Post on 28-Sep-2018
“UN MODELO DE SEÑALES INTRACELULARES MEDIADAS POR
RAS”
MAURA CÁRDENAS GARCÍACentro de Química BUAP
Estructura de la presentación
Herramientascomputacionales
Transducción de señales
Oligonucleótidos queforman triple
hélice
Modelos Computacionales
propuestos
Resultados experimentales
Transducción de señales
División celular
Crecimiento
EnvejecimientoMuerte celular Diferenciación
El control central de las señales paracrinas esta dado por las
señales endocrinas u hormonalesLas células de las glándulas de secreción interna:
-Hipófisis-Tiroides-Islotes de páncreas-Suprarrenales-Ovarios-Testículos
Características de los receptores
• Reconoce a la señal química
• Activa la secuencia de eventos que conducen a la respuesta celular.
Naturaleza química de la señal extracelular
• Lípidos, por ejemplo los esteroides y las prostaglandinas.
• Péptidos, por ejemplo algunos factores de crecimiento.
• Aminas, por ejemplo trifluoroacetil azobenceno.
• Iones, por ejemplo oxido nítrico y monóxido de carbono.
Localización de los receptores
• Receptores membranales
• Receptores citoplásmicos
• Receptores nucleares
Receptores membranales
• Receptores que tienen un dominio transmembranal, por ejemplo EGFR, PDGFR, TGFβR o TNFαR.
• Receptores con dos dominios transmembranales, por ejemplo receptores para insulina.
• Receptores de siete dominios transmembranales, por ejemplo hormonas como adrenalina, vasopresina, angiotensina II, bradikinina y bombesina, neurotransmisores como noradrenalina, dopamina y serotonina.
• Receptores formados por dos o mas subunidadestransmembranales, que se expresan básicamente en células del sistema inmune, por ejemplo interferon, interleucinas o GM-CSF.
• Receptores de las moléculas de adhesión por ejemplo integrina. La integrina posteriormente se une a a-actina, talina, fimbrina, vinculina o tensina.
ααααααααγγγγγγγγββββββββ
olores
2000 receptores de siete dominios transmembranales distintos
sabores
hormonas
Factores de crecimiento
neurotransmisores
luz
Receptores citoplásmicos
• Por edición alternativa de los genes correspondientes se generan algunas formas “solubles” o no membranales de los receptores para angiotensina II, IL-1, IL2, Il4 e IL-6, TNFα, IFγ y GH.
• Receptores citoplásmicos, por ejemplo los receptores para esteroides, se dividen en receptores para:
a) Glucocorticoidesb) Mineral corticoidesc) Andrógenos y estrógenos
Receptores nucleares
• Los receptores de las hormonas tiroideas, retinoides, vitamina D y ecdisona, en ausencia de ligando, se encuentran en el núcleo en sitios específicos de DNA.
Receptor
Mecanismos o Sistemas de transducción
• Sistema de la adenilato ciclasa.
• Sistema de fosfoinositidos-calcio.
• Sistema de la proteína cinasa activada por mitógeno MAPK.
• Sistema de activación de los factores de transcripción STAT.
• Sistema de la esfingomielinasa-ceramida
• Sistema de receptores que funcionan como canales iónicos.
PP
ATP ADP + Pi
H2OPO-4
PK
P
P
P
P
P
TCFTCFSRESREPP
PPPP
TATATATA TRETRE TATATATA
cc--fosfos cc--junjun
PKCPKC
PKAPKA
MEKKMEKK
JNKKJNKK
JNKJNK
HH--RasRas
MEKMEK
RafRaf--11
ααααααααββββββββ
γγγγγγγγAC
AC
αα αααα ααββ ββββ ββ
γγ γγγγ γγPLCPLC
MAPKMAPK
PHPDK1
PKA
Ser473
PKB PH
SGK
S6KDominio
autoinhibitorio
Sitio de reclutamiento ERK
PKCαααα
RSK
Dominio C
Thr308
Src (Yes, Lyn, Blk)Dominio de
cinasa
SH3 SH2 LckSH4
Dominio de
cinasa
SH3 SH2 FynSH4
Interdominio BSH2Syk SH2
Dominio homologo a JAK
JAK1, JAK2,
TYK2, JAK3 Pseudodominio
de cinasa
Dominio de union a integrinas
Dominio de union a paxilina
Fak
Region de union a CD4/CD8
Region de union a CD εεεε,γγγγ,δδδδ/TCRζζζζ
Estabilidad química de los aminoácidos fosforilados
(+) aminoácidos más estables; (-) aminoácidos menos estables
Naturaleza de los aminoácidos
O-Fosfatos + -
Fosfoserina + -
Fosfotreonina + +
Fosfotirosina + +
N-Fosfatos
Fosfoarginina - -
Fosfohistidina - +
Fosfolisina - +
Acil-Fosfatos
Fosfoaspartato - -
Ácido Básico
Estabilidad en:
H--- C — CH2--OH
C —OO -
NH3+
H--- C------------ C-----CH3
C —OO - H
NH3+ OH
H--- C — CH2---
C —OO -
NH3+
---OH
Ser
Tyr
Thr
H--- C — CH2—PO2-
C —OO -
NH3+
3
Fosfoserina
H--- C — CH2---
C —OO -
NH3+
His
N
NH
1 2
34
5
H--- C — CH2---C
C —OO -
NH3+
AspO
O -
H2N—P---O-
O
O -
Fosforamidato
ββββARK
GE
PP
PKA
ββββARK
pH
GRK
PP
Alta afinidadBaja afinidad
Desensibilización
Fosforilación
Resensibilización
Desfosforilación
Internalización
AMPc
Dinamina
AAA
A
A
A
Señales extracelulares
Cinasas y Fosfatasas de proteínas
Fosforilación y defosforilación
Actividad de factores de transcripción
Unión a DNA
Localización celular
Oligomerización Unión a correguladores
Estabilidad proteíca
Estructura de la cromatina
A.
CaM
PP1
PP2B
PP2A
Pro R
39%
49%
Subunidad catalítica (C) Subunidades reguladoras (R)
Inhibidor-1, DARP-32,
inhibidor-2, subunidad de
unión al retículo
sarcoplásmico y glucógeno,
subunidad miofibrilar.
B 19 kDa isoformas αααα y ββββ
-----------------------------------------------------
RC
A
C
B’’
B’
B
B’’’
PR65 αααα, ββββ, γγγγ o δδδδ
PR61 αααα, ββββ, γγγγ, δ δ δ δ o ττττ
PR72, PR130,
PR59 o PR48
PR93/SG2NA
PR110/estrintina
PR65
α α α α o ββββ
PP2Ac
α α α α o ββββ
A
C
B’’
B’
B
B’’’estriatina
SG2NA
Caspasa-3
PTPA
nucleorodoxina
Proteína t intermedia y pequeña del polioma
HSF2
JAK2
CKIIααααCAMK4
FAK1 y 2
Bcl-2
p70s6K
I1PP2A
I2PP2A
Tap42αααα
vimetina
Receptor de TGFββββ
HIV1
adenovirusa
APC Ciclina G
PKR
SRC (Hox)
E4
Paxilina
Cdc6
CG-NAP
P107/Rb
Proteína t pequña SV40
Señales Intracelulares mediadas por Ras
0 7
1
5
6
43
3
4
19
34
89
77 76
83
85
75
39
60
50 41
110103
104
111
117118
61
51
48
47 10
12
14
80
35
18
25
23
24
74
31
46
78
40
72
73
42
52
56
59
95
22
57
62
66
70
93
113
120
94
37
122
112
27
15
30
90
79
97
99
114
119
84
1681
2021
28
26 13
63
36
86
115
96
52
8887
6564
55
98
92 101
106 100 108
107
105
109
69 67 68
49
96
54 58
53
8
2
38
9
110
45
44
17
82
121
33
32
91
116
71
29
102
G16-12 h
S6-8 h
G23-4 h
M 1h
Factores de crecimiento
p15p15
p53
p21p27 TGF 3Rb
E2F
E2FP Rb
ERK
TGF 3
CDK 4, 5
Ciclina D
PCNA
p107&E2F
Ciclina E
CDK2
PCiclina BCdc2MAPK
MPM2K
p107&E2F
Ciclina E
CDK2
Ciclina BCdc2
Ciclina BCdc2
Ciclina HCDK7
Cdc25A
Mik1
Wee1
PP1
Cdc25A
P Ciclina BCdc2
P P
P14-3-3 σ
Cdc2
Ras
Raf
Myc
ARF
MDM2 ARF
CDC25
P P P
PP2A
EGFR
Raf PI3KRal-GDS
14-3-3σσσσ
AKT/PKB
AP1
AC
ARFATM
ATR
BAD
BaxcAMP
Cdc2 CDC25C
cFos
cJun
cMyc
Chk1
R7DTM
PGi PGq
PKC
PLCββββ
DG
Shc
Grb2
Ras
MKK1
ERK PDK
PKA
R7DTM
E2FElk1
GADD45
JNK
MDM2
p21
p300p53
PAK
PML
Rac
Sos
PtdIns(3,4,5)P3MEK JNKKRalRho
PLD1RalBp1
PC PA Cdc42/Rac
G2DDC
DNAPK
Vías de señalización a modelar
• Raf1
• PI3K
• RalGDS
• Ciclo celular
Oligonucleótidos que forman una triple hélice
Oligonucleotidos terapeúticos
• Oligonucleótidos que forman triple hélice
DNA y/o RNA
• Ribozimas RNA
• Antisentido
DNA o RNA
Herramientas Computacionales
Modelos computacionales de sistemas biológicos
Brigthman y Fell, 2000; Bhalla y Iyengar 1999
Activación por EGF y NGF, y su relación con MAPK cinasas. Ca2+, PKC, PKA, CaM y sistema CaMKI
Paralelo distribuido, emergente El comportamiento de las proteínas depende de sus variables fisicoquímicas como la concentración y la afinidad. Los cambios de estas variables se representan con respecto al tiempo continuo, mediante ecuaciones diferenciales.
Modelos continuos
Paton et al., 1995;
Fisher, et al., 2000
González-Pérez et al, 2003.
Señalización intracelular Paralelo distribuido, emergente La célula se considera como una colección de agentes que trabajan en paralelo y se comunican entre ellos a través de mensajes
Sistemas distribuidos (agentes)
Bray, 1990;
Bray y Lay, 1994;
Bray, 1995;
Pritchard y Dufton, 2000;
Paton, 1993
Redes proteicas, señalización intracelular
Paralelo distribuido, emergente Las redes proteicas de señalización se ven como neuronas artificiales. Como una neurona artificial, una proteína recibe un valor de entrada, produce una salida, y un valor de activación
Redes neuronales artificiales
Holcombe, 1994
Doi et al, 2004
Vías metabólicas Secuencial concurrente La célula se considera como gráfico conectado con dos tipos de nodos. Un tipo representa elementos o moléculas de señalización y el otro representa transiciones como la activación
Redes de Petri
Marijuan, 1994;
Levy, 1992; Wurthner et al., 2000
Redes proteicas, señalización intracelular
Paralelo La interacción entre las proteínas se modela como matriz, donde el estado de un elemento de la matriz depende de los estados de los elementos vecinos
Autómatas celulares
Lagunez-Otero, 1998;
Takai- Igarashi y Kaminuma, 1998
Señalización intracelular Paralelo secuencial Las interacciones entre los componentes de las redes de señalización se modelan usando reglas de producción
Sistemas expertos
Kauffman, 1991;
Edwards, 1995;
Karp y Paley, 1994;
Armas et al 2000
Redes genéticas, interacción entre genes
Paralelo Se consideran dos estados para cada gen, y la interacción entre ellos. El estado de cada gen depende de una función booleana particular
Redes booleanas
ReferenciasSistema biológico modeladoForma de procesar la información
Idea relacionada con la aproximación
Aproximación computacional
Kauffman. Redes Booleanas. Redes Genéticas
Takai-Igarashi y Kaminuma. Paraelo secuencial
Marijuan. Autómatas celulares.
Doi. Redes de Petri. Vías metabólicas.
Bray. Redes Neuronales.
Dufton. Redes Neuronales.
Paton y Fisher. Sistemas distribuidos. (Agentes).
Brigthman. Modelos Continuos.
Bhalla. Modelos Continuos.
Herramienta seleccionada
Sistema experto
Sistemas dinámicos
Son aquellos en los cuales el estado del sistema se determina por su estado inicial e influencias externas que lo modifican. El espacio de tiempo en que ocurra esto puede ser continuo, o una secuencia discreta de momentos
Estado 1 Estado 2 Estado Final
∆∆∆∆t1 ∆∆∆∆t2
. . .
Características de los sistemas expertos
• Búsqueda heurística
• Lógica y razonamiento
• Lenguajes y herramientas de programación específicos
• Representación del conocimiento
Nivel 1
Nivel 2
Nivel 3
Nivel 4
Estructura de los sistemas expertos
Módulo deExplicaciones
Interfaz de entrada/ salida
Mecanismo de
inferencia
Base de conocimientos
Memoria de trabajo
Modulo de aprendizaje
Entrada
Salida
Primer Modelo
E N I F F F F F F F F F F F F F F F F
0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
3 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
37 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1
27 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0
26 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1
28 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0
9 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
29 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
5 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
7 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
13 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
8 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
10 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
12 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
34 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Element Final States
25 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
24 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
22 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
40 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
15 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
16 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0
6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
39 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
14 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1
19 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1
30 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
35 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
21 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
36 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
38 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
18 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
20 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
23 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
26 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Sistema experto
Proteína
Factor de transcripción
bZipAP1
Resultados experimentales
Triplex
Desnaturalización térmica
Dicroismo circular
Movilidad en gel
AB
C D
Internalización del oligonucleótido
Curva de crecimientolínea celular de cáncer de mama MCF7
µµµµM Adriamicina
s/n
0.5
1
5
10
15DE
NS
IDA
D Ó
PT
ICA
TIEMPO (h)
A B
µµµµg oligo/ml MCs/n
c/a s/o0.0250.05
124
DE
NS
IDA
D Ó
PT
ICA
TIEMPO (h)
B
Índice mitótico relativo
C
G1:69S:9
G2/M:22
M1M2
M3
G1:73S:10
G2/M:17
M1M2
M3
A
8hC/A
8hC/AO
12hC/A
12hC/AO
16hC/A
16hC/AO
8hC/A
8hC/AO
12hC/A
12hC/AO
16hC/A
16hC/AO
Hibridación tipo Westernempleando anti 14-3-3σσσσ
C/A Con adriamicinaC/AO Con adriamicina y oligonucleótido
Genoma FuncionalProcarionte
Cuando se tiene la secuenciacompleta de un genoma, que nos
dice?
Genomica Procarionte: desde 1996 a la fecha
Haemophilus influenzaefue la primerasecuencia bacterianapublicada(1.83Mb),1995.
Bacteria 182 (506)
Archeae20 (27)
Industry ???
Hemophilus
influenzae
Methanococcus
jannaschii
(Archaea)
Leptospira interrogans
(Bacteria)
Lactococcus
lactis (Bacteria)
1. Se tiene la secuencia.
2. Interpretación: de la secuancia de nucleotidos a los genes potenciales y la predicción de la función
3. Comparación de genomas.
4. Vías metabólicas.
Como se obtiene una secuencia?
• Se sub-clona el DNA genómico en plásmidos.
• Las clonas deben ser de 6 a 8 veces el tamaño del genoma, para asegurarse que estetodo.
• Se obtiene la secuencia de cada fragmento.
• Se eliminan repeticiones y se obtiene la secuancia completa.
Procesamiento de datos
Reuniendo todo
Existen diferentes programas que nos permiten leer una secuencia “GCG” de la Universidad de Wisconsin. El Staden originalmente diseñado porRodger Staden y modificado por otros en el Centro Sanger para la investigación genómica. Este últimoes gratis para las institutciones academicas.
Secuencia
*Continuidad
*Discontinuidad
*Uso de PCR
Software que nos permite identificar genes bacterianos
Glimmer: es un sistema que nos permite identificar genes de bacterias, archaea, y virus. Glimmer (Gene Locator and Interpolated Markov Modeler) usa modelos de Markov interpolados (IMMs) para identificar posibles genes (The institute for genomic research, TIGR).
GeneMark: es un programa que tambien utiliza modelos de Markov paraidentificar regiones codificantes y no codificantes (European Bioinformatics group EMBL-EBI).
EasyGene – Permite identificarposibles genes mediante estadisticasignificativa. Creado por Thomas Schou Larsen y Anders Krogh. BMC Bioinformatics 2003, 4:21 (Center for biological sequence analysis).
Predicción de la función genética
De la secuencia de DNA a la secuencia de aminoacidos y a la secuancia proteíca:
Traducción de la secuancia de DNA a la de aminoacidos considerando el uso preferencial de codones. Comparar la proteina obtenida con lasreportadas o almacendas empleando BLAST Basic local alignment tool. National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20894.
Interpretación de resultados: claros, probables, indicativos y desconosidos.
Realidad: La función de aproximadamente el 40% de las proteinas bacterianas no se conose.
CluSTr (Clusters of SWISS-PROT y TrEMBL)
http://www.ebi.ac.uk/clustr/
Pfam
Pfam es una gran colección de alineamientos múltiplesmodelos de Markov organizan el familias y dominiosproteícos. Nos permite
*Visualizar alineamientos múltiples.*Ver arquitecturas proteícas.*Examinar distribuciones entre especies. *Interactuar con otras bases de datos. *Ver estructuras de proteinas conocidas.
PRINTS
PRINTS es compendio de huellas de proteínas. Una huella es un grupo de motivos o secuencias conservadasusadas para caracterizar a una familia de proteínas.
ProDom
ProDom es un compendio de familias de dominiosprotéicos generados automaticamente de las bases de secuencias SWISS-PROT y TrEMBL .
Rfam
Rfam es una colección de alineamientosmultiples de secuencias y modelos de covariancia, de familias de RNA no codificante.
Veer y bajar alineamientos multiples de secuencias.
Determinar familias. Examinar distribución de especies en miembros de la familia.
InterProDataflow scheme
ABC transporters en Escherichia coli K-12 M1655
ABC transporters en Pseudomonas aeruginosa
Two-component system - Escherichia coli K-12 MG1655
Two-component system - Bacillus subtilis