programada de
45ºC a 175ºC, com incrementos de 3ºC/min, e subsequentemente a 15ºC/min até 300ºC.
Atingidos os 300ºC a temperatura foi mantida durante 10 min. O injetor foi programado
para uma temperatura de 300ºC, a linha de transferência para 280ºC e a câmara de
Ampliação 0,78x Ampliação 0,91x
Material e Métodos
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 30
ionização para os 220ºC. Foi utilizado o hélio como gás de arrastamento, ajustado para
uma velocidade linear de 30cm/s. As amostras foram injetadas com uma repartição de
fluxo de 1:40, foi utilizada uma energia de ionização de 70 eV, a corrente de ionização
de 60 μA e uma gama de massas, 40-300 u. O tempo de varrimento foi de 1 s, sendo
injetados volumes da ordem de 0,1 μl. A identidade dos compostos foi determinada por
comparação dos seus índices de retenção, relação à série de C9-C13 n-alcanos na coluna
DB-1, e espectros de massa, com os padrões comerciais e compostos de referência
presentes em óleos existentes no laboratório e por comparação com uma biblioteca de
espectros de massa desenvolvida no laboratório (Centro de Biotecnologia Vegetal, da
Faculdade de Ciências de Lisboa).
2.5. Determinação da composição proximal
As amostras de corpos frutíferos foram analisadas para a determinação de
humidade, proteínas lípidos, glúcidos e cinzas), seguindo, para tal, os procedimentos
oficias de análise de AOAC (AOAC, 1995). O teor de proteína (N ×4,38) das amostras
foi estimado pelo método macro-Kjeldahl; os lípidos foram determinados pela extração
de uma massa conhecida de amostra com éter de petróleo, usando um aparelho de
Soxhlet; o teor de cinzas foi determinado por incineração em mufla a 600 ± 15 ºC; os
glúcidos foram calculados pela diferença. A energia total foi determinada de acordo
com a seguinte equação:
Energia (kcal) = 4 x (g proteínas + glúcidos g) + 9 x (g lípidos).
2.6. Determinação de ácidos gordos
Os ácidos gordos nas amostras de corpos frutíferos foram determinados por
cromatografia gasosa com deteção de ionização de chama (GC-FID)/coluna capilar, de
acordo com o procedimento implementado no Laboratório de Química e Bioquímica
Aplicada (Heleno et al,, 2009).
As amostras foram transferidas (massa conhecida) para cartuchos de Soxhlet e
extraídas, com éter de petróleo durante pelo menos 7h. A massa obtida por extração foi
misturada com 5 mL de metanol: ácido sulfúrico: tolueno 2:1:1 (v/v/v), durante 12 h,
num banho a 50 ºC e a 160 rpm. Depois adicionaram-se 3 mL de água desionizada, para
obter a separação das fases. A mistura dos ésteres metílicos de ácidos gordos foi
Material e Métodos
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 31
recuperada com 3 mL de éter etílico por agitação no vórtex e a água foi eliminada com
sulfato de sódio anidro. Recuperou-se a amostra para um vial com teflon e filtrou-se
com um filtro de nylon de 0,2 μm da Milipore. O perfil dos ácidos gordos foi obtido
num GC (DANI 1000) equipado com um injetor split/splitess, detetor de ionização de
chama (FID) e uma coluna Macherey Ngel (30 m × 0,32 mm × 0,25 μm). A rampa de
temperaturas do forno foi a seguinte: a temperatura inicial da coluna foi de 50ºC,
durante 2 min, em seguida aumentou-se a temperatura a 30ºC/min até 125ºC, 5ºC/min
até 160ºC, 20ºC/min até 180ºC, 3ºC/min até 200ºC, 20ºC/min até 220ºC que foi mantida
por 15 min. O gás de transporte (hidrogénio) tinha um caudal de 4,0 mL/min (0,61 bar),
medido a 50ºC. A injeção split (1:40) foi realizada a 250ºC. Para análise injetou-se 0,1
μL de amostra.
A identificação dos ácidos gordos foi feita com base no tempo de retenção
relativos aos picos das amostras e dos padrões. Os resultados foram processados
recorrendo ao software CSW 1,7 (DataApex 1,7) e expressos em percentagem relativa
de cada ácido gordo.
2.7.Determinação de açúcares
Os açúcares livres foram determinados nas amostras de corpos frutíferos e
micélios por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), de acordo com o
procedimento implementado no Laboratório de Química e Bioquímica Aplicada
(Heleno et al., 2009).
Foi adicionado 1 mL do padrão interno (PI) (rafinose, 25 mg/mL) à amostra (1g)
e extraiu-se com 40 mL de etanol a 80 %, incubando durante 1h30 a 80 °C, procedendo
a uma agitação de 15 em 15 minutos. Posteriormente, procedeu-se à filtração e
evaporação do etanol (evaporador rotativo Büchi R-210). O sobrenadante foi lavado 3
vezes sucessivas com 10 mL de éter etílico numa ampola de decantação. Após as
lavagens, procedeu-se à concentração a 40 °C e o resíduo sólido foi dissolvido em água
num volume final de 5 mL, filtrado através de um filtro de 0,22 µm. Seguidamente, foi
transferido para um frasco âmbar e analisado. O volume de amostra injetado foi de 10
µL.
O sistema de análise consistia num sistema integrado com uma bomba (Knauer,
Smartline sistema 1000), um sistema de desgaseificação (Smartline gestor 5000) e um
amostrador automático (AS-2057 Jasco) acoplado a um detetor de índice de refração (RI
Material e Métodos
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 32
detector Knauer Smartline 2300). A identificação dos açúcares foi feita por comparação
dos tempos de retenção relativos dos picos da amostra com os padrões. Os dados foram
analisados usando o software Clarity 2.4 (DataApex). Na quantificação, utilizou-se o
método do padrão interno e curvas de calibração obtidas a partir de padrões comerciais
de cada composto. Os resultados foram expressos em gramas por 100 gramas de massa
seca.
2.8.Determinação de ácidos orgânicos
Os ácidos orgânicos foram determinados nas amostras de corpos frutíferos e
micélios de acordo com o procedimento implementado no Laboratório de Química e
Bioquímica Aplicada (Barros et al., 2012).
As amostras foram extraídas com 25 mL de ácido metafosfórico a 4,5%, em
agitação durante 15 min. Depois, foram filtradas (filtros de 0,22 µm) e analisadas. A
análise foi realizada por cromatografia líquida ultra rápida (UFLC), acoplada ao detetor
de fotodíodos (PDA), utilizando uma Shimadzu 20A (Shimadzu Corporation). A
deteção foi realizada no PDA, utilizando 215 e 245 nm como comprimento de onda
preferenciais. Os ácidos orgânicos foram quantificados por comparação da área dos
picos das amostras registados a 215 nm com as curvas de calibração obtidas a partir de
padrões comerciais de cada composto. Os resultados foram expressos em gramas por
100 gramas de massa seca.
2.9. Determinação de compostos fenólicos
Os compostos fenólicos foram analisados nas amostras de corpos frutíferos e
micélios de acordo com o procedimento implementado no Laboratório de Química e
Bioquímica Aplicada (Barros et al., 2009; Vaz et al., 2011).
As amostras foram extraídas com 20 a 30 mL de metanol:água 80:20 (v/v) e
colocadas durante 2h num congelador. De seguida as amostras foram filtradas com
papel de filtro Whatman nº4. Os extratos foram evaporados para remoção do metanol;
o resíduo foi lavado duas vezes com 20 mL de éter etílico e 20 mL de acetato de etilo.
As amostras foram evaporadas até à secura e, posteriormente, dissolvidas em
metanol:água 80:20 (v/v) e filtradas (0,22 µm).
A análise foi feita por HPLC (Cromatógrafo Hewlett-Packard 1100, Agilent
Technologies). A separação foi conseguida através de uma coluna de fase reversa C18,
Material e Métodos
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 33
Spherisorb ODS-2 (Waters) (3 μm, 150 4.6 mm) termostatizada a 25 °C. Os solventes
utilizados foram: (A) 2,5 % de ácido acético em água, (B) 2,5% de ácido
acético:acetonitrilo (90:10, v/v) e (C) 100% de acetonitrilo. O gradiente aplicado foi:
isocrático 100% A durante 10 min, 50% A e 50% B durante 10 min, isocrático 100% B
durante 15 min, 90% B e 10% C durante 10 min, 70% B e 30% C durante 10 min, 50%
B e 50% C durante 5 min, 20% B e 80% C durante 5 min, 100% A durante 5 min, a
uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. O perfil em compostos fenólicos foi determinado por
HPLC acoplado a um detetor de díodos (DAD) utilizando como comprimento de onda
preferencial, 280 nm. Os compostos fenólicos foram quantificados por comparação da
área dos seus picos, registados a 280 nm, com as curvas de calibração obtidas de
padrões comerciais de cada composto. Os resultados foram expressos em gramas por
100 grama de massa seca.
2.10. Determinação de tocoferóis
Os tocoferóis foram determinados nas amostras de corpos frutíferos e micélios
de acordo com o procedimento implementado no Laboratório de Química e Bioquímica
Aplicada (Reis et al., 2011). A solução de BHT (2,6-di-terc-butil-4-metilfenol) em
hexano (10 mg/mL; 100 μL) e o padrão interno (PI) em hexano (tocol; 2,0 μg/mL; 250
μL) foram adicionados às amostras antes do procedimento de extração. As amostras
(~500 mg) foram homogeneizadas com metanol (4 mL) num vórtex (1 min). De
seguida, adicionou-se hexano (4 mL) e homegeneizadas, de novo, no vórtex durante 1
min. Posteriormente, adicionou-se 2 mL de uma solução aquosa saturada de NaCl e
homogeneizou-se a amostra durante 1 min no vórtex. Seguidamente as amostras foram
centrifugadas (centrífuga refrigerada Centorion K24OR), durante 5 min a 4000 rpm e
transferiu-se cuidadosamente o sobrenadante para um frasco (vial). As amostras foram
re-extraídas mais duas vezes com hexano e centrifugadas. Os extratos foram
desidratados com sulfato de sódio anidro, secos numa corrente de azoto e redissolvidos
em 1 mL de hexano, os quais foram filtrados através de um filtro (0.22 µm). O resíduo
obtido na filtração foi transferido para frascos de injeção (vials) âmbar e analisados por
HPLC (equipamento descrito anteriormente), com um detetor de fluorescência (FP-
2020; Jasco) programado para excitação a 290 nm e emissão a 330 nm. Os compostos
foram identificados por comparação com padrões comerciais. A quantificação baseou-se
na resposta de sinal de fluorescência, utilizando-se o método do padrão interno (tocol) e
Material e Métodos
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 34
utilizando curvas de calibração obtidas a partir de padrões comerciais de cada
composto. Os resultados foram expressos em mg por 100 g de massa seca.
2.11. Avaliação da atividade antioxidante
2.11.1. Aspetos gerais
As amostras de corpos frutíferos e micélios (~1 g) foram submetidas a uma
extração líquido-sólido por agitação com 40 mL de metanol (25 °C a 150 rpm, em placa
de agitação) durante 1 hora e subsequentemente filtradas através de papel Whatman nº
4. O resíduo obtido foi novamente extraído com uma porção adicional de 30 mL
metanol, nas mesmas condições referidas anteriormente. Os extratos metabólicos
combinados foram evaporados e redissolvidos em metanol, de forma a obter uma
concentração final conhecida, solução stock (20 mg/mL). Posteriormente, a partir das
soluções stock prepararam-se soluções de extratos metanólicos com diferentes
concentrações, através de diluições sucessivas, para serem sujeitos a testes in vitro
(Barros et al., 2012) de avaliação das suas propriedades antioxidantes. As concentrações
das amostras correspondentes a 50% de atividade antioxidante ou 0,5 de absorvância
(EC50) foram calculadas a partir das representações gráficas das percentagens de
atividade antioxidante (ensaios do DPPH, β-caroteno e/linoleato e TBARS) ou da
absorvância a 690 nm (ensaio do poder redutor) em função da concentração da amostra.
Utilizou-se o trolox como controlo positivo.
2.11.2. Ensaio Folin Ciocalteu
Uma das soluções do extrato (5 mg/mL; 1 mL) foi misturada com o reagente de
Folin-Ciocalteu (2,5 mL, previamente diluída em água 1:10 v/v) e uma solução de
carbonato de sódio (75 g/L; 2 mL). A mistura foi homogeneizada no vórtex, durante 15
segundos e deixou-se repousar durante 30 min a 40 °C para desenvolvimento da cor. A
absorvância foi medida a 765 nm (espectrofotómetro AnalytikJena 200). Utilizou-se
ácido gálico para obter a curva padrão (0,0094 – 0,15 mg/mL), e a redução do reagente
de Folin-Ciocalteu pelas amostras foi expresso em mg de equivalentes de ácido gálico
(GAE) por grama de extrato.
Material e Métodos
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 35
2.11.3. Ensaio do ferricianeto/azul da Prússia
As diferentes soluções de extrato (0,5 mL) foram misturadas com tampão fosfato
de sódio (200 mmol/L; pH 6,6; 0,5 mL) e ferricianeto de potássio (1% w/v; 0,5 mL). A
mistura foi incubada a 50 ºC durante 20 min. Após esse período adicionou-se ácido
tricloroacético (10 %; 0,16 mL). A mistura (0,8 mL) foi colocada nos 48 poços
juntamente com água desionizada (0,8 mL) e uma solução de cloreto férrico (0,1 %;
0,16mL) e a absorvância foi medida a 690 nm no Leitor de Microplacas ELX800 (Bio-
Tek equipamento, Inc.). As absorvâncias mais elevadas correspondem a um maior poder
redutor.
2.11.4. Ensaio da atividade captadora de radicais DPPH
A mistura de reação usada consistiu, em cada um dos 96 poços, em 30 μL de
cada uma das soluções do extrato em diferentes concentrações e270 μL de uma solução
metanólica de radicais DPPH (6 × 10-5
mol/L). A mistura foi colocada no escuro
durante 30 min. A redução do radical DPPH foi determinada pela medição da
absorvância a 515 nm. A atividade captadora de radicais (ACR) foi calculada pela
percentagem de descoloração da solução de DPPH, usando a equação:
% ACR = [(ADPPH – AS)/ADPPH)] × 100,
onde AS corresponde à absorvância da solução de DPPH na presença de diferentes
concentrações de extrato e ADPPH é a absorvância do branco (solução de DPPH mais o
solvente de extração (metanol) em vez da solução de extrato).
2.11.5. Ensaio do β-caroteno/linoleato
Preparou-se uma solução de β-caroteno dissolvendo este composto (2 mg) em
clorofórmio (10 mL). Transferiram-se 2 mL desta solução para um balão periforme de
100 mL e removeu-se o clorofórmio a 40 °C, sob vácuo. Posteriormente juntou-se ácido
linoleico (40 mg), emulsionante Tween 80 (400 mg) e água destilada (100 mL), e
agitou-se vigorosamente. Transferiram-se alíquotas (4,8 mL) desta emulsão para tubos
de ensaio contendo diferentes concentrações dos extratos (0,2 mL). Logo após a adição
da emulsão a cada tubo, agitou-se e determinou-se o tempo zero de absorvância a 470
Material e Métodos
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 36
nm (espetrofotómetro AnalytikJena). Seguidamente foram incubados num banho a 50
°C durante 2 h. Passado esse tempo determinou-se novamente a absorvância a 470 nm.
Foi preparado um branco com o solvente de extração (metanol) em vez da solução de
extrato. A inibição da descoloração do β-caroteno foi calculada utilizando a seguinte
equação:
(Absorvância470 após 2h/Absorvância470 inicial) × 100
2.11.6. Ensaio TBARS
Utilizou-se tecido cerebral, obtido a partir de porco (Sus scrofa) que foi
dissecado e homogeneizado em gelo com tampão Tris-HCl (20 mM, pH 7,4) a fim de
produzir um homogeneizado de tecido cerebral numa proporção 1:2 (w/v) após
centrifugação (centrífuga refrigerada Centorion K24OR) a 3000g durante 10 min.
Incubou-se uma alíquota (0,1 mL) do sobrenadante com as diferentes concentrações dos
extratos (0,2 mL), na presença de FeSO4 (10 µM; 0,1 mL) e ácido ascórbico (0,1 mM;
0,1mL) a 37 °C durante 1 hora. A reação foi interrompida pela adição de ácido
tricloroacético (28% w/v; 0,5 mL), seguindo-se a adição do ácido tiobarbitúrico (TBA;
2%, w/v; 0,38 mL). A mistura foi aquecida a 80 °C durante 20 min. Após centrifugação,
a 3000g durante 10 min, para remoção do precipitado de proteínas, a intensidade da cor
do complexo malonaldeído (MDA)-TBA do sobrenadante foi medida através da sua
absorvância a 532 nm. Foi preparado um branco com o tampão tris-HCl em vez da
solução de extrato. A percentagem de inibição da peroxidação lipídica (%) foi calculada
utilizando a seguinte fórmula:
[(A - B)/A] 100%
onde A e B correspondem à absorvância do branco e da solução com o extrato,
respetivamente.
2.12. Análise estatística
Os ensaios relativos a cada uma das amostras foram feitos em triplicado. Os
resultados foram expressos em valores médios ± desvio padrão (DP). Os resultados de
cada processo de secagem foram analisados através da análise de variância (ANOVA)
Material e Métodos
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 37
seguida de um teste de Tukey HSD com α = 0,05. Este tratamento foi efetuado
utilizando o programa SPSS v. 16.0. As diferenças estatísticas obtidas pela ANOVA
foram representadas por letras (letras diferentes indicam diferenças significativas entre
resultados). As letras foram ordenadas alfabeticamente de acordo com a diminuição dos
valores dos resultados (e.g. a letra “a” representa o melhor resultado para a composição
química e o pior resultado para os ensaios das propriedades antioxidantes).
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 39
III. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Avaliação do crescimento do micélio de Lepista nuda em diferentes
meios de cultura sólidos
3.1.1. Avaliação do crescimento do micélio de Lepista nuda com base no
raio obtido em diferentes meios de cultura sólidos
O crescimento de micélio nos fungos pode ser avaliado através do crescimento
das hifas em meio de cultura sólido, por determinação da área, volume ou raio médio da
borda do micélio em crescimento (Montini, 2001).
O crescimento do fungo em função do tempo resulta numa curva do tipo
sigmoide (tem uma forma em S), que pode ser dividida em várias fases (fase lag, fase
exponencial, fase estacionária e fase de latência ou morte), nas quais se pode distinguir
as diferentes características fisiológicas. A duração da fase lag depende da espécie e dos
nutrientes no meio de cultura. A fase exponencial é afetada por suplementos
nutricionais nomeadamente, fontes de azoto e carbono. A fase estacionária ocorre
devido à exaustão de alguns nutrientes limitantes, ou pela acumulação de metabolitos
tóxicos. A fase de latência ou morte corresponde, por norma, ao esgotamento total dos
nutrientes ou à autólise (Montini, 2001).
O crescimento do micélio de L. nuda, isolado a partir dos esporocarpos de
amostras silvestres obtidas em prado e de uma amostra comercial, foi avaliado ao longo
do período de incubação, obtendo-se os resultados apresentados nas imagens seguintes
(Figuras 19 e 20).
Pode-se verificar que as duas amostras (prado e comercial) obtidas em cinco
meios de cultura diferentes (MMN completo, MMN incompleto, PACH, FAD e PDA)
não revelaram nenhuma fase de adaptação (fase lag). Este facto pode dever-se ao
crescimento contínuo e ramificado das hifas o que permite a produção de micélio no
substrato (Carlile et al., 2001). A fase exponencial em todos os meios de cultura e nas
duas amostras encontrava-se entre os 13 e 19 dias. No entanto, o crescimento médio do
raio do micélio variou entre 2 e 3,5 cm. Em termos de comparação das duas amostras, a
que apresentou maior crescimento nesta fase exponencial foi a amostra comercial (2,94
a 3,45 cm); a amostra proveniente de prado teve um menor crescimento (2,12 a 2,98
cm). A fase estacionária variou com o meio de cultura utilizado e com a amostra, como
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 40
se pode verificar nas figuras 19 e 20; no entanto, foi sempre maior na amostra de prado,
em todos os meios de cultura testados.
Na amostra de prado, o micélio que cresceu no meio de cultura MMN completo
quase preencheu a totalidade da placa de Petri (3,81 cm), em 41 dias em crescimento
(Figura 19). Já o que teve menos tempo de crescimento (25 dias) foi o que se obteve no
meio de cultura MMN incompleto, não preenchendo totalmente a placa de Petri (3,24
cm). Assim, dos cinco meios de cultura usados, o MMN completo mostrou ser o mais
indicado para o crescimento da amostra no que respeita à produção de biomassa,
parecendo ser apropriado em termos de nutrientes, pois obtiveram-se valores mais
favoráveis em termos de crescimento médio de micélio e tempo de crescimento (Figura
19).
Os micélios obtidos a partir da amostra comercial que cresceram e quase
preencheram a totalidade da placa de Petri (3,90 e 3,88 cm) foram os que estavam no
meio de cultura MMN incompleto e completo com 21 e 29 dias de crescimento,
respetivamente. Em relação a esta amostra, os melhores meios de cultura para o
crescimento em termos de biomassa parecem ser o meio MMN completo, incompleto e
o meio PACH, devido ao tempo de crescimento de 20 a 29 dias e ao crescimento médio
do micélio de ~4 cm nos três meios de cultura (Figura 20).
Figura 19. Curva de crescimento do micélio obtido em diferentes de meio de cultura (MMN completo,
incompleto, PACH, FAD e PDA), a partir de corpos frutíferos de Lepista nuda provenientes de prado.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69
Rai
o d
o m
icé
lio (
R)
(cm
)
Dias
Meio de cultura MMN Completo Meio de cultura MMN Incompleto
Meio de cultura PACH Meio de cultura FAD
Meio de cultura PDA
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 41
Figura 20- Curva de crescimento do micélio obtido em diferentes meios de cultura (MMN completo,
incompleto, PACH, FAD e PDA), a partir de corpos frutíferos comerciais de Lepista nuda.
Para uma melhor observação dos resultados obtidos encontra-se, nos anexos 6.6
a 6.15, as imagens de cada uma das amostras nos cinco diferentes meios de cultura
(MMN completo, MMN incompleto, PACH, FAD e PDA).
Realizou-se o cálculo da Taxa Relativa de Crescimento (TRC) a partir dos
valores do raio do micélio obtidos nos diferentes meios de cultura para as duas
amostras; os resultados apresentam-se nas Figuras 21 e 22.
Para o micélio obtido a partir da amostra do prado, o meio de cultura mais
adequado foi o MMN completo, com 81,38 cm-1
dia-1
. Os restantes meios tiveram
baixos valores de crescimento, o que comprova que o meio de cultura referido
anteriormente é o mais indicado para o crescimento do micélio de L. nuda obtido a
partir da amostra comercial (Figura 21).
00,5
11,5
22,5
33,5
44,5
0 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63
Raio
do m
icel
io (
R)
(cm
)
Dias
Meio de cultura MMN Completo Meio de cultura MMN Incompleto
Meio de cultura PACH Meio de cultura FAD
Meio de cultura PDA
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 42
Figura 21. Taxa Relativa de Crescimento com base no raio do micélio obtido a partir da amostra
de Lepista nuda proveniente de prado.
Os meios de cultura que, em 21 dias, obtiveram maior crescimento foram os
meios MMN completo e incompleto com 0,57 cm cm-1
dia-1
para os micélios obtidos a
partir da amostra comercial. Mas o meio de cultura PACH está muito próximo com uma
diferença de 0,03 cm cm-1
dia-1
, o que significa que é uma diferença mínima de
crescimento. Portanto, todos eles foram bons meios de cultura para o crescimento do
micélio de L. nuda obtido a partir da amostra de prado (Figura 22).
Figura 22. Taxa Relativa de crescimento com base no raio do micélio obtido a partir da amostra
comercial de Lepista nuda.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
21
TR
C
cm c
m-1
dia
-1
Crescimento de 21 dias
MMN Incompleto
PACH
FAD
PDA
MMN Completo
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
21
TR
C
cm c
m-1
dia
-1
Crescimento após 21 dias
MMN Completo
MMN Incompleto
PACH
FAD
PDA
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 43
Como referido anteriormente, o crescimento do micélio pode ser avaliado pelo
crescimento das hifas em função do tempo. Mas também pode ser avaliado pela massa
de micélio produzida. Assim, para determinarmos qual o melhor meio de cultura para o
crescimento do macrofungo L. nuda, em termos de produção de massa, testaram-se os
cincos meios de cultura já referidos.
Os resultados obtidos estão representados secção seguinte (Figuras 23 a 27),
onde os resultados apresentados demostram a média de crescimento em massa fresca e
seca do micélio ao longo de 21 dias.
3.1.2. Avaliação do crescimento do micélio de Lepista nuda com base nas
massas fresca e seca obtidas em diferentes meios de cultura sólidos
Os resultados obtidos, nas duas amostras (silvestre proveniente de prado e
comercial), demonstram que estes têm uma fase lag, o que não se verificou nos
resultados anteriores. A fase lag é a fase que se segue à inoculação, num novo meio de
cultura. É por norma uma fase pequena, caracterizada por não ocorrer crescimento. As
condições em que se encontra o inóculo inicialmente, tem influência na duração desta
fase. Se o inóculo for retirado inicialmente de uma fase de crescimento exponencial, a
fase lag será mais curta, ou mesmo nem se verifica, desde que as condições no novo
meio de cultura sejam mantidas iguais às que se encontrava inicialmente. No entanto, de
fungo para fungo, dependendo da natureza do inóculo e das condições nutricionais do
meio de cultura, pode haver fase lag (Web 8).
A massa fresca de micélio corresponde à percentagem de água que este acumula,
porque os fungos filamentosos crescem devido ao crescimento dos ápices das hifas. Ao
crescer, acumula água no interior da hifa, aumentando assim de volume. Assim, ao
efetuar a determinação da massa fresca do micélio inclui-se a percentagem de retenção
de água no interior das hifas.
A massa seca de micélio corresponde à biomassa produzida (metabolismo com
produção “de novo” de compostos como proteínas, fibras, ácidos. nucleicos ou outros
compostos resultantes do metabolismo ativo do organismo em causa) na qual a
percentagem de água é praticamente zero. Assim, faz sentido determinar a relação da
massa fresca com a massa seca; a massa seca dá-nos o valor correto de crescimento e de
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 44
produção de biomassa produzida, isto é, a quantidade de micélio que cresce
efetivamente ao longo do tempo (Web 9).
No inoculo da amostra proveniente de prado e obtida em meio de cultura MMN
completo, verifica-se que o crescimento do micélio, por comparação da média de massa
fresca e seca, é praticamente zero nos nove dias iniciais de crescimento. Após 13 dias, a
massa fresca tem um ligeiro aumento no seu crescimento. A partir deste dia, a produção
de massa fresca tem um crescimento exponencial; já a massa seca tem um crescimento
exponencial mas inferior como seria expectável atendendo aos conceitos de massa seca
e fresca (Figura 23).
A produção média de micélio de massa fresca e seca no fim dos 21 dias foi de
1,86 e 0,58 g, respetivamente.
Figura 23. Crescimento do micélio de Lepista nuda proveniente de prado, com base nas massas fresca e
seca obtidas em meio de cultura MMN completo.
No crescimento do micélio da amostra de prado obtido em MMN incompleto, a
produção média de massa fresca e seca foi bastante irregular, comparado com o anterior
(meio completo). A produção média de massa seca foi superior à da massa fresca. A
produção média de massa fresca, passado 3 dias foi negativa, o que pode significar que
houve um consumo do meio de cultura, ou seja, o micélio consumiu os nutrientes,
produziu matéria nova não sendo só absorção e retenção de água, provavelmente
nutrientes ainda associados ao inoculo, pois a produção média de massa seca é positiva
-0,50
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
0 3 5 7 9 11 13 15 17 19 20 21
Ma
ssa
de
mic
élio
(g
)
Dias
Massa fresca
Massa seca
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 45
para período de tempo em estudo. Nos dias seguintes, a produção média de massa fresca
foi irregular, mas depois de 7 dias teve um ligeiro crescimento. Já a produção média de
massa seca a partir do terceiro dia teve ligeiros crescimentos, até atingir um crescimento
exponencial. Depois deste aumento exponencial de crescimento, apresentou um
crescimento moderado até ao fim da experiência (21 dias depois).
É importante referir que a massa fresca no fim da experiência aproximou-se da
produção média de massa seca (0,21 e 0,24 g de micélio produzido, respetivamente)
(Figura 24). O que nos permite considerar que o conteúdo em água do nosso micélio é
relativamente baixo ou seja o aumento de massa do micélio será fundamentalmente
devido a produção de novos materiais e não acumulação de água.
Figura 24. Crescimento do micélio de Lepista nuda proveniente de prado, com base nas massas fresca e
seca obtidas no meio de cultura MMN incompleto.
Na determinação das curvas de crescimento por massa fresca e seca no meio de
cultura PACH, os resultados obtidos (Figura 25) apresentaram irregularidades, ou seja,
tal como nos resultados anteriores, a produção de massa fresca e seca teve altos e
baixos. A produção média de massa fresca teve por tendência um crescimento, ao longo
dos 21 dias. Já a produção média de massa seca teve um crescimento diferente. Nos
primeiros dias apresentou valores negativos, mas depois de 5 dias teve um grande
crescimento, ultrapassando a massa fresca produzida, tal como no meio anterior e,
mantendo-se assim durante mais 10 dias, até que atingiu um valor de crescimento mais
moderado, atingindo o inicio da fase estacionária da curva de crescimento.
-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0 3 5 7 9 11 13 15 17 19 20 21
Ma
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eo
mic
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(g
)
Dias
Massa fresca
Massa seca
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 46
A produção média de massa fresca e seca no fim dos 21 dias foi aproximando
com valores de 0,41 e 0,28 g, respetivamente.
Figura 25. Crescimento do micélio de Lepista nuda proveniente de prado, com base nas massas fresca e
seca obtidas em meio de cultura PACH.
Com o meio de cultura FAD, a produção e determinação da curva de massa
fresca e seca do macrofungo foi semelhante à obtida no meio de cultura MMN completo
(Figura 23).
A produção média de massa fresca e seca nos primeiros dias foi baixa, o fungo
poderá ter estado a adaptar ao novo meio de cultura, originando assim uma fase lag. Isto
pode estar associado ao facto do inóculo ter como meio de origem um meio de cultura
diferente (MMN completo, com mais nutrientes, em relação ao meio de cultura novo), e
portanto ter havido um esgotamento dos nutrientes do meio anterior e por não estrarem
alguns dos nutrientes disponíveis da mesma forma no meio novo, teve de haver
adaptação das vias metabólicas para o crescimento neste meio mais pobre, no entanto,
como já referido anteriormente, os organismos normalmente têm fases lag quando são
transferidos para novos meios mesmo que estes sejam iguais aos anteriores. Neste caso
por ter mudado para um meio mais pobre provavelmente essa fase lag foi mais
prolongada e por isso nítida. A quantidade de nutrientes é diferente de meio de cultura
para meio de cultura, existindo uma maior quantidade de carbono no meio inicial
(MMN completo) a disponibilidade de fonte de energia e de esqueletos de carbono
diminuiu tornando deste modo o período de adaptação mais nítido. Depois de 9 dias de
incubação, a produção média de massa fresca e seca foi distinta, onde a produção média
-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0 3 5 7 9 11 13 15 17 19 20 21
Ma
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)
Dias
Massa fresca
Massa seca
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 47
de massa fresca teve um crescimento exponencial maior em comparação ao crescimento
de massa seca. Deste modo podemos inferir que o crescimento real com aumento
significativo de micélio produzido de novo foi menor neste meio, sendo grande parte do
seu aumento de massa devido a absorção de água e não “construção” de novos
“materiais”.
A massa média produzida no fim de 21 dias foi 0,53 g para massa fresca e 0,17 g
para massa seca, o que constitui uma diferença considerável (Figura 26).
Figura 26. Crescimento do micélio de Lepista nuda proveniente de prado, com base nas massas fresca e
seca obtidas em meio de cultura FAD.
As retas obtidas no crescimento médio do micélio por massa fresca e seca em
meio de cultura PDA, foram similares às obtidas no meio de cultura PACH (Figura 25),
uma vez que os resultados obtidos de massa seca foram bastante irregulares.
O crescimento médio de micélio por massa fresca nos primeiros dias teve um
baixo crescimento, podendo considerar-se uma fase de adaptação ao meio de cultura,
pois o inoculo, inicialmente, encontrava-se no meio de cultura MMN completo.
Posteriormente, a produção média de crescimento de micélio fresco teve um
crescimento exponencial grande, mas contante; ao fim dos 21 dias apresentou uma
massa fresca média de 0,45 g. O conteúdo em água do micélio é relativamente baixo ou
seja o aumento de massa do micélio será fundamentalmente devido a produção de novos
materiais e não acumulação de água
A produção média de massa seca, como referido anteriormente, foi bastante
irregular, não apresentando uma fase lag nos dias iniciais. Existiu, no entanto, produção
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
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Dias
Massa fresca
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Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 48
média de massa seca nos primeiros 3 dias, com alguma significância e depois nos 4 dias
seguintes seguiu-se uma baixa produção média de massa seca. Sete dias depois teve um
aumento na produção média, contudo após 2 dias, o crescimento médio da massa seca,
apresentou um crescimento constante, quase retilinto. É importante referir que só 17
dias depois, a produção média de micélio por massa seca foi inferior à da massa fresca
média produzida. A produção média de massa seca no final dos 21 dias foi 0,31 g,
ligeiramente próxima da massa média obtida em fresco (Figura 27). O aumento da
massa do micélio poderá ser fundamentalmente devido á produção de novos matériais e
não acumulação de água.
Figura 27. Crescimento do micélio de Lepista nuda proveniente de prado, com base nas massas fresca e
seca obtidas em meio de cultura PDA.
Para amostra de prado, o meio de cultura MMN completo permitiu uma
maior produção de massa fresca, podendo ser explorado no cultivo de corpos frutíferos
deste fungo. O mesmo meio conduziu também a uma maior produção de biomassa seca.
Este facto pode dever-se à quantidade de carbono existente no meio, que permite uma
maior disponibilidade energética e de esqueletos de carbono para produção de
percursores e biomoléculas essenciais ao desenvolvimento do micélio. Permitindo assim
uma maior disponibilidade energética e de esqueletos de carbono para produção de
percursores e biomoléculas essenciais ao desenvolvimento do micélio
0,00
0,05
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Dias
Massa fresca
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Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 49
Os resultados obtidos no meio de cultura MMN completo, na determinação da
curva de crescimento médio de micélio produzido a partir da amostra comercial, com
base nas massas fresca e seca, apresentaram alguma semelhança com os obtidos no
mesmo meio de cultura na amostra de prado. No entanto existem diferenças importantes
nesses resultados.
A produção média de massa seca ao longo dos 21 dias manteve-se contante e no
limite da produção, obtendo-se uma massa média final de 0,05 g. No entanto, a massa
fresca, nos 3 primeiros dias teve uma pequena fase lag. Logo a seguir, apresentou um
crescimento exponencial, mas que durou pouco, pois nos dias seguintes a este
crescimento voltou a verificar-se uma estabilidade, isto é, o crescimento foi sempre
constante. Posteriormente, voltou a sofrer um crescimento exponencial, e a produção
média de massa obtida 21 dias depois foi 1,84 g (Figura 28).
Figura 28. Crescimento do micélio de Lepista nuda comercial, com base nas massas fresca e seca obtidas
em meio de cultura MMN completo.
A determinação da curva de crescimento médio de massa fresca e seca em meio
de cultura MMN incompleto, nesta amostra, apresentou parecenças com as que foram
obtidas no mesmo meio, mas na amostra de prado; a produção média de massa seca foi
sempre maior que a de massa fresca (Figura 29). O conteúdo em água do micélio é
relativamente baixo ou seja o aumento de massa do micélio será fundamentalmente
devido a produção de novos materiais e não acumulação de água.
Isto é, o conteúdo em água do micélio é relativamente baixo, fundamentalmente
devido à produção de novos materias.
-0,50
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Massa fresca
Massa seca
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 50
O crescimento das duas curvas (massa fresca e seca) foi quase sempre
exponencial, exceto na massa fresca, em que 19 dias depois apresentou uma ligeira
diminuição de produção média de micélio, mas que rapidamente voltou a crescer nos
restantes dias.
A produção média obtida ao fim dos 21 dias foi 0,18 e 0,24 g de massa fresca e
seca, respetivamente.
Figura 29. Crescimento do micélio de Lepista nuda comercial, com base nas massas fresca e seca obtidas
em meio de cultura MMN incompleto.
No meio de cultura PACH, na determinação da curva de crescimento médio por
massa fresca e seca, pode-se verificar a ausência de uma fase lag e um crescimento
exponencial moderado das duas massas (Figura 30).
A massa seca teve uma produção maior que a massa fresca nos primeiros 19
dias. Seguidamente, essa produção foi ultrapassada pela produção de massa fresca que
até aos 193 dias apresentava uma produção baixa, apenas ligeiramente exponencial,
como se fosse uma fase de adaptação. Seguiu-se um aumento na sua produção tendo-se
obtido, no final dos 21 dias, uma massa média de 0,79 g; a massa seca média obtida foi
0,42 g.
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0 3 5 7 9 11 13 15 17 19 20 21
Ma
ssa
de
mic
élio
(g
)
Dias
Massa fresca
Massa seca
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 51
Figura 30. Crescimento do micélio de Lepista nuda comercial, com base nas massas fresca e seca obtidas
em meio de cultura PACH.
No meio de cultura FAD, a produção média de massa seca demostrou alguma
irregularidade (Figura 31).
A produção média de massa fresca nos primeiros 11 dias teve um crescimento
moderado e após 19 dias teve uma pequena regressão; no entanto, nos últimos dias da
experiência apresentou crescimento exponencial, tendo-se obtido uma massa final de
0,63 g. A curva de crescimento de massa seca nos primeiros 7 dias apresentou uma fase
lag, sem crescimento. Passados 7 dias, teve um crescimento muito rápido, mas logo nos
dias seguintes esse crescimento manteve-se constante. Nos últimos 4 dias de
experiencia, apresentou um crescimento moderadamente exponencial, tendo-se obtido
uma massa final de 0,30 g, permite uma maior disponibilidade energética e de
esqueletos de carbono para produção de percursores e biomoléculas essenciais ao
desenvolvimento do micélio.
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
0 3 5 7 9 11 13 15 17 19 20 21
Ma
ssa
de
mic
élio
(g
)
Dias
Massa fresca
Massa seca
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 52
Figura 31. Crescimento do micélio de Lepista nuda comercial, com base nas massas fresca e seca obtidas
em meio de cultura FAD.
Na determinação das curvas de crescimento do micélio por massa fresca e seca
em maio PDA, os resultados também não apresentaram oscilações.
A produção média de massa fresca nos primeiros dias teve um crescimento
moderado. No entanto, passado 9 dias, esse crescimento foi exponencial, tendo-se
obtido a massa final de 1,02 g. Em relação à curva de massa seca, esta acompanhou o
crescimento de massa fresca, mas de forma muito mais moderada e com uma produção
final de 0,23 g (Figura 32).
Figura 32. Crescimento do micélio de Lepista nuda comercial, com base nas massas fresca e seca obtidas
em meio de cultura PDA.
-0,10
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0 3 5 7 9 11 13 15 17 19 20 21
Ma
ssa
de
mic
élio
(g
)
Dias
Massa fresca
Massa seca
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
0 3 5 7 9 11 13 15 17 19 20 21
Ma
ssa
de
mic
élio
(g
)
Dias
Massa fresca
Massa seca
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 53
Mais uma vez, de todos os meios de cultura usados, o que conduziu a uma maior
produção de massa fresca para a amostra comercial foi o meio MMN completo. No
entanto, o que apresentou uma maior produção média de massa seca, isto é de biomassa,
foi o meio de cultura PACH. Este meio é muito rico em glucose que é a fonte de
carbono mais usada pelos fungos (Web 8).
A composição da fração orgânica dos meios de cultura é responsável pelo
fornecimento de carbono e azoto, enquanto que a fração inorgânica exerce um papel
importante na disponibilização de micronutrientes que normalmente estão envolvidos
no funcionamento dos sistemas de transporte celular e das reações enzimáticas
(Hoseney, 1991). Em 1996, Stott et al. descreveram que o micélio se desenvolvia em
meio com agar, extrato de malte e levedura a 2%; Wright & Hayes em 1978, afirmam
que meios enriquecidos com caseína ou peptona hidrolisada permitiam o
desenvolvimento do micélio.
O meio de cultura MMN completo é um meio rico, em comparação aos meios de
cultura MMN incompleto, PDA e FAD. No entanto, o meio de cultura PACH é o mais
rico em comparação a todos os outros meios de cultura.
Os valores da TRC obtidos a partir das massas de micélio das amostras de prado
e comerciais, obtidas nos diferentes meios de cultura são apresentados nas Figuras 33 e
34.
Para a amostra proveniente de prado, o meio de cultura que permitiu uma maior
produção de massa foi o MMN completo com 114,33 g g-1
dia-1
. No entanto, o meio de
cultura FAD também conduziu a uma quantidade significativa de massa (98,00 g g-1
dia-
1).
Em resumo, o meio de cultura adequado a uma produção de micélio da amostra
de L. nuda proveniente de prado, é o MMN completo (Figura 33).
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 54
Figura 33. Taxa Relativa de crescimento (TRC) com base na massa de micélio obtida a partir,
da amostra de Lepista nuda proveniente de prado.
De acordo com os valores de TRC relativos ao micélio da amostra comercial,
verifica-se que os meios que permitiram uma maior produção de massa foram MMN
incompleto e PACH, onde a produção foi 0,70 g g-1
dia-1
. O meio de cultura MMN
completo também conduziu a uma grande produção de massa (0,69 g g-1
dia-1
). Assim,
os meios de cultura que produziram uma maior quantidade de massa de micélio foram
MMN completo, incompleto e PACH (Figura 34).
Estes resultados confiram o que foi descrito anteriormente para a amostra
comercial, à exceção do meio de cultura MMN incompleto, que na taxa relativa de
crescimento está equiparado ao meio de cultura PACH. Os resultados obtidos podem
estar relacionados com o facto desta amostra ser uma estirpe selecionada pelo produtor
por ter a capacidade de crescer muito rapidamente com concomitante aumento de massa
e volume o que será uma mais valia na produção e posterior comercialização e por ter a
capacidade de adaptação a vários meios de cultura.
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
140,00
21
TR
C (
g g
-1 d
ia-1
)
Crescimento após 21 dias
MMN Completo
MMN Incompleto
PACH
FAD
PDA
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 55
Figura 34. Taxa Relativa de crescimento (TRC) com base na massa de micélio obtida a partir da amostra
comercial de Lepista nuda.
3.1.3. Avaliação do crescimento do micélio de Lepista nuda obtido a partir
da amostra comercial, em diferentes meios de cultura sólidos sob
condições de stresse de temperatura
Ao longo do tempo, com a inoculação da amostra comercial verificou-se que o
micélio ao crescer não ficava com a cor azulada/arroxeada, tal como foi visível para a
amostra silvestre em crescimento. Uma vez que os esporos são dessa cor característica,
a causa poderia estar relacionada com uma menor produção dos mesmos nos meios de
cultura testados e respetivas condições de crescimento. Decidiu-se, então, colocar o
fungo em condições de stresse verificando, posteriormente, se essas condições
contribuiriam para o aumento da produção dos esporos como resposta do fungo ou se as
razões estariam mais relacionadas com diferenças morfológicas inerentes a diferentes
clones com origens genéticas diversas. Escolheu-se a temperatura como agente de
stresse, já que o fungo silvestre sofre alterações de temperatura quando se encontra nos
seus habitats naturais. Assim, se a amostra de fungo comercial sofresse alterações de
condições de crescimento, poder-se-ia obter micélio de cor azul/roxa.
Ao induzirmos as condições de stresse na amostra comercial, verificou-se que ao
fim de 30 dias, o micélio em todas as placas com diferentes meios de cultura e a
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
21
TR
C g
g-1
dia
-1
Crescimento após 21 dias
MMN Completo
MMN Incompleto
PACH
FAD
PDA
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 56
diferentes temperaturas (4º e 37 °C), não sofreu qualquer crescimento. Passado 20 dias,
à temperatura ambiente e ao escuro, verificou-se que houve crescimento em todas as
amostras que se encontravam no frio (4 °C). De entre as que se encontravam no quente
(37 °C), somente as crescidas em meio PACH apresentaram crescimento (Tabela 2).
O meio PACH um meio de cultura mais rico, permitindo assim que o micélio,
sobrevivesse a temperaturas elevadas (37 ºC) e crescesse com uma elevada quantidade
de nutrientes, quando colocado a temperaturas de aproximadamente de 25 °C.
O crescimento do micélio à temperatura de 4º C em todos os meios de cultura,
pode dever-se ao facto do micélio ter entrado numa fase estacionária de crescimento
devido a uma inativação enzimática temporária. Quando colocado à temperatura de
aproximadamente 25 °C, a atividade enzimática foi restaurada e o micélio começou a
crescer.
Tabela 2. Resultados de crescimento obtidos nos diferentes meios de cultura a diferentes temperaturas.
MMN
completo
MMN
incompleto
PACH FAD PDA
Temperatura de
37º C
Sem
crescimento
Sem
crescimento
Com
crescimento
Sem
crescimento
Sem
crescimento
Temperatura de
4º C
Com
crescimento
Com
crescimento
Com
crescimento
Com
crescimento
Com
crescimento
Em relação à alteração da cor verificou-se que em nenhum meio de cultura em
que houve crescimento, a cor foi alterada (Figura 35). Isto pode significar que as
condições de stresse aplicadas podem não ter influência na cor dos micélios e dos
esporocarpos. No entanto, pode-se afirmar que a temperatura ótima de crescimento do
micélio de L. nuda se encontra entre os 4 e os 37 °C. Provavelmente, a amostra
comercial do fungo já tinha muitas gerações e pode também ter sido selecionada, pelo
produtor, uma estirpe com determinadas características tais como um crescimento muito
rápido e mais produtivo. No entanto, o micélio pode ter perdido a capacidade de se
tornar azulado/arroxeado.
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 57
Figura 35. Resultados obtidos no crescimento do micélio nos diferentes meios de cultura e diferentes
temperaturas, e a cor obtida.
3.2. Composição em voláteis nas amostras de Lepista nuda comerciais e
silvestres provenientes de diferentes habitats
São poucos os estudos que descrevem os compostos voláteis presentes nos
cogumelos. No entanto, em 1989, Audouin et al., realizaram um estudo sobre os
compostos voláteis de amostras secas de L. nuda silvestre, onde descreveram o 1-octen-
3-ol como o composto predominante. Foi já demostrada a importância dos compostos
C8 (1-octen-3-ol, octanol, 3-octanol, 1-octen-3-ona, 2-octenol e 3-octanona) no sabor de
diferentes variedades de cogumelos (Noel-Suberville et al., 1996). Os últimos autores
demostraram que o composto volátil mais abundante em amostras frescas de L. nuda era
1-octen-3-ol e o principal ácido gordo era o ácido linoleico (C18: 2). Esta observação
foi confirmada no presente trabalho, tal como se pode observar na secção seguinte.
Os resultados obtidos para a composição em voláteis nas amostras estudadas,
após uma destilação-extração Likens-Nickerson, são apresentados na Tabela 3.
Identificaram-se vinte e dois compostos em cada uma das três amostras (exemplares
comerciais e provenientes de carvalhal e pinhal), constituindo 84-94% de fração volátil.
As diferenças entre os voláteis das amostras silvestres e comercial foram principalmente
quantitativas. A principal diferença foi observada na quantidade relativa de 2-
pentilfurano, presente em pequena quantidade nos cogumelos silvestres (provenientes
de carvalhal e pinhal; 2-5%; quarto composto mais abundante) e em quantidade
consideravelmente maior na amostra comercial (15%; segundo composto mais
abundante).
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 58
O 2-pentilfurano (Figura 36) tem sido descrito como um dos derivados de
compostos orgânicos voláteis da peroxidação do ácido linoleico.
Existem duas vias possíveis para a biossíntese do 2-pentilfurano a partir do ácido
linoleico: a partir das espécies reativas de oxigénio, ou a partir da via enzimática que só
existe nos fungos (Bhandari, 2011).
Figura 36. Estrutura química do composto 2-pentilfurano (Bhandari, 2011).
Os compostos voláteis com cadeias de oito carbonos (C8) são ubíquos entre
fungos e o 1-octen-3-ol é o mais abundante sendo apontado como responsável pelo
aroma característico de fungos. No presente estudo, o 1-octen-3-ol foi detetado em
pequenas quantidades em todas as amostras (vestígios-2%), o que contradiz os
resultados obtidos por Bhandari (2011). Zawirska-Wojtasiak (2004) descreveu o 1-
octen-3-ol como um composto característico dos cogumelos e que ocorre, na maioria
deles, em grandes quantidades. Assim, este composto pode ser usado para autentificar o
aroma do cogumelo em estudo.
A concentração deste composto nas três amostras foi pouco significativa, sendo
os componentes principais o linalool (17 a 27%), a pulegona (12 a 14 %) e o limoneno
(10 a 11 %), que não são comuns nas frações voláteis de outros cogumelos, mas sim em
plantas.
As amostras silvestres provenientes de carvalhal e pinhal apresentaram a maior
percentagem do composto linalol (26,4 % e 25,2 %, respetivamente) (Figura 37), em
comparação à amostra comercial (16,7 %). O composto linalol (IUPAC: 3,7-dimetil-
1,6-octadieno-3-ol) é um álcool terpénico terciário, não saturado. Encontra-se na maioria
dos óleos essenciais, incluindo o de Lavandula (lavanda), Citrus reticulata (bergamota,
tangerina na Região Sul do Brasil), Aniba rosaeodora (pau-rosa), sendo o principal
componente. É um composto orgânico e é pouco solúvel em água como a maioria dos
compostos que fazem parte dos óleos essenciais (Web 10).
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 59
Figura 37. Estrutura do linolol (3,7-dimetil-1,6-octadieno-3-ol) (Web 10).
O segundo composto mais abundante nas amostras silvestres provenientes de
carvalhal (13,7 %) e pinhal (14,3 %) foi a pulegona (Figura 38); já na amostra de
comercial (12,1 %) foi o terceiro mais abundante, mas com uma percentagem similar às
anteriores.
A pulegona tem uma ocorrência natural e é um composto orgânico obtido a
partir de óleos essenciais de uma variedade de plantas, tais como Nepeta cataria
(catnip- erva dos gatos), Mentha piperita, (hortelã pimenta) e Mentha pulegium (poejo).
É classificado como um monoterpeno, é um líquido oleoso incolor e tem um odor
agradável, semelhante ao poejo, hortelã-pimenta e cânfora. É utilizado em agentes
aromatizantes, em perfumaria e em aromaterapia (Web 11).
Figura 38. Estrutura química da pulegona (Web 11).
O composto limoneno (Figura 39) foi o terceiro em maior percentagem nas
amostras provenientes de carvalhal (9,5 %) e pinhal (9,9 %), e quarto na amostra
comercial (10,8 %). O limoneno (IUPAC: 1-metil-4-isopropenilcilohex-1-eno) é uma
substância química, orgânica, natural, pertencente à família dos terpenos, classe dos
monoterpenos, de fórmula molecular C10H16, encontrada em frutos cítricos (cascas
principalmente de limões e laranjas), volátil e, por isso, responsável pelo cheiro que
esses frutos apresentam. Nos últimos anos, a sua requisição tem aumentado muito
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 60
devido ao uso em solventes biodegradáveis. Por possuir um centro quiral,
concretamente um carbono assimétrico, apresenta isomeria ótica. Portanto, existem dois
isómeros óticos: o D-limoneno e o L-limoneno. A nomenclatura IUPAC correta é R-
limoneno e S-limoneno, porém empregam-se com mais frequência os prefixos D e L ou
alfa e beta. Além de solvente industrial também apresenta aplicações como componente
aromático, ou em dissolventes de resinas, pigmentos, tintas, na fabricação de adesivos,
etc., e é usado amplamente na síntese de novos compostos. Por ser um derivado dos
citrinos, o limoneno pode ser considerado um agente de transferência de calor e
ambientalmente inócuo, pelo que é utilizado em muitos processos farmacêuticos e de
alimentos, por exemplo, como componente aromático e para dar sabor na obtenção de
sabores artificiais de menta e na fabricação de doces e pastilhas elásticas (Web 12).
Figura 39. Estrutura química do limoneno, (Web 12)
A fração volátil das diferentes amostras em estudo foi, certamente, influenciada
pelo habitat de proveniência dos corpos frutíferos. Cho et al. (2008), referem que os
perfis dos componentes voláteis podem variar com as espécies e variedades, mas que
também podem ser influenciados pelas condições de cultivo e/ou habitat.
A produção de compostos pode ser bastante sensível aos constituintes do meio
de cultura e às condições do ambiente in vivo, portanto, os compostos produzidos por
uma espécie num meio de cultura pode ser diferente quando inserida num meio de
cultura diferente (Hanson, 2008).
É de referir que foi realizada a análise dos micélios obtidos por cultura in vitro,
de amostras comerciais e de prado, seguindo a mesma metodologia referida
anteriormente. No entanto, na análise da fração volátil destas amostras, verificou-se que
a percentagem insignificante dos compostos não justificava uma quantificação e, por
consequência, apresentação dos resultados. Para uma quantificação adequada nestas
amostras seriam necessárias quantidades de micélio bastantes superiores.
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 61
Tabela 3. Composição da fração volátil, obtida por LN, de amostras de Lepista nuda comerciais e
silvestres de carvalhal e pinhal
Componentes RI Carvalhal Pinhal Comercial
α-Pineno 930 1.2 1.1 0.9
Sabineno 958 3.2 2.1 2.1
1-Octen-3-ol 961 1.7 0.5 v
β-Pineno 963 3.0 1.0 2.0
2-pentil furano 973 2.2 5.2 14.8
p-Cimeno 1003 1.7 2.4 2.5
1,8-Cineol 1005 5.6 7.0 10.7
Limoneno 1009 9.5 9.9 10.8
γ-Terpineno 1035 0.6 0.3 0.3
n-Octanol 1045 v 2.3 v
Fenchone 1057 3.5 4.7 6.7
trans-Linalol óxido 1059 1.3 1.8 4.3
Linalol 1074 26.4 25.2 16.7
α-Tuiona 1074 v 0.4 v
Cânfora 1095 5.1 5.6 6.6
Mentona 1120 v 0.3 0.6
Isoborneol 1132 1.6 1.1 0.5
Terpineno-4-ol 1148 3.8 3.6 2.5
α-Terpineol 1159 v 0.9 v
Metil chavicol (Estragol) 1163 v 0.5 v
Pulegona 1210 13.7 14.3 12.1
cis-Anetol 1220 v 1.0 v
Identificação % 84.1 91.2 94.1
Componentes agrupados
Hidrocarbonetos Monoterpénicos 24.8 16.8 18.6
Contendo oxigénio monoterpénicos 55.4 66.4 60.7
Outros 3.9 8.0 14.8
RI = Índice de Retenção em relação a n-alcanos C9-C13 na coluna DB-1; v- vestígios (% <0,05).
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 62
Estes resultados podem ajudar na compreensão da influência do habitat,
nomeadamente dos compostos presentes no solo, na fração volátil, mas também no
sabor. Podem também ser importantes ou de interesse industrial, pois estes compostos
são usados em diferentes áreas, como na perfumaria, cosmética, indústrias
farmacêuticas e outras indústrias.
3.3.Composição proximal e ácidos gordos maioritários nas amostras de
Lepista nuda comerciais e silvestres provenientes de diferentes habitats
Os resultados da composição proximal dos corpos frutíferos de amostras de
Lepista nuda comerciais e silvestres provenientes de diferentes habitats, são
apresentados na Tabela 4. A amostra comercial, que foi cultivada, apresentou os níveis
mais elevados de humidade (91 g/100 g fw), proteínas (12 g/100 g dw), glúcidos (77
g/100 g dw) e o maior valor energético (367 kcal/100 g dw). Por sua vez, as amostras
silvestres provenientes de pinhal e carvalhal apresentaram os teores mais elevados de
cinzas (12 g/100 g dw) e lípidos (2 g/100 g dw), respetivamente.
Os glúcidos foram os macronutrientes mais abundantes em todas as amostras,
enquanto os lípidos foram os menos abundantes. No entanto, enquanto os corpos
frutíferos de origem comercial revelaram níveis mais elevados de proteínas do que de
cinzas, o oposto foi observado em ambas as amostras silvestres. Este facto pode dever-
se à composição do solo em que os cogumelos cresceram (Nikkarinen & Mertanen,
2004) e ao facto das espécies silvestres absorverem níveis mais elevados de minerais.
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 63
Tabela 4. Composição proximal e ácidos gordos maioritários dos corpos frutíferos de Lepista nuda
obtidos em diferentes habitats.
Em cada linha letras diferentes representam diferenças significativas entre as amostras (p0,05). Ácido
palmítico (C16:0); Ácido esteárico (C18:0); Ácido oleico (C18:1n9c); Ácido linoleico (C18:2n6c). Foram
identificados e quantificados mais vinte e um ácidos gordos (dados não apresentados).
SFA – ácidos gordos saturados; MUFA – ácidos gordos monoinsaturados; PUFA – ácidos gordos
polinsaturados.
O valor energético obtido para a amostra silvestre proveniente de pinhal foi
semelhante ao de outra amostra do mesmo habitat (334 kcal/100 g dw) conforme
descrito anteriormente por Barros et al. (2008), mas inferior ao valor indicado por
Ouzouni et al. (2009) para uma amostra silvestre da Grécia (392 kcal/100 g dw;
calculado a partir dos dados disponíveis).
Os resultados dos ácidos gordos maioritários encontrados nas amostras
estudadas, bem como as percentagens de ácidos gordos saturados (SFA), de ácidos
gordos monoinsaturados (MUFA) e de ácidos gordos polinsaturados (PUFA) são
apresentados na Tabela 4. Foram detetados até vinte e cinco ácidos gordos na maioria
das amostras (Figura 40). O ácido gordo maioritário encontrado foi o ácido linoleico
(C18: 2n6), o que está de acordo com outros estudos (Noel-Suberville et al., 1996;
Barros et al., 2008).
O ácido oleico (C18: 1n9) e o ácido palmítico (C16: 0) também foram ácidos
gordos maioritários com diferentes ordens, dependendo da amostra. A amostra
Comercial Silvestre
Pinhal
Silvestre
Carvalhal
Humidade (g/100 g fw) 90,61± 0,96 85,52± 1,11 89,06± 0,45
Cinzas (g/100 g dw) 9,56 ± 0,06c 26,15 ± 2,42
a 13,20 ± 0,85
b
Proteínas (g/100 g dw) 12,18 ± 0,22a 8,11 ± 0,58
b 1159 ± 0,61
a
Lípidos (g/100 g dw) 1,14 ± 0,00b 1,27 ± 0,05
b 2,04 ± 0,21
a
Glúcidos (g/100 g dw) 77,12 ± 0,20a 64,47 ± 1,54
c 73,17 ± 1,17
b
Energia (kcal/100 g dw) 367,46 ± 0,16a 334,32 ± 62,30
c 357,40 ± 1,65
b
C16:0 (Percentagem relativa) 14,86 ± 0,12c 26,97 ± 078
a 20,70 ± 0,39
b
C18:0 (Percentagem relativa) 0,88 ± 0,06c 2,77 ± 0,08
a 1,55 ± 0,26
b
C18:1n9c (Percentagem relativa) 16,05 ± 0,40c 25,02 ± 1,20
b 35,74 ± 1,02
a
C18:2n6c (Percentagem relativa) 63,88 ± 0,44a 37,63 ± 0,19
b 37,71 ± 1,20
b
SFA (Percentagem relativa) 18,90 ± 0,16c 34,43 ±1,05
a 24,80 ± 0,01
b
MUFA (Percentagem relativa) 16,69 ± 0,27c 27,21 ± 1,22
b 36,74 ± 1,07
a
PUFA (Percentagem relativa) 64,41 ±0,43a 38,36 ± 0,17
b 38,46 ± 1,08
b
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 64
comercial apresentou os níveis mais elevados de PUFA (64%) devido à contribuição do
ácido linoleico, a amostra silvestre proveniente de carvalhal apresentou os níveis mais
elevados de MUFA (37%) devido aos teores mais elevados de ácido oleico, e a amostra
silvestre proveniente de pinhal revelou os níveis mais elevados de SFA (34%) devido
aos níveis mais elevados dos ácidos palmítico e esteárico.
Figura 40. Perfil em ácidos gordos do corpo frutífero de Lepista nuda silvestre proveniente de carvalhal.
1-Ácido caproico (C6:0); 2-Ácido caprílico (C8:0); 3-Ácido cáprico (C10:0); 4-Ácido láurico (C12:0); 5-
Ácido mirístico (C14:0); 6- Ácido pentadecanoico (C15:0); 7-Ácido palmítico (C16:0); 8-Ácido
palmitoleico (C16:1); 9-Ácido heptadecanoico (C17:0); 10-Ácido esteárico (C18:0); 11-Ácido oleico
(C18:1n9c); 12-Ácido linoleico (C18:2n6c); 13-Ácido α-linolénico (C18:3n3); 14-Ácido araquídico
(C20:0); 15-Ácido cis-11-eicosenoico (C20:1c); 16-Ácido cis-11,14-eicosadienoico (C20:2c); 17-Ácido
cis-11,14,17-eicosatrienoico e ácido heneicosanoico (C20:3n3+C21:0); 18-Ácido araquidónico
(C20:4n6); 19-Ácido cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoico (C20:5n3); 20- Ácido beénico (C22:0); 21-
Ácido erúcico (C22:1n9); 22-Ácido cis-13,16-docosadienoico (C22:2) 23-Ácido tricosanoico (C23:0);
24-Ácido lignocérico (C24:0); 25- Ácido nervónico (C24:1).
3.4. Composição química dos corpos frutíferos e dos micélios de Lepista
nuda
A glucose foi o açúcar maioritário em todas as amostras de micélio, enquanto a
trealose predominou nos corpos frutíferos (Tabela 5). Foi encontrado manitol no corpo
frutífero da amostra comercial e no micélio obtido em meio de cultura MMN completo
e PDA da mesma amostra, enquanto a frutose só apareceu nos corpos frutíferos das
amostras comerciais e de carvalhal.
0 5 10 15 20 25 30 35
Time (min)
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Vo
lta
ge
(mV
)
1
2 3 4 5 6
7
8 910
11
12
13 141516
1718
1920
2122 23 24 25
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 65
Os corpos frutíferos da amostra comercial revelaram os níveis mais elevados de
frutose e de manitol, enquanto as concentrações mais elevadas de glucose, trealose e
açúcares totais foram encontradas no micélio obtido em PACH (21 g/100 g dw), MMN
incompleto (5 g/100 g dw) e PACH (24 g/100 g dw), respetivamente. O perfil em
açúcares das amostras comercial e do micélio MMN completo pode ser observado na
Figura 41A.
Entre os ácidos orgânicos foi possível quantificar os ácidos cítricos, fumárico,
málico, oxálico e quínico em todas as amostras de corpos frutíferos (comercial ou
silvestres) (Tabela 5). A amostra silvestre proveniente de carvalhal originou os níveis
mais elevados dos últimos três compostos mencionados, bem como de ácidos orgânicos
totais (10 g/100 g dw). A maioria dos compostos desapareceu nas amostras de micélio
obtidas a partir de diferentes meios de cultura; apenas permaneceu o ácido oxálico,
embora em baixas quantidades.
O perfil em ácidos orgânicos das amostras comercial e de micélio obtido em
MMN completo pode ser observado na Figura 41B. Os ácidos orgânicos encontram-se
envolvidos em várias vias fundamentais do metabolismo de glúcidos, lípidos e proteínas
como produtos intermediários ou finais, nomeadamente no ciclo de Krebs, que é o ciclo
de rendimento energético central da célula (Voet et al., 2008). Portanto, é lógico que os
micélios obtidos sob condições in vitro consumam esses compostos ao longo do seu
crescimento.
O ácido p-hidroxibenzoico e um composto fenólico relacionado (ácido
cinâmico) foram encontrados nas amostras estudadas (Tabela 5). A amostra comercial
revelou o teor mais elevado em ácidos p-hidroxibenzoico e cinâmico (0,29 e 0,08
mg/100 g dw, respetivamente). Entre os micélios, o crescido em meio MMN completo
revelou a concentração mais elevada de ambos os compostos. Um estudo anterior
realizado por Barros et al. (2009) descreveu a presença de outros compostos fenólicos,
nomeadamente ácidos protocatéquico e p-cumárico e a ausência de ácido cinâmico em
amostras de L. nuda também recolhidas em Bragança (Nordeste de Portugal), mas em
2007.
Relativamente aos tocoferóis, as isoformas β- e γ-tocoferóis foram encontradas
em todas as amostras (Figura 41C), enquanto o α-tocoferol só foi detetado nos corpos
frutíferos silvestres de carvalhal e em micélio crescido em meio de cultura MMN
completo, embora em quantidades muito baixas (Tabela 5). O α-tocoferol foi também a
isoforma menos abundante nas amostras silvestres de pinhal de acordo com estudos
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 66
anteriores (Barros et al., 2008) e o -tocoferol esteve também ausente noutras amostras
de Lepista nuda estudadas por diferentes autores (Elmastas et al., 2007; Barros et al.,
2008). Os meios de cultura PDA, PACH e FAD demostraram ser os melhores para a
produção de tocoferóis (6-7 mg/100 g dw). Num trabalho anterior realizado por Reis et
al. (2011) foi possível observar um aumento dos níveis de -tocoferol em micélio de
fungo ectomicorrízico produzido in vitro quando comparado com os seus corpos
frutíferos, o que neste trabalho também se observou para a isoforma β-.
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 67
Tabela 5. Composição em açúcares, ácidos orgânicos, compostos fenólicos e tocoferóis dos corpos frutíferos de Lepista nuda provenientes de diferentes habitats e do micélio
obtido, in vitro, em diferentes meios de cultura.
Amostra comercial de corpo frutífero e micélio obtido in vitro Amostras silvestres de corpo
frutífero
Corpo frutífero MMN completo MMN incompleto PDA PACH FAD Pinhal Carvalhal
Frutose 0,17 ± 0,01a nd nd nd nd nd nd 0,13 ± 0,02
b
Glucose nd 6,12 ± 0,17c 6,94 ± 0,13
c 3,73 ± 0,44
d 21,15 ± 0,54
a 11,88 ± 0,59
b 1,18 ±0,02
e 1,12 ± 0,02
e
Manitol 1,63 ± 0,02a 0,27 ± 0,01
c nd 0,45 ± 0,19
b nd nd nd nd
Trealose 1,85 ± 0,00f 4,79 ± 0,10
b 5,35 ± 0,09
a 3,02 ± 0,30
d 3,17 ± 0,05
d 2,25 ± 0,03
e 3,97 ± 0,11
c 2,25 ± 0,02
e
Total (g/100 g dw) 3,65 ± 0,01d 13,60 ± 0,16
b 12,30 ± 0,04
cb 11,20 ± 2,03
c 24,32 ± 0,59
a 14,13 ± 0,62
b 5,16 ± 0,09
d 3,50 ± 0,05
d
Ácido cítrico 0,57 ± 0,04a nd nd nd nd v 0,25 ± 0,01
c 0,35 ± 0,04
b
Ácido fumárico 0,02 ± 0,00c v v v v v 0,07 ± 0,00
a 0,06 ± 0,00
b
Ácido málico 1,75 ± 0,19a nd nd nd nd v 1,39 ± 0,05
b 1,79 ± 0,02
a
Ácido oxálico 2,41 ± 0,31c 0,88 ± 0,06
d 1,02 ± 0,04
d 0,05 ± 0,01
e 0,07 ± 0,00
e v 3,09 ± 0,02
b 3,49 ± 0,00
a
Ácido quínico 3,08 ± 0,18b nd nd nd nd v 2,43 ± 0,01
c 3,89 ± 0,00
a
Total (g/100 g dw) 7,83 ± 0,11b 0,88 ± 0,06
d 1,02 ± 0,04
d 0,05 ± 0,01
e 0,07 ± 0,00
e v 7,23 ± 0,01
c 9,59 ± 0,28
a
Ácido p-hidroxibenzoico 0,29 ± 0,03a 0,13 ± 0,01
cb 0.04 ± 0,00
d v tr nd 0,10 ± 0,01
c 0,15 ± 0,02
b
Ácido cinâmico (mg/100 g dw) 0,08 ± 0,01a 0,01 ± 0,00
b nd nd nd nd v 0,01 ± 0,00
b
α-Tocoferol v 0,03 ± 0,00a nd nd nd nd v 0,01 ± 0,00
b
β-Tocoferol 0,01 ± 0,00b 0,26 ± 0,00
b 0,05 ± 0,00
b 6,41 ± 0,22
a 6,32 ± 0,22
a 6,40 ± 0,22
a 0,02 ± 0,00
b 0,07 ± 0,00
b
γ-Tocoferol 0,03 ± 0,01d 0,08 ± 0,02
cb 0,11 ± 0,00
b 0,20 ± 0,02
a 0,06 ± 0,00
cd 0,20 ± 0,02
a 0,04 ± 0,00
de 0,05 ± 0,00
cde
Total (mg/100 g dw) 0,03 ± 0,02b 0,37 ± 0,02
b 0,15 ± 0,01
b 6,61 ± 0,21
a 6,38 ± 0,23
a 6,38 ± 0,23
a 0,15 ± 0,01
b 0,38 ± 0,02
b
Em cada linha letras diferentes representam diferenças significativas entre as amostras (p0,05). nd - não detetado; v - vestígios.
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 68
Figura 41. (A) Perfil em açúcares da amostra comercial (____) e do micélio MMN completo (----): MP- fase
móvel; 1- frutose; 2- glucose; 3- manitol; 4- trealose; 5- rafinose (PI); (B) Perfil em ácidos orgânicos da amostra
comercial (____) e do micélio MMN completo (----): MP- fase móvel; 1- ácido oxálico; 2- ácido quínico; 3- ácido
málico; 4- ácido cítrico; 5- ácido fumárico; (C) Perfil em tocoferóis da amostra de carvalhal (____) e da amostra de
micélio FAD (----): MP- fase móvel; 1- α-tocoferol; 2- BHT; 3- β-tocoferol; 4- γ-tocoferol; 5- tocol (PI).
Time (min)0 5 10
150V
olt
age (
mV
)
0
50
100
23
4 5
MP
1
1
2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0Time (min)
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
2500
2750
3000
3250
3500
MP
2
34
5
Vo
lta
ge (
mA
U)
Time (min)0 5 10 15
200
Vo
lta
ge (
mV
)
0
50
100
150 3
2
1
MP
4 5
(A)
(B)
(C)
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 69
3.5. Atividade antioxidante dos corpos frutíferos e dos micélios de Lepista
nuda
Para estudar a atividade antioxidante das amostras foram realizadas cinco
metodologias: os ensaios de Folin-Ciocalteu e do ferricianeto/azul da prússia que
avaliam o poder redutor, o ensaio do DPPH para avaliar a capacidade captadora de
radicais livres e os ensaios do β-caroteno/linoleato e de TBARS para avaliar a inibição
da peroxidação lipídica. Os resultados são apresentados na Tabela 6 e evidenciam que o
meio de cultura MMN incompleto é o mais indicado para aumentar a atividade
antioxidante de Lepista nuda. O micélio crescido neste meio originou a atividade
antioxidante mais elevada em todos os ensaios: os valores mais elevados no ensaio de
Folin-Ciocalteu, expressos em equivalentes de ácido gálico, e os valores mais baixos de
EC50 nos outros ensaios, o que significa maior poder redutor ou potencial antioxidante.
Neste estudo, as amostras silvestres originaram uma menor atividade captadora de
radicais DPPH e inibição da descoloração do β-caroteno, mas um maior poder redutor e
inibição TBARS do que aqueles descritos noutros trabalhos (Elmastas et al., 2007;
Barros et al., 2008).
Resultados e Discussão
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 70
Tabela 6 Atividade antioxidante dos corpos frutíferos de Lepista nuda provenientes de diferentes habitats e do micélio obtido, in vitro, em diferentes meios de cultura.
Amostra comercial de corpo frutífero e micélio obtido in vitro Amostras silvestres de corpo
frutífero
Corpo
frutífero
MMN completo MMN incompleto PDA PACH FAD Pinhal Carvalhal
Poder redutor
Ensaio Folin-Ciocalteu
(mg GAE/g extrato) 20,54 ± 0,31
d 30,27 ± 3,30
b 33,57 ± 2,25
a 17,01 ± 1,01
e 24,30 ± 1,39
c 9,19 ± 1,06
f 15,98 ± 1,23
e 16,57 ± 0,44
e
Ensaio ferricianeto/azul da
prússia
(EC50; mg/mL)
1,50 ± 0,01c 0,53 ± 0,03
f 0,51 ± 0,00
f 1,52 ± 0,04
c 1,02 ± 0,02
e 1,95 ± 0,02
b 2,08 ± 0,00
a 1,44 ± 0,02
d
Atividade
Captadora
Ensaio da atividade
sequestradora DPPH
(EC50; mg/mL)
8,73 ± 0,48cb
5,72 ± 0,49cb
3,67 ± 0,05c 6,78 ± 0,07
cb 9,55 ± 0,95
cb 102,75 ± 23,03
a 16,05 ± 0,18
b 15,48 ± 0,23
cb
Inibição da
peroxidação
lipídica
Ensaio β-caroteno/linoleato
(EC50; mg/mL) 9,48 ± 1,02
d 16,67 ± 0,98
ba 8,02 ± 1,35
e 10,15 ± 0,89
d 15,50 ± 0,43
b 17,50 ± 0,70
a 12,24 ± 0,57
c 11,68 ± 0,61
c
Ensaio TBARS
(EC50; mg/mL) 1,75 ± 0,16
bc 3,52 ± 0,31
b 0,87 ± 0,04
c 3,35 ± 0,66
b 2,21 ± 0,46
bc 5,44 ± 0,43
ba 3,76 ± 0,53
b 8,17 ± 1,75
a
Em cada linha letras diferentes representam diferenças significativas entre as amostras (p0,05).
Relativamente ao ensaio de Folin-Ciocalteu, valores mais elevados significam maior poder redutor; para os outros ensaios, os resultados são apresentados em valores de EC50,
o que significa que valores mais elevados correspondem a um menor poder redutor ou atividade antioxidante. EC50: Concentração de extrato correspondente a 50% de
atividade antioxidante ou 0,5 de absorvância para o ensaio do ferricianeto/azul da prússia.
Conclusões e Perspetivas Futuras
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 72
IV. CONCLUSÕES E PERSPETIVAS FUTURAS
Neste trabalho, analisou-se o crescimento do fungo Lepista nuda, testando cinco
meios de cultura diferentes e verificando as taxas de crescimento em situações de
stresse associadas a temperaturas extremas. Avaliou-se ainda a composição química e as
propriedades antioxidantes dos micélios obtidos, assim como de corpos frutíferos
comerciais e silvestres provenientes de diferentes habitats. Dos meios de cultura
testados, o meio MMN completo permitiu um melhor crescimento e desenvolvimento
do macrofungo L. nuda.
Se o fungo for sujeito a altas temperaturas (condições de stresse), só em meios
muito ricos é que voltou a crescer, no entanto em temperatura baixas, cresceu em
qualquer um dos meios de cultura testados. Assim, podemos dizer que a temperatura de
crescimento deste macrofungo estará situada entre os 4 a 30 °C.
Dos resultados obtidos podemos ainda concluir que a coloração característica do
micélio em crescimento não se relacionou com as condições de stresse testadas, ou pelo
menos essas condições não foram determinantes para a diferença morfológica entre os
micélios com origem em amostras silvestres e os micélios obtidos de amostras
comerciais. As causas desta diferente coloração poderão estar relacionadas com a
diferente origem genética de cada um dos espécimes (silvestres e comerciais) usados no
estudo; seria interessante aprofundar o conhecimento genético destes clones com
estudos de biologia molecular com ferramentas como marcadores moleculares.
Por outro lado, mais estudos relacionados com a composição bioquímica das
diferentes amostras de micélio obtidas de origens diferentes poderiam mostrar se a
composição do micélio ou esporos diferem muito em termos de compostos com
capacidade para conferir cor, nomeadamente pigmentos.
As amostras de corpos frutíferos comerciais e silvestres, provenientes de
carvalhal e pinhal, revelaram a presença dos mesmos compostos voláteis, embora em
percentagens diferentes. Os compostos maioritários foram, em geral, similares aos
encontrados nas frações voláteis das plantas: linolol, pulegona, limoneno e 2-
pentilfurano. Estes resultados demostram a importância do habitat no desenvolvimento
dos fungos.
Os corpos frutíferos da amostra comercial evidenciaram a maior contribuição
energética e o maior conteúdo em PUFA devido à contribuição do ácido linoleico, bem
como de compostos fenólicos; a amostra silvestre de carvalhal apresentou os níveis
Conclusões e Perspetivas Futuras
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 73
mais elevados de ácidos orgânicos. As amostras de micélio demostraram possuir teores
elevados de glucose, tocoferóis e elevada atividade antioxidante. Em particular, o meio
PACH demonstrou ser o mais adequado para a produção de glucose, os meios PDA,
PACH e FAD para produção de β- e -tocoferóis, o meio MMN completo para obtenção
de compostos fenólicos e o MMN incompleto para melhorar as propriedades
antioxidantes.
A cultura in vitro poderá ser explorada para obtenção de compostos bioativos de
macrofungos para aplicações industriais, controlando as condições ambientais de
desenvolvimento para produzir uma maior quantidade desses compostos e para superar
a diversidade da composição química observada em amostras provenientes de diferentes
habitats.
O presente trabalho visou a otimização das condições de cultura in vitro do
macrofungo L. nuda; o micélio, assim obtido, poderá ser utilizado como fonte de
compostos voláteis de interesse para a cosmética, perfumaria, indústrias farmacêuticas,
alimentares, entre outras indústrias. Para além dos voláteis, alguns compostos bioativos
com interesse industrial poderão também ser extraídos e isolados.
O presente trabalho poderá ser alargado ao estudo de exemplares provenientes
de outros habitats diferentes dos visados neste trabalho. Também deverão ser
otimizadas outras condições de cultura nomeadamente, pH, humidade e luz.
Bibliografia
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 75
V. BIBLIOGRAFIA
5.1. Artigos e Livros
AOAC, 1995. Official methods of analysis (16th Ed.). Arlington VA, USA: Association
of Official Analytical Chemists.
Audouin P., Vidal J-P., Richard, H., 1989. Volatile compounds from aroma of some
edible mushrooms: morel (Morchella conica), wood blewit (Lepista nuda), clouded
agaric (Clitocybe nebularis) and false chanterelle (Hygrophoropsis aurantiaca). Sci.
Aliments, 9, 185-193.
Barreiros A. L. B., David J. M., David J. P., 2006. Estresse oxidativo: Relação entre
geração de espécies reativas e defessa do organismo. Química Nova Vol. 29, No. 1,
113-123.
Barros L., Baptista P., Correia D.M., Casal S., Oliveira B., Ferreira, I.C.F.R., 2007.
Fatty acid and sugar compositions, and nutritional value of five wild edible
mushrooms from Northeast Portugal. Food Chem., 105, 140-145.
Barros L., Dueñas M., Carvalho A.M., Ferreira I.C.F.R., Santos-Buelga C., 2012.
Characterization of phenolic compounds in flowers of wild medicinal plants from
Northeastern Portugal. Food and Chemical Toxicology, 50, 1576-1582.
Barros L., Dueñas M., Ferreira I.C.F.R., Baptista P., Santos-Buelga C., 2009. Phenolic
acids determination by HPLC-DAD-ESI/MS in sixteen different Portuguese wild
mushrooms species. Food and Chemical Toxicology, 47, 1076-1079.
Barros L., Venturini B., Baptista P., Estevinho L., Ferreira, I.C.F.R., 2008. Chemical
composition and biological properties of Portuguese wild mushrooms: A
comprehensive study. J. Agric. Food Chem., 56, 3856-3862.
Bhandari S., 2011. 2-pentylfuran: biosynthesis by Aspergillus fumigatus in-vitro and
investigation of confounders of a breath test in-vivo. A Thesis Submitted for the
Degree of Doctor of Philosophy at the University of Otago, Dunedin, New Zealand.
Bravo L., 1998. Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional
significance. Nutrition Reviews, 56, 317 – 333.
Breheret S., Talou T, Raptor S., Bessiére J-M., 1997. Monoterpenes in the Aromas of
Fresh Wild Mushrooms. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, 831-836.
Carlile M.J., Watkinson S.C., Gooday G.W., 2001. The Fungi. Academic Press, 2nd
Edition. Hungary.
Bibliografia
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 76
Chang S.T., Miles P.G., 2004. Mushrooms: Cultivation, Nutritional Value, Medicinal
Effect and Environmental Impact –2nd ed., 1-10, 27-35, 40-47.
Cho I.H., Namgung H–J., Choi H–K., Kim Y–S., 2008. Volatiles and key odorants in
the pileus and stipe of pine-mushroom (Tricholoma matsutake Sing.). Food
Chemistry 106 71–76.
Coelho M.T., 1999. Influência da concentração de CO2 na aclimatização de plantas de
castanheiro regeneradas in vitro. Master Thesis, Universidade de Évora, Portugal.
Cunha A. P., 2005. Farmacognosia e Fitoquímica. Fundação Calouste Gulbenkian,
Lisboa.
Cunha A. P., Ribeiro J.A., Roque O.R., 2007. Plantas aromáticas em Portugal
Caracterização e Utilizações. Fundação Calouste Gulbenkian, Lisboa.
Dix N., Webster, J., 1995. Fungal Ecology. Chapman & Hall, London.
Dulger B., Ergul C., Gucin F., 2002. Antimicrobial activity of the macrofungus Lepista
nuda. Fitoterapia. 73, 695-697.
Elmastas M., Isildak O., Turkekul I., Temur N., 2007. Determination of antioxidant
activity and antioxidant compounds in wild edible mushrooms. Journal of Food
Composition and Analysis. 20, 337-345.
Fang Y-Z, Yang S., Wu G., 2002. Free radicals, antioxidants and nutrition. Nutrition,
18, 872 – 879.
Feofilova E. P., 2001. The Kingdom fungi: Heterogeneity of physiological and
biochemical properties and relationships with plants, animals, and prokaryotes
(Review). Applied Biochemistry and Microbiology, 37, 124 – 137.
Ferreira I.C.F.R., Barros L., Abreu,R.M.V., 2009. Antioxidants in wild mushrooms.
Current Medicinal Chemistry, 16, 1543 – 1560.
Ferry B.W., Das N., 1968. Carbon Nutrition of some Mycorrhizal Boletus Species.
Trans. Brit. Mycol. Soc.. 51, 795-798.
Frade B.L., Alfonso A.T., 2005. Guía de campo de los hongos de la Península Ibérica.
Cd, Celarayn Editorial. León.
Grangeia C., Heleno S.A., Barros L., Martins A., Ferreira I.C.F.R., 2011. Effects of
trophism on nutritional and nutraceutical potential of wild edible mushrooms. Food
Res. Int. 44, 1029-1035.
Guinberteau J., Olivier J-M., Bordaberry M.R., 1989. Données récentes sur la culture
des “pieds bleus” (Lepista sp.). (Recent data about blewit cultivation (Lepista sp.).
Pépiniériste-Horticulteurs-Maraıchers Rev. Hortic. 298, 17-22.
Bibliografia
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 77
Gutteridge J.M., Halliwell B., 2000. Free radicals and antioxidants in the year 2000. A
historical look to the future. Annuals of the New York Academy of Sciences, 899,
136 – 147.
Hall C., 2001. Sources of natural antioxidants: oilseeds, nuts, cereals, legumes, animal
products and microbial sources. In: Pokomý, J., Yanishlieva, N., Gordon, M. (Eds.),
Antioxidants in food: practical applications. Woodhead Publishing Limited, United
Kingdom.
Hanson J.R., 2008. The Chemistry of Fungi. Royal Society of Chemistry, United
Kingdom.
Hawksworth D.L., 2001. The magnitude of fungal diversity: the 1,5 million species
estimate revised. Mycological Research, 105, 1422 – 1432.
Heleno S.A., Barros L., Sousa M.J., Martins A., Ferreira I.C.F.R., 2009. Study and
characterization of selected nutrients in wild mushrooms from Portugal by gas
chromatography and high performance liquid chromatography. Microchemical
Journal, 93, 195-199.
Heleno C., Heleno S.A., Barros L., Martins A., Ferreira I.C.F.R., 2011. Effects of
trophism on nutritional and nutraceutical potential of wild edible mushrooms. Food
Res. Int., 44, 1029-1035.
Hoseney R., 1991. Princípios de ciencia y tecnologia de los cereales. Zaragoza:
Acribia, 320 p.
James T.Y., Kauff F., Schoch C., et al,. 2006(a). Reconstructing the early evolution of
los cereales. Zaragoza: Acribia, 320 p.
James, T.Y., Letcher, P.M., Longcore, J.E., Mozley-Standridge, S.E., Porter, D.,
Powell, M.J., Griffith, G.W., & Vilgalys, R., 2006(b). A molecular phylogeny of the
flagellated Fungi (Chytridiomycota) and a proposal for a new phylum
(Blastocladiomycota). Mycologia, 98, 860-871.
Kalač P., 2009. Chemical composition and nutritional value of European species of wild
growing mushrooms: A review. Food Chem., 113, 9-16.
Keizer G. J., 2000. La enciclopédia de las setas. Editorial Libsa. Madrid.
Kirk P.M., Cannon P.F., David J.C., Stalpers J.A., 2008. Dictionary of Fungi, 10th
Edition. CABI Publishing, United Kingdom.
Lindequist U., Niedermeyer T.H.J., Jülich W-D., 2005. The pharmacological potential
of mushrooms. eCAM, 2, 285-299.
Bibliografia
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 78
Liu R.H., 2003. Health benefits of fruit and vegetables are from additive and synergistic
combinations of phytochemicals. American Journal of Clinical Nutrition, 78, 517S –
520S.
Marriott P.J., Shellie R., Cornwell C., 2001. Gas chromatographic technologies for the
analysis of essential oils. J. Chromatog. A, 936, 1-22.
Martins X.F., 2004. Cogumelos – Património Natural Transmontano. João Azevedo
Editor, Portugal, Vol 1, 19-101.
Marx D.H., 1969. The influence of ectotrophic fungi on the resistance of pine roots to
pathogenic infections. I. Antagonism of mycorrhizal fungi to root pathogenic fungi
and soil bacteria. Phytopathology, 59, 153-163.
Matkowski A., 2008. Plant in vitro culture, for the production of antioxidants- A
review. Biotechnology Advances. 26, 584-560.
Miller D.M., Buettner G.R., Aust S.D., 1990. Transition metals as catalysts of
antioxidation reactions. Free Radical Biology & Medicine, 8, 95 – 108.
Molyneux P., 2004. The use of stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for
estimating antioxidant activity. Songklanakarin Journal of Science and Technology,
26, 211 – 219.
Montini R.M.C., 2001. Efeito de linhagens e substrato no crescimento miceliano e
produtividade em cultivo axênico do cogumelo Shiitake (Lentinula edoles (Berk.)
Pegler). Tese de Doutor em Agronomia – Área de Concentração em Energia na
Agricultura. Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP - Câmpus de Botucatu,
Brasil.
Moser M., 1983. Keys to Agarics and Boleti. Cd Roger Phillips, London.
Moore D., 1994. Tissue formation. In: Gow, N.A.R., Gadd, G.M. (Ed.), The Growing
Fungus. Chapman & Hall, London.
Nikkarinen M., Mertanen E., 2004. Impact of geological origin on trace element
composition of edible mushrooms. J. Food Compos. Anal. 17, 301-310.
Noel-Suberville C., Cruz C., Guinberteau J., Montury M., 1996. Correlation between
fatty acid content and aromatic compound release in fresh blewit (Lepista nuda). J.
Agric. Food Chem. 44, 1180-1183.
Noel-Suberville, Pachlewski R., 1967. Mikotrofizm systemu korzeniowego: Zarys
Fizjologii Sosny Zwyczajnej. Red. S Bialobok and Zelawski. PWN Warszawa,
Poznan.
Bibliografia
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 79
Ouzouni P.K., Petridis D., Koller W.-D., Riganakos K.A., 2009. Nutritional value and
metal content of wild edible mushrooms collected from West Macedonia and Epirus,
Greece. Food Chemistry, 115, 1575–1580.
Pachlewski R., 1967. Mikotrofizm systemu korzeniowego: Zarys Fizjologii Sosny
Zwyczajnej. Red. S Bialobok and Zelawski. PWN Warszawa, Poznan,
Pereira E., Barros L., Martins A., Ferreira I.C.F.R., 2012. Towards chemical and
nutritional inventory of Portuguese wild edible mushrooms in different habitats.
Food Chem. 130, 394-403.
Pinto J.F., 2010. Nutraceuticos e alimentos funcionais. Lidel – edicoes tecnicas, lda.
Lisboa – Porto.
Quadrante Natural, 2010. Espécies Cultiváveis, Curso prático: cultivo de cogumelos. 26
e 27 de novembro. Instituto Politécnico de Bragança.
Reis F.S., Ferreira I.C.F.R., Barros L., Martins A., 2011. A comparative study of
tocopherols composition and antioxidant properties of in vivo and in vitro
ectomycorrhizal fungi. LWT, 44, 820-824
Rueda J. A. O., 2007. Hongo y Setas- Tesoro de neutros montes, 2º Edición. Ediciones
Cálamo, Palencia.
Seif E., Leigh J., Liu Y., Roewer I., Forget L., Lang B.F., 2005. Comparative
mitochondrial genomics in zygomycetes: bacteria-like RNase P RNAs, mobile
elements and a close source of the group I intron invasion in angiosperms. Nucleic
Acids Research, 33, 734-744.
Stojković D., Soković M., Glamočlija J., Džamić A., Ćirić A., Ristić M., Grubišić D.,
2011. Chemical composition and antimicrobial activity of Vitex agnus-castus L.
fruits and leaves essential oils. Food Chemistry 128, 1017–1022.
Stott K., Broderick A., Nair T., 1996. Investigation into cultivation parameters for
Australian species of Lepista. In: Royse, D.J. (ed.), Mushroom Biology and
Mushroom Products. Penn State University. pp. 285-291.
Stott K., Desmerger C., Holford P., 2005. Relationship among Lepista species
determined by CAPS and RAPD. Mycological Research, 109 (2): 205–21. The
British Mycological Society. United Kingdom.
Tapiero H., Townsend D.M., Tew K.D, 2004. Organosulfur compounds from alliaceae
in the prevention of human pathologies. Biomed Pharmacother. 58, 183-193.
Temple N. J., 2000. Antioxidants and disease: More questions than answers. Nutrition
Research, 20, 449 – 459.
Bibliografia
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 80
Valko M., Liebfritz D., Moncol J., Cronin M.T.D., Mazur M., et al., 2007. Free
radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. The
International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 39, 44 – 84.
Vaz J.A., Barros L., Martins A., Morais J.S., Vasconcelos M.H., Ferreira I.C.F.R., 2011.
Phenolic profile of seventeen Portuguese wild mushrooms. LWT- Food Science and
Technology, 44, 343-346.
Voet D., Voet J., Pratt C., 2008. Fundamentals of Biochemistry. 3rd edition, John Wiley
Webster J., Weber R.W.S., 2007. Introduction to Fungi. 3rd Edition. Cambridge
University Press, United Kingdom.
Wojtasiak R-Z., 2004. Optical purity of (R)-())-1-octen-3-ol in the aroma of various
species of edible mushrooms. Food Chemistry 86 113–118
Worrall J.J., 1999. Structure and Dynamics of Fungal Populations. Kluwer Academic
Publishers, Netherlands.
Wright S., Hayes W., 1978. Nutrition and fruitbody formation of Lepista nuda (Bull. Ex.
Fr.) Cook. In: Delmas, J. (ed.), Mushroom Science X (part 1). Burdeos. pp. 873-884.
Wright J.S., Johnson E.R., DiLabio G.A., 2001. Predicting the activity of phenolic
antioxidants: theoretical method, analysis of substituent effects, and application to
major families of antioxidants. Journal of the American Chemical Society, 123, 1173
– 1183.
Young A.J., Lowe G.M., 2001. Antioxidant and prooxidant properties of carotenoids.
Arch. Biochem. Biophys., 385, 20-27.
Bibliografia
Caracterização química e propriedades antioxidantes de amostras de Lepista nuda (Bull.) obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats 81
5.2.Internet
Web 1- Mundo educação (2012), última consulta a 10/2012, disponível em:
http://www.mundoeducacao.com.br/biologia/os-fungos.htm.
Web 2- Zoologia (2006), última consulta a 10/2012, disponível em:
http://www.ebah.com.br/content/ABAAAfKHAAD/zoologia.
Web 3- Simbiotica.org, última consulta a 10/2012, disponível em:
http://www.simbiotica.org/tiposfungos.htm
Web 4- http://www.eolss.net/Sample-Chapters/C17/E6-58-06-03.pdf; Última consulta a 10/2012
Web 5- Faculty Centre of Biodiversity (2012), última consulta a 10/2012, disponível
em:
http://www.botanik.univie.ac.at/mycology/research.htm
e Flickr (2012) disponível em:
http://www.flickr.com/photos/fl12345/galleries/72157622719293039
Web 6 – Wikipedia- the free encyclopedia (2012), última consulta a 10/2012, disponível
em:
http://en.wikipedia.org/wiki/1-Octen-3-ol
Web 7- Gruppo Micologico (2005), última consulta a 10/2012, disponível em:
http://www.mtsn.tn.it/bresadola/gallery.asp?code=11&lang=eng
Web 9- Copyright© (2012) Scribd Inc., última consulta a 10/2012, disponível em:
http://pt.scribd.com/doc/51759264/Fisiologia-de-fungos-GRD-1
Web 8- Copyright© (2012) Scribd Inc., última consulta a 10/2012, disponível em:
http://pt.scribd.com/doc/90561179/CD-1
Web 10- Wikipedia- the free encyclopedia (2012), última consulta a 10/2012,
disponível em:
http://fr.wikipedia.org/wiki/Linalol
Web 11-Wikipedia- the free encyclopedia (2012), última consulta a 10/2012, disponível
em:
http://pt.wikipedia.org/wiki/Pulegona
Web 12- Wikipedia- the free encyclopedia (2012), última consulta a 10/2012,
disponível em:
http://pt.wikipedia.org/wiki/Limoneno
Anexos
Caracterização e comparação da fração volátil e fenólica de amostras de Lepista nuda obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats
VI. ANEXOS
6.1.Composição do meio de cultura Melin-Norkans Modificado (MMN
completo); pH 6,
Composto Concentração (g/L)
NaCl 0,025
(NH4)2 HPO4 0,250
KH2PO2 0,500
FeCl3 0,005
MgSO4.7H2O 0,150
Tiamina 1,00 × 10-4
CaCl2 0,050
Casamino ácidos 1,00
Extrato de malte 5,00
Glucose 10,0
Agar 20,0
6.2. Composição do meio de cultura sólido Incompleto (MMN incompleto);
pH 6,6.
Composto Concentração (g/L)
NaCl 0,025
(NH4)2 HPO4 0,250
KH2PO4 0,500
FeCl3 0,005
MgSO4.7H2O 0,150
Tiamina 1,00 × 10-4
CaCl2 0,050
Glucose 10,00
Agar 20,00
Anexos
Caracterização e comparação da fração volátil e fenólica de amostras de Lepista nuda obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats
6.3. Composição do meio de cultura Agar Batata Dextrose (PDA), pH
5,6±0.2.
Composto Concentração (g/L)
Infusão de Batata 200,00
Dextrose 20,00
Agar 15,00
6.4. Composição do meio de cultura Pachlewski (PACH); pH 5,4.
Composto Concentração (g/L)
C4H12N2O6 0,500
Fe EDTA 0,200
KH2PO4 1,000
H3BO3 0,003
CuCl2.2H2O 0,001
MnCl2.2H2O 0,0030
NaMO4.2H2O 0,00027
ZnSO4.7H2O 0,00
MgSO4.7H2O 5,00
Tiamina 1,00 × 10-4
CaCl2.2H2O 0,500
Maltose 5,00
Glucose 20,00
Agar 14,00
Anexos
Caracterização e comparação da fração volátil e fenólica de amostras de Lepista nuda obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats
6.5. Composição do meio de cultura Ferry & Das. (FAD), pH 5,0.
Composto Concentração (g/L)
KH2PO4 0,50
MgSO4.7H2O 0,50
NH4Cl 0,50
Extrato de Malte 5,00
Glucose 20,0
Agar 14,0
6.6. Curva de crescimento do micélio obtido a partir da amostra de prado,
em meio de cultura MMN completo
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
0 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41
Ra
io d
e m
icél
io (
R)
(cm
)
Dias
Meio de cultura
MMN Completo
Anexos
Caracterização e comparação da fração volátil e fenólica de amostras de Lepista nuda obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats
6.7. Curva de crescimento em meio de cultura MMN incompleto da amostra
do prado
6.8. Curva de crescimento em meio de cultura PACH da amostra do prado
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
0 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25
Ra
io d
e m
icél
io (
R)
(cm
)
Dias
Meio de cultura
MMN Incompleto
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
0 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53
Rai
o d
e m
icé
lio (
R)
(cm
)
Dias
Meio de culturaPACH
Anexos
Caracterização e comparação da fração volátil e fenólica de amostras de Lepista nuda obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats
6.9. Curva de crescimento em meio de cultura FAD da amostra do prado
6.10. Curva de crescimento em meio de cultura PDA da amostra do prado
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
0 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45
Ra
io d
e m
icél
io (
R)
(cm
)
Dias
Meio de cultura FAD
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
0 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69
Ra
io d
e m
icél
io (
R)
(cm
)
Dias
Meio de
cultura…
Anexos
Caracterização e comparação da fração volátil e fenólica de amostras de Lepista nuda obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats
6.11. Curva de crescimento em meio de cultura MMN Completo da
amostra comercial
6.12. Curva de crescimento em meio de cultura MMN Incompleta da
amostra comercial
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
0 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29
Rai
o d
e m
icé
lio (
R)
(cm
)
Dias
Meio de culturaMMN Completo
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
0 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21
Rai
o d
e ic
élio
(R
) (c
m)
Dias
Meio de culturaMMN Incompleto
Anexos
Caracterização e comparação da fração volátil e fenólica de amostras de Lepista nuda obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats
6.13. Curva de crescimento em meio de cultura PACH da amostra
comercial
6.14. Curva de crescimento em meio de cultura FAD da amostra
comercial
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
0 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25
Rai
o d
e m
icé
lio (
R)
(cm
)
Dias
Meio de cultura PACH
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31
Rai
o d
e m
icé
lio (
R)
(cm
)
Dias
Meio de cultura FAD
Anexos
Caracterização e comparação da fração volátil e fenólica de amostras de Lepista nuda obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats
6.15. Curva de crescimento em meio de cultura PDA da amostra
comercial
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61
Rai
o d
e m
icé
lio (
R)
(cm
)
Dias
Meio decultura PDA
Anexos
Caracterização e comparação da fração volátil e fenólica de amostras de Lepista nuda obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats
Alguns dos resultados descritos nesta dissertação deram uma comunicação internacional
e uma nacional e a um artigo já submetido:
6.1.Comunicação internacional
Sara Pinto, Sousa MJ, Figueiredo AC, Barroso JG, Pedro LG, 2012 Volatiles from the
edible mushroom Lepista nuda: comparison between wild and commercial samples. 43rd
International Symposium on Essential Oils. 5 to 8 Septembe, Lisboa Portugal.
Anexos
Caracterização e comparação da fração volátil e fenólica de amostras de Lepista nuda obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats
6.2.Comunicação nacional
In I Jornadas de Jovens Investigadores da Escola Superior Agrária de Bragança
Caracterização da fracção volátil e fenólica do macrofungo Lepista
nuda de diferentes habitats e do micélio em cultura in vitro
Sara Pinto, Isabel C.F.R. Ferreira, Maria João Sousa
CIMO-Escola Superior Agrária, Instituto Politécnico de Bragança, Campus de Santa
Apolónia, Apartado 1172, 5301-855 Bragança, Portugal.
O macrofungo Lepista nuda, também conhecido como Clitocybe nuda,
pertencente ao filo Basidiomycota, à classe Basidiomycetes, à ordem Agaricales, à
família Tricholomataceae e ao género Lepista, e tem como nome comum “Pé-azul”,
encontra-se habitualmente em montados, prados e florestas naturais de azinheiras e
sobreiros. O seu período de frutificação é o Outono, Inverno e Primavera; e é um
saprófita/decompositor. É um fungo comestível, o que lhe confere um interesse
comercial devido não só, ao seu valor nutricional, mas também ao seu intenso e
característico aroma.
No presente trabalho, estudam-se exemplares comerciais e silvestres
provenientes de diferentes habitats – carvalhal, pinhal e prado (amostras in vivo), bem
como o micélio produzido in vitro a partir desses exemplares. Os principais objectivos
são:
i) Estabelecer as condições óptimas para a cultura in vitro de Lepista nuda, com
base nas curvas de crescimento do micélio, obtidas a partir do crescimento radial e da
massa fresca e seca obtidas;
ii) Caracterizar a fracção volátil das amostras obtidas in vivo e in vitro após
extracção com diferentes técnicas, entre elas a extracção por Likens-Nickerson (LN),
extracção simultânea de vapor e por hidrodestilação, arrastamento de vapor (Clevenger).
A análise dos voláteis é feita por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de
massa (GS-MS).
iii) Caracterizar a fracção fenólica das mesmas amostras após extracção sólido-
líquido e análise por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detecção por
diodos (HPLC-DAD).
Anexos
Caracterização e comparação da fração volátil e fenólica de amostras de Lepista nuda obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats
iv) Avaliar as propriedades antioxidantes das diferentes fracções (volátil e
fenólica), utilizando técnicas químicas e bioquímicas: poder redutor, efeito captador de
radicais livres e inibição da peroxidação lipídica em homogeneizados cerebrais.
Agradecimentos: À Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) e ao
COMPETE/QREN/UE pelo projecto de investigação PTDC/AGR-ALI/110062/2009.
Anexos
Caracterização e comparação da fração volátil e fenólica de amostras de Lepista nuda obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats
6.3.Artigo submetido
Chemical characterization and antioxidant properties of Lepista nuda
fruiting bodies and mycelia obtained by in vitro culture: effects of
collection habitat and culture media
SARA PINTO, LILLIAN BARROS,
MARIA JOÃO SOUSA, ISABEL C.F.R. FERREIRA
*
aCIMO-Escola Superior Agrária, Instituto Politécnico de Bragança, Campus de Santa
Apolónia, Apartado 1172, 5301-855 Bragança, Portugal.
* Author to whom correspondence should be addressed (e-mail: iferreira@ipb.pt
telephone +351-273-303219; fax +351-273-325405).
Running title: Chemical characterization and antioxidant properties of Lepista nuda
ABSTRACT
Lepista nuda is an edible mushroom which presents important organoleptic qualities
including a delicate flavor and good postharvest conservation. Its chemical and
bioactive properties can be affected by habitat collection. Therefore, the main goal of
the present work was to compare chemical composition and antioxidant potential of
Lepista nuda samples from different habitats, and mycelia produced by in vitro culture,
using different culture media. The commercial sample (cultivated) gave the highest
energetic contribution and PUFA contents due to the contribution of linoleic acid, as
also of phenolic compounds; the wild sample from oak forest gave the highest levels of
Anexos
Caracterização e comparação da fração volátil e fenólica de amostras de Lepista nuda obtidas por cultura in vitro e in vivo em diferentes habitats
organic acids. Mycelia samples showed to have higher levels of glucose, tocopherols
and antioxidant activity. Particularly, PACH medium proved to be better for glucose
production, PDA, PACH and FAD for β- and -tocopherols, complete MMN for
phenolic compounds and incomplete MMN for antioxidant properties. Overall, in vitro
culture could be explored to obtain bioactive compounds from macrofungi for industrial
applications, controlling environmental conditions to produce higher amounts of these
compounds and to overcome the diversity in chemical composition observed in samples
collected in different habitat.
KEYWORDS: Lepista nuda; Mushroom; Mycelium; Chemical compounds;
Antioxidant properties