Post on 11-Oct-2018
Universidad Nacional Autónoma de MéxicoFacultad de Odontología
Laboratorio de Genética Molecular
CURSO DEMICROBIOLOGÍA BÁSICA
Dra. Laurie Ann Ximénez-FyvieMtra. Adriana Patricia Rodríguez Hernández
Diapositivas 4
Técnicas microscópicas•Campo claro•Campo obscuro•Contraste de fases•I.D. de Nomarski•Fluorescencia•Confocal•Electrónica de barrido•Estereoscópica (magnificación)
Métodos para el cultivo bacteriano•Medios de cultivo•Técnicas de sembrado•Aislamiento de cepas
Pruebas de susceptibilidad•Conc. mínimas inhibitorias (MIC)•Conc. mínimas bactericidas (MBC)•Antibiogramas (Kirby-Bauer)
Métodos para el estudio de microorganismos
Identificación fenotípica•Tinción de Gram•Morfología celular•Motilidad•Tolerancia al oxígeno•Morfología de colonia•Tipificación bioquímica•Perfiles de proteínas celulares
Identificación genética•Hibridaciones DNA-DNA•PCR•Secuenciación 16S rRNA
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Métodos para el estudio de microorganismos
Identificación fenotípica•Tinción de Gram•Morfología celular•Motilidad•Tolerancia al oxígeno•Morfología de colonia•Tipificación bioquímica•Perfiles de proteínas celulares
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Identificación fenotípica
Definición
Secuencia consecutiva de métodos de “microbiología tradicional” que en conjunto llevan a la identificación de especies bacterianas en cultivo; mediante la determinación y posterior seguimiento de sus características fenotípicas y metabólicas a través de diagramas de flujo de identificación aceptados.
Aplicación• Identificación y cuantificación de especie cultivable previamente caracterizadas o
de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros.
Ventajas• Permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana posteriores o
en paralelo a la identificación.• Es posible realizar la cuantificación de las especies evaluadas.
Desventajas
En comparación a la identificación genética:• Más laborioso.• Mayor tiempo y costo.• Difícil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de
especies fastidiosas.• Subestimación de especies fastidiosas.• No permite la identificación de especies no-cultivables.
Identificación fenotípica- Diagrama de flujo
Tinción de Gram
Morfología celular
Motilidad
Tolerancia al O2
Morfología de colonia
Tipificación bioquímica
Perfiles de proteínas celulares
Gram positivo
Gram negativo
Identificación fenotípica- Tinción de Gram
Identificación fenotípica- Morfología celular
Coco
Bacilo
PleomórficoEspirilo
•Sin motilidad•De nado (Swimming)•De deslizamiento (Glidding)•En espasmos (Twitching)
En Agar
Tubo de Punción
Identificación fenotípica- Motilidad
Contraste de Fases Campo Obscuro
•Anaerobio estricto(en ausencia de O2)
•Microaerofílico(en conc. bajas de O2)
•Capnofílico(en presencia de CO2)
•Anaerobio facultativo(en presencia/ausencia de O2)
•Aerobio estricto(en presencia de O2)
Identificación fenotípica- Tolerancia al oxígeno
•Color•Tamaño•Forma•Textura•Consistencia
•Periferia•Adherencia al agar•Formación de fosas•Propiedades hemolíticas•Fluorescencia con luz UV
Identificación fenotípica- Morfología de colonia
Identificación fenotípica- Tipificación bioquímica
•Fermentación de carbohidratos•Productos terminales•Catalasa•Oxidasa•Coagulasa•Reacciones de aglutinación
SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis)
Identificación fenotípica- Perfiles de proteínas celulares
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Métodos para el estudio de microorganismos
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Identificación genética•Hibridaciones DNA-DNA•PCR•Secuenciación 16S rRNA
Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA
DefiniciónMétodo no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la detección de fragmentos cortos de DNA marcados (sondas) tras su enlace a moléculas de DNA complementarias en una muestra (templete).
Aplicación • Identificación y cuantificación de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros.
Ventajas
En comparación al resto de las pruebas de identificación:• Capacidad para evaluar mayor número de especies y muestras.
En comparación a la identificación fenotípica:• Menor tiempo y costo.• Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de
especies fastidiosas.• Permite la identificación de especies no-cultivables.
En comparación a otras pruebas genéticas:• Es posible cuantificación las especies evaluadas.
Desventajas
En comparación a la identificación fenotípica:• No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo
a la identificación.En comparación a otras pruebas genéticas:
• Menor sensibilidad y especificidad.
•Sonda: fragmento de DNA marcado con una molécula reportadoraque permite su detección después de la hibridación
•Molécula ReportadoraRadioactiva: Isótopos con emisiones β (generalmente P32)No-Radioactiva: Digoxigenina, Fluorescina, Biotina, etc.
•Especificidad: determinada por el diseño de la sonda•Sensibilidad: determinada por el tipo y concentración de la sonda
Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA
•Southern BlotBlanco = DNASonda = DNA
•Northern BlotBlanco = RNASonda = DNA
•Western BlotBlanco = ProteínaSonda = Anticuerpo
“MiniSlot”
Canales abiertos
Membranade nylon
Filtros
Socransky et al. Biotechniques 1994
Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA
“MiniBlotter”
Canales de hibridación
Membranade nylon
Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA
Socransky et al. Biotechniques 1994
Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA
* Serotipos a: 43717 & b: 43718† Subespecies nucleatum: 25586, polymorphum: 10953 & vincentii: 49256
Métodos genéticos- PCR
DefiniciónMétodo no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la amplificación de porciones específicas de DNA en una muestra (templete).
Aplicación • Identificación de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros.
Ventajas
En comparación al resto de las pruebas de identificación:• Mayor sensibilidad.
En comparación a la identificación fenotípica:• Menor tiempo y costo.• Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de
especies fastidiosas.• Permite la identificación de especies no-cultivables.
Desventajas
En comparación a la identificación fenotípica:• No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo
a la identificación.En comparación a la identificación fenotípica e hibridaciones DNA-DNA:
• No permite la cuantificación de especies (excepto PCR en tiempo real).En comparación a hibridaciones DNA-DNA:
• Bajo número de especies evaluadas.
PCR
Métodos genéticos- PCR
•Ciclos repetitivos de desnaturalización, alineamiento de primers yextensión para producir múltiples copias de una secuenciadeterminada de DNA
•Especificidad: determinada por el diseño de los primers•Sensibilidad: hipotéticamente 1 célula
Métodos genéticos- Secuenciación de la fracción 16S rRNA
DefiniciónMétodo no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la determinación de la secuencia en el DNA de la fracción 16S rRNA en una muestra (templete) y su posterior comparación con secuencias publicadas.
Aplicación • Identificación de cualquier microorganismo a partir de muestras clínicas o cultivos puros.
Ventajas
En comparación al resto de las pruebas de identificación:• Mayor especificidad.
En comparación a la identificación fenotípica:• Menor tiempo y costo.• Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de
especies fastidiosas.• Permite la identificación de especies no-cultivables.
Desventajas
En comparación a la identificación fenotípica:• No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo
a la identificación.En comparación a la identificación fenotípica e hibridaciones DNA-DNA:
• No permite la cuantificación de especies.En comparación a hibridaciones DNA-DNA:
• Bajo número de especies evaluadas.
Secuenciación 16S rRNA
Métodos genéticos- Secuenciación de la fracción 16S rRNA
•Comparación con bancos de secuencias conocidas
•Especificidad: hipotéticamente “absoluta”•Sensibilidad: hipotéticamente 1 célula