v = c/ E = hv

Ene

rgía

S0

S1

S2

Ab

sorc

ión

(1

0-15 s

)

Flu

ore

sce

ncia

(1

0-9 s

-10-8

s)

Nr

Conversión interna

(10-12 s)

Corrimiento de Stokes : emisión > absorción

Diagrama de Jablonski

Ene

rgía

S0

S1

S2 Relajación del

solvente

(10-10 s)A

bso

rció

n

(10-1

5 s

)

Conversión interna

(10-12 s)

Corrimiento de Stokes : emisión > absorción

Diagrama de Jablonski

G

Absorción

Fluorescencia

relajación térmicarelajación térmica

Propiedades fundamentales de la fluorescencia (a) Principio de Frack-Condon: las transiciones son verticales (los núcleos no cambian de posición en 10-15 s). (c) La excitación es desde el nivel vibracional más bajo del estado basal hacia cualquier nivel vibracional del estado excitado. La emisión es desde el menor nivel vibracional del estado excitado hasta cualquier nivel vibracional del estado basal. La excitación revela los estados vibracionales del estado excitado; la emisión los del estado basal. (b) Si una transición es la más probable para la excitación, la recíproca lo será para la emisión. Ej.: 0–2 (excitación), 0–2 (emisión). El espectro de emisión es una imagen especular del de eexcitación. (d) El espectro de emisión está corrido a menores energías respecto al de excitación (corrimiento de Stokes).

Tiempos típicos de las interacciones entre la materia y la luz visible-UV Absorción de fotones, 10-15 s Vibración interatómica, 10-12 s Conversión interna, relajación del solvente, 10-12–10-10 s Emisión de fluorescencia 10-10–10-9 s Fosforescencia 10-3 s

Quantum yield

Tiempo de vida

Quenching the fluorescencia

Puede ser estático o dinámico

Resonance Energy Transfer

FLUORÓFOROS INTRÍNSECOS

Trp puede ser excitado selectivamente a 295 nm. (para evitar la excitación de la Tyr).

Triptofano es el fluoróforo intrínseco dominante.

Trp es muy sensible al entorno. Es posible ver cambios en los espectros de emisión en respuesta a cambios conformacionales, asociación de subunidades, unión de sustratos, desnaturalización y cualquier cosa que afecte el entorno local del anillo indol.

Trp es muy sensible a la atenuación colisional, tanto por grupos externos como por grupos vecinos, en la proteína.

Azurina 4AZU max= 308nm

Proteína G max= 342.5 nm

Glucagon 1GCN max 350.8 nm

Trp 48

Trp 48

Trp 25

25

75

125

175

225

275

325

375

0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0

[parinaric acid]/[YLSCP2]

Flu

resc

ence

(ar

bitr

ary

units

)

25

50

75

100

125

150

175

200

225

0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0

[parinaric acid]/[IFABP]

Flu

resc

ence

(ar

bitr

ary

units

)

A

B

S1

(no polar)

*

fluorescencia (no polar)

absorción

_

+

et

Transferencia electrónica

S1 ct

S0 np

(estable en ambiente polar)

fluorescencia (ambiente

polar)

Fluoróforos extrínsecos

Variación en el rendimiento cuántico del ANS

Esquema de la estructura de la ‑lactamasa. Se muestran las hélices C y N terminales.

N-terminal

C-terminal

U ESβL9 (5 M GdmCl) IP ESβL9 N ESβL9 (0.05 M GdmCl)

Longitud de onda

Flu

ore

sce

nci

a