Post on 23-Jan-2016
Transformación
Ingreso a la célula de DNA presente en el medio
Bacterias
Levaduras
Células de animales (mamíferos)
Células vegetales
Bacterias (Escherichia coli)
Plásmidos → elementos extracromosómicos de replicación autónoma
Plásmidos manipulados por ingeniería genética: vectores de clonamiento
►Origen de replicación
►Gen de resistencia a antibiótico (marcador de transformación)
►Sitio de clonamiento (“polylinker”)
Transformación (transfección) llevada a cabo por:
1. Permeabilización con CaCl2, choque de temperatura
2. Electroporación
Utilidad
►Biblioteca de cDNA - sitio de clonamiento asociado a gen de -galactosidasa
►Expresión de proteínas recombinantes - sitio de clonamiento asociado a operón
lac (expresión inducible por IPTG) y elemento que facilite purificación (ej. His-tag)
H
HO
X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
-galactosidasa
galactosa
Colonias azules : fragmento clonadoColonias blancas : sin fragmento
Productoazúl
- IPTG → expresión bloqueada+ IPTG → expresión
Levaduras (Saccharomyces cerevisiae)
Plásmidos → del tipo lanzadera (“shuttle”)► Origen de replicación en E. coli► Gen de resistencia a antibiótico (selección en E.coli)► Origen de replicación en levadura
● 2 ● ARS (secuencia de replicación autónoma)
► Marcador de selección metabólico
YACs → Cromosomas artificiales de levadura► Secuencias teloméricas► Secuencias centroméricas► Marcador de selección metabólico► ARS (secuencia de replicación autónoma)
(YAC)
Vectores y marcadores de selección en levaduras
Transformación llevada a cabo por:
1. Generación de esferoplastos, permeabilización con CaCl2, choque de temperatura
2. Tratamiento con acetato de litio y PEG, choque de temperatura
Utilidad
► Expresión de proteínas recombinantes que no se pliegan correctamente en E. coli
► Clonamiento de fragmentos muy grandes para el estudio de genomas complejos
(YACs)
► Genes de levadura → similitud con genes de animales y plantas superiores
Levadura útil como modelo para probar función de genes de
otros organismos
Manipulación de genes por recombinación homóloga
Eliminación (KO) de genes cromosómicos
“Plasmid shuffle”
Estudio de función de genesmutantes o genes foráneos
KO TPK1, TPK2, TPK3
Interacción de proteínas por ensayo de doble híbrido
Animales
Genes en:
► Fragmentos de DNA
► Vectores tipo plásmido con elementos virales
► Virus
Fragmentos y vectores que no se replican → Transitoria Permanente (integración)
Vectores que se replican y virus → Genomas extracromosómicos independientesPartículas virales
Transformación llevada a cabo por:
Microinyección
DNA precipitado con fosfato de calcio (endocitosis)
Electroporación
Liposomas
Infección viral
Utilidad
► Expresión de proteínas recombinantes
► Estudio de la expresión de genes en entorno natural (promotor + gen reportero)
► Estudio de la función de los genes en entorno natural● Expresión● Silenciamiento (antisentido)
Marcadores de selección
Ejemplo 1: Transformación con
fragmentos de DNA
Ejemplo 2: Transformación con
vectores
Localización de HBZ-GFP y HBZ-SI-GFP en células COS7
Murata et al. J. Virol. 80(5): 2495-2505 (2006)
Vector: pcDNA3/HBZ-GFP pcDNA3/HBX-SI-GFP
Ejemplo 3: Transformación combinada
fragmentos de DNA y virus
Ejemplo 4: Transformación combinada
fragmentos de DNA y virus
Ejemplo 5: Transformación con virus (retrovirus)