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Pilar Blasco AlemanyPablo Candela Antón

Curso teórico práctico de Espectrometría de MasasDiciembre 2012

1) Qué y porqué es importante la EM.

2) Resumir muy brevemente las partes del espectrómetro de masas.

3) Cual es el resultado que se obtiene al analizar un compuesto medianteesta técnica.

4) Sus aplicaciones y los equipos de que disponemos en estos SSTTI) p y q p q p

5) Un pequeño recordatorio de conceptos fundamentales para poderentender la EM.

6) Interpretación e identificación de espectros de masas.

7) Como el corazón un espectrómetro de masas es el analizador contarésus características.

8) Para terminar hablaré de los sistemas de vacío y de las fuentes deionización.

8) Mañana Pablo continuará hablando del resto de componentes delespectrómetro como son los analizadores y detectores.

9) En la tercera sesión yo os hablaré una de las técnicas habituales deintroducción de muestras como es el cromatógrafo de gases y sistemasde concentración de muestras así como de la preparación de las mismas.

10) Por último Pablo os contará el acople del HPLC a los sistemas demasas.

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La espectrometría de masas (EM) es una técnica de análisisinstrumental basada en la separación de acuerdo a las razonesinstrumental basada en la separación, de acuerdo a las razonesmasa/carga, de las especies cargadas formadas a partir de laionización de una muestra. Se trata de una técnica extremadamentesensible, de gran versatilidad que nos suministra información muyvaliosa sobre los compuestos químicos.

Permite identificar un compuesto por lo que podríamos llamar su“huella dactilar química”.

Debido a la elevada sensibilidad, la EM es la técnica preferida para ladeterminación de trazas en química ambiental y en los controlesantidopaje.

Identificación inequívoca: de casi cualquier tipo de sustancia, desde átomoshasta moléculas de peso molecular elevado.(“Huella dactilar química delcompuesto).

Análisis cualitativo: Peso molecular preciso, masas de partes integrantes de lamolécula detección de impurezasmolécula, detección de impurezas.

Identificación: de una sustancia en presencia de otras similares.

Análisis cuantitativo: Alta sensibilidad.

Muestra promedio deseable: <1mg.

Información: isotópica y estructural.

Técnica universal: específica y rápida.

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Un espectro de masas puede ser representado por un gráfico en el cual eleje (x) corresponde a la razón m/z de cada ión y el eje (y) a la abundancia ointensidad relativa correspondiente a cada valor de m/z.Para obtener un espectro de masas es necesario:- Introducir la muestra en forma y cantidad apropiada [Sistema deintroducción de la muestra]- Producir iones [Fuente de ionización]- Separar los iones de acuerdo con su razón m/z [Analizador]- Registrar (detectar) el resultado de la separación de los iones [Detector ]- Representar los resultados.

• Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (PAH’s).• Pesticidas Organoclorados• Congéneres de Bifenilos Policlorados (PCB’s).• Hidrocarburos.• Cloronaftalenos.• Esteres Metílicos de Ácidos Grasos

Siloxanos• Siloxanos• Compuestos fluorados• Mezclas de Disolventes• Trihalometanos en aguas• Compuestos Orgánicos volátiles• Detectar e identificar el uso de fármacos de abuso en atletas (antidoping o control de dopaje).• Determinación de proteínas

Todas estás aplicaciones se pueden analizar en tipos tan variados de muestras como alimentos, fármacos, ambientales, lodos, suelos, residuos, biológicas, geológicas……

2 Espectrómetros de masas de alta resolución 6 Espectrómetros de masas de baja resolución

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Átomo: Cantidad menor de un elemento químico que tiene existenciapropia y que está considerado como indivisible. Está formado por unnúcleo con protones y neutrones y por varios electrones orbitales, cuyonúmero varia según el elemento químico.La diferencia entre los distintos elementos químicos está dada por lacantidad de protones y neutrones de sus átomos.La cantidad de protones que contiene un núcleo es lo que se denominanúmero atómico.

NAZ X NZ

Donde:X es el símbolo químico del elemento.Z es el número atómico, indica el número de protones.N es el número de neutrones.A es el número másico, indica el número de protones +neutrones

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En química, se define al ión como un átomo o molécula que perdiósu neutralidad eléctrica por que ha ganado o perdido electrones desu dotación originalmente neutra fenómeno que se conoce como

La energía de ionización, también llamada potencial de ionización, es laenergía que hay que suministrar a un átomo neutro, gaseoso y enestado fundamental, para arrancarle el electrón más débil retenido.

su dotación, originalmente neutra, fenómeno que se conoce comoionización.

Los iones cargados negativamente, producidos por la ganancia deelectrones, se conocen como aniones y los cargadospositivamente, consecuencia de una pérdida de electrones, seconocen como cationes.

Se denominan isótopos alos diferentes tipos deátomos de un mismoelemento cuyos núcleosdifieren en su número deneutrones. Así, los átomosque son isótopos entre síse encuentran en el mismositio de la tabla periódicapues tienen igual númeroatómico Z (número deprotones en el núcleo) perodiferente número másico A(suma del número deneutrones y el de protonesen el núcleo). La mayoríade los elementos químicosposeen más de un isótopo

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Los pesos atómicos y moleculares utilizados en la bibliografía deespectrometría de masas difieren de los utilizados en la mayoría de losespectrometría de masas difieren de los utilizados en la mayoría de losotros métodos analíticos ya que los espectrómetros de masas discriminanentre la masa de los isótopos mientras que otros instrumentos analíticosgeneralmente no lo hacen.

Los pesos atómicos y moleculares se expresan generalmente en términosde unidades de masa atómica (uma o dalton para los espectroscopistas).Esta unidad atómica de masa se basa en una escala relativa en la que lareferencia es el isótopo de 12C, al cual se le asigna una masa deexactamente 12 uma. Así, el uma o dalton se define como 1/12 de la masade un átomo neutro de 12C.

El carbono natural es una mezcla de tres isótopos, 98,892% de 12C y 1,108% de 13C y una cantidad despreciable de 14C.

Por lo tanto la masa atómica promedio del carbono será:Por lo tanto, la masa atómica promedio del carbono será:

(0,98892) x (12 uma) + (0,01108) x (13,00335 uma) = 12,011 uma

La masa atómica promedio de cada elemento se le conoce como peso atómico. Estos son los valores que se dan en las tablas periódicas.

Masa monoisotópica (exacta): Es la masa del ión o de lamolécula calculada mediante la suma de las masas atómicas delos isótopos más ligeros (que es el más abundante).4 x 12 + 8 x 1.oo783 +2 x 15.9949 = 88.05244 Da.

Masa nominal: Es la masa de un ión o molécula calculadad l d l i ót á b d t d l l t

C4H8O2 (Ácido Butírico)

usando la masa del isótopo más abundante del elementoredondeada al valor entero más próximo.4 x 12 + 8 x 1 + 2 x 16 =88 Da.

Masa media: El valor calculado con la media de las masasexactas de los isótopos. (la que viene en los sistemasperiódicos).4 x 12.0107 + 8 x 1.00794 + 2 x 15.9994 =88.10512 Da.

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Los pesos atómicos de los elementos que vienen en la tabla periódica son la media de los isótopos.

Así el peso atómico promedio (A) de un elemento en la naturalezaviene dado por la ecuaciónviene dado por la ecuación

A = Alpl + A2p2 ... + Anpn

donde Al, A2, ..., An son las masas atómicas en daltons de los nisótopos de un elemento y pl, p2, ..., pn son las abundancias de estosisótopos en la naturaleza. Este peso atómico es el que interesa a losquímicos en la mayoría de las ocasiones.

Sin embargo los pesos atómicos utilizados en la espectrometría demasas discriminan entre la masa de los isótopos, interesa la masaexacta de los isótopos de un elemento.

En espectrometría de masas, a diferencia de lo que ocurre normalmente enquímica, se está a menudo interesado en la masa exacta m de los isótopos de unelemento o en la masa exacta de los compuestos que contienen un grupoparticular de isótopos. Así, se puede tener la necesidad de distinguir entre lasmasas de compuestos tales como

12C 1H4 m = 12.000 x 1 + 1.007825 x 4 = 16.031 dalton13C 1H 13 00335 1 1 007825 4 17 035 d lt13C 1H4 m = 13.00335 x 1 + 1.007825 x 4 = 17.035 dalton12C 1H3

2H1 m = 12.000 x 1 + 1.007825 x 3+ 2.0140 x 1= 17.037 dalton

Normalmente, en espectrometría de masas, las masas exactas se expresancon tres o cuatro decimales, ya que los espectrómetros de masas de altaresolución tienen esta precisión.

En algunos contextos, se usa el término masa nominal, que implica unaprecisión de un número entero en una medida de masa. Así, las masas nominalesde los tres isómeros antes citados son 16, 17 y 17 daltons, respectivamente.

1) Estudiar la información complementaria de que se disponga (otrastécnicas).

2) Búsqueda del ión molecular.

3) Estudio de la información isotópica.

4) Asignación de los fragmentos mayoritarios.

5) Determinación del peso molecular.

6) Cálculo de la fórmula molecular.

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Se corresponde con el peso molecular (Masa nominal) del compuesto

Es el pico mas alto, más abundante del espectro, que se normaliza al valor 100

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Calcular la distribución isotópica del CH2=CHCl. La masa nominal del C es 12 umas , la del H 1 y la del Cl 35. La abundancia relativa de los diferentes isótopos se muestra en la tabla anterior.

12C2H335Cl 62 0.989 x 0.989 x 0.7577 = 0.7411 74.11%

12C13CH335Cl 63 2 x 0.989 x 0.011 x 0.7577 = 0.0165 1.65%

12C2H337Cl 64 0.989 x 0.989 x 0.2423 = 0.2370 23.70%

13C2H335Cl 64 0.011 x 0.011 x 0.7577 = 0.000091 0.009%

13C12CH337Cl 65 2 x 0.989 x 0.011 x 0.2423 =0.0053 0.53%

13CH337Cl 66 0.011 x 0.011 x 0.2423 = 0.00003 0.003%

Normalizando al 100% :

M+, M+1, M+2, M+3, M+4 = 100%, 2.23%, 31.98%, 0.72%, 0.004%

M+, M+1, M+2, M+3, M+4 = 100%, 2.23%, 31.98%, 0.72%, 0.004%

Que representado gráficamente quedaría

70

80

90

100

abu

CH2=CHCl

¿Podríais calcular la relación isotópica para el Cl3CH?

0

10

20

30

40

50

60

70

62 63 64 65 66

undancia

m/z

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M+ 35Cl3CH 118 (0.7577)3 = 0.435 43.5%M++2 37Cl35Cl2 CH 120 0.2423x(0.7577)2x3 = 0.471 47.1%M++4 37Cl235ClCH 122 (0.2423)2x0.7577x3 = 0.133 13.3%M++6 37Cl3CH 124 (0.2423)3 = 0.014 1.4%

Que normalizando a 100

M+, M++2, M++4, M++6 = 100%, 100%, 30%, 1.4%

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

118 120

122

124

abundancia

m/z

La presencia de los grandes picos 96 y 98 arroja dudas sobre el ión m/e100 como ión molecular. Los iones de masa menor dan pistas útilespara este problema. Nótese la relación m/e 63/61, característica delcloro. La formación m/e 61 a partir de m/e 96 supone la pérdida de 35umas, lo que nos hace sospechar la presencia de un segundo átomo decloro. El M+ (96)-Cl2 (70) = 26 lo más lógico es que sea debido a C2H2.Por tanto se trata del C2H2Cl2.

Poder de resolución

Exactitud de masa

Parámetros fundamentales

Rango de masa

Velocidad

Transmisión

Sensibilidad y límite de detección

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La capacidad de un espectrómetro de masas de distinguir entre masas.

R = m/∆m

O en términos de parte por millón (ppm):

ppm= 106 x m / ∆m = 106 x R

donde ∆m es la diferencia entre las masas de dos picosadyacentes que están resueltos y m es la masa nominal, masasin decimales, del primer pico Dos picos se consideran queestán separados si la altura del valle entre ellos no es más queun porcentaje de su altura (a menudo un 10%).

Los analizadores se clasifican en función de su poder de resolución en:

Rm < 5000 Baja Resolución

Rm > 5000 Alta Resolución

¿Qué resolución se necesita para separar dos compuestostales como el Ar y el C3H4 que tienen 40 de masa nominaly 39.96239 y 40.06386 de masa exacta respectivamente?

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El poder de resolución es la característica de mayor trascendencia analítica de un analizador

La exactitud de la masa mide la proximidad del valor registrado de m/z a su verdadero valor.

∆mexact = mverdadera – mmedida (miliunidades de masa, mmu)

ppmexact = (∆mexact/mmedida).106 (partes por millón, ppm)

Es el intervalo de m/z en que un analizador puede manipular y registrariones en fase gaseosa.

Mide el intervalo real de m/z que el analizador es capaz de resolverMide el intervalo real de m/z que el analizador es capaz de resolver.

El intervalo de peso molecular que un analizador puede registrar vendráen gran parte determinado por la técnica de ionización asociada.

En ESI debido a la formación de iones multicargados un analizador puederegistrar valores de masa de hasta 106 umas.

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El parámetro crítico en la medida de la velocidad de un analizador es lavelocidad de barrido (scan), que es lo que define el pico cromatográficoobtenido Se recomiendan al menos diez puntos para definirobtenido. Se recomiendan al menos diez puntos para definircorrectamente un pico cromatográfico, aunque no siempre es fácil deconseguir.

La razón entre el número de iones que llega al detector y elnúmero de iones producidos en la fuente de ionizaciónnúmero de iones producidos en la fuente de ionización.Depende del analizador y es determinante en la sensibilidad.

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Es una medida de la respuesta del instrumento para iones de un compuestoen particular y por tanto la magnitud de la respuesta detectada, es diferentepara cada compuesto (normalmente se utiliza estearato de metilo confuente de impacto electrónico) y se define como la razón entre la corrienteiónica y la cantidad de muestra en la fuente y expresa la capacidad delespectrómetro de masas para detectar las señales de un ión. Se mide enAmperios/torr.

Indica el valor de la corriente iónica detectada en el detector.

Siempre debe estar referida a un compuesto determinado (relación señal-ruido).

Disminuye al aumentar la resolución y la velocidad de barrido.

Está determinada por la eficiencia de la ionización, eficiencia de latransmisión y respuesta del detector.

Otra definición habla de sensibilidad como la pendiente de la curva decalibrado, esto es, señal frente a concentración. (Factor de respuesta)

Debe diferenciarse de la sensibilidad. Es la cantidad más pequeña demuestra que produce una señal distinguible del ruido de fondo(generalmente una señal con intensidad diez veces superior al nivel deruido). Se debe destacar que esta cantidad mínima no tiene quecorresponder con la cantidad de muestra necesaria para obtener unespectro de masas interpretable. Por ejemplo, el límite de detección puedeser menor de 1 pg, pero que se necesite 1 ng del compuesto para obtenerel espectro. El límite de detección depende considerablemente de laabundancia de la especie iónica.

Se deberá generar una señal todo lo intensa que sea posible, para locual se utilizan métodos tales como:

1) f ó (1) Modificar las condiciones de ionización (en dioxinas, por ejemplo,se utiliza una energía de ionización de 35 eV).

2) Emplear técnicas más suaves de ionización.

3) Obtener derivados de la muestra para incrementar el número deiones producidos en la fuente (metilar los ácidos grasos).

4) Reducir sus fragmentaciones.

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Si empleamos el método de barrido convencional (scan) el tiempodedicado a la detección de cada pico de masa (fragmento) es unapequeñísima fracción del tiempo total de barridopequeñísima fracción del tiempo total de barrido.

Para aumentar la sensibilidad lo que se puede hacer es seleccionar sólolas masas deseadas (conocidas) con lo que durante todo el tiempo debarrido se estarían enfocando sólo estas masas previamenteseleccionadas y no todos los fragmentos.

Con el fin de disponer de picos de masas conocidas se utilizansustancias de referencia, de espectro bastante complejo pero muy bienconocido, para realizar la calibración de la escala de masas delespectrómetro. Lo que se hace es ajustar las distintas lentes y rendijas de lafuente para conseguir los valores óptimos de los iones fragmento delcompuesto de referencia de los cuales se conoce su masa exacta así comolas abundancias relativas de cada uno. A este proceso se le denomina“TUNE” (sintonía).

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La perfluorotributilamina (PFTBA) es un líquido volátil con un amplio rango demasas, en las condiciones de vacío del espectrómetro. El líquido se mantieneseparado del sistema por medio de una válvula. Cuando el instrumentonecesita calibrarse la válvula se abre permitiendo la volatilización delcompuesto de calibración al interior del espectrómetro. El gas de calibración seioniza en la fuente del espectrómetro de masas por efecto del haz de ionesproveniente del filamento y pasa a través del sistema separándose susfragmentos y llegando al detectorfragmentos y llegando al detector.

A través de los fragmentos generados de un compuesto de calibración conocido,se ajusta el eje de masas para que coincida con las asignaciones de masasesperadas.

Comprueba periódicamente que la contaminación del espectrómetro o ladegradación de los componentes electrónicos no han cambiado la posición de lasmasas seleccionadas.

Asegura reproducibilidad de instrumento a instrumento y de laboratorio alaboratorio.

Comprueba que el espectrómetro produce los ratios relativos esperados entre losfragmentos iónicos de un compuesto patrón.

Sirve como herramienta de diagnóstico para indicarnos si es necesaria elmantenimiento o la limpieza del espectrómetro.

Los informes de sintonización sirven de registro de funcionamiento del equipo a lolargo del tiempo.

En los espectrómetros de masas de alta resolución, elprocedimiento es similar, pero además, en todo momento estáentrando esta referencia a la fuente, incluso a la vez que la muestra

bl liproblema a analizar.

El ordenador es capaz de separar el espectro de la muestra del dela sustancia de referencia y, mediante la comparación de los picosrespectivos, asignar masas precisas a los picos de interés

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Cuadrupolos

Cuadrupolos

Fuente de Iones Analizador de Masas Detector

*

Separación de Detección de Iones y

Introducciónde Muestra

Salida

Formación y Enfoque de Iones

Separación de Iones

2. Bomba de Alto Vacío

1. Bomba Mecánica

Detección de Iones y Amplificación de la Señal

Sistema de Vacío

Manifold de vacío

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Fuente de Iones – recibe el efluente del GC, proporciona un entornoadecuado para la formación de iones a partir de las moléculas de analito en alto vacío y los enfoca hacia el analizador de masas

Analizador de Masas o Filtro de Masas – donde los iones se separan en función de su relación masa/carga (m/z)

Detector – generalmente un Multiplicador de Electrones o Fotomultiplicador que detecta niveles de señal muy bajos y los amplifica a valores utilizables

Sistema de Vacío - mantiene el vacío para que no se produzca un arco voltaico en el interior de la fuente y proporcione una ruta libre de paso a los iones sin que colisionen para que lleguen con éxito al detector

Un vacío eficiente es vital para las prestaciones del MS

Todos los espectrómetros de masas tienen que funcionar en condiciones dealto vacío. Esto es necesario para lograr que los iones puedan llegar aldetector sin interactuar con otras moléculas gaseosas .Esas interaccionesunidas a las que pueden ocurrir con las paredes del instrumento provocan queunidas a las que pueden ocurrir con las paredes del instrumento provocan quelos iones pierdan su carga. Por otro lado, las interacciones ión-moléculapueden producir reacciones no deseadas e incrementar la complejidad de losespectros. Reducir el número de interacciones es tan importante que resultanecesario utilizar sistemas de bombas de vacío muy eficientes, que incluyenbombas mecánicas en unión de bombas turbomoleculares o de difusión.

El sistema de vacío se compone de dos sistemas de bombeo trabajandosecuencialmente:

1) Bomba Rotatoria2) Bomba de Alto Vacío

1) Bomba RotatoriaCapaz de extraer grandesvolúmenes de gasPero no puede alcanzar el vacíopnecesario para que el MS trabaje bienEn un sistema GC/MS , la Bomba Rotatoria debe ser capazde mantener un vacío de al menos 1 torr(1000 mtorr)

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2) Bombas de Alto Vacío2A) Bombas Turbomoleculares

“Super ventiladores” quecomprimen los restos de gasexistentes en el sistema hastauna presión adecuada para quelos extraiga la Bomba Mecánica

Más caras que las bombasdifusoras pero producen unvacío más limpio. Son“consumibles” debido alrozamiento.

2) Bombas de Alto Vacío

2B) Bombas de Difusión MolecularEmplean un fluido para comprimir los

gases residuales hasta una presióngases residuales hasta una presiónadecuada para su extracción por la bombamecánica

Solo requiere suficiente fluido y uncalefactor funcional. Básicamente libre demantenimiento (solo el fluido)

El Fluido de trabajo puede provocarinterferencias si el sistema no se venteadecuadamente y el fluido de trabajo essuccionado por el vacío al interior delespectrómetro.

90,000 RPM

CUCHILLAS GIRATORIAS

DEL MANIFOLD DE VACIO

MOLECULAS DE GAS

Bomba Turbomolecular Bomba Difusora

DEL MANIFOLD DE VACIO

CUCHILLAS FIJASHACIA LA

BOMBA ROTATORIA

CALENTADOR

FLUIDO DE TRABAJOVAPOR

CONDENSADOLIQUIDO

HACIA LA BOMBA ROTATORIA

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Para un funcionamiento correcto el sistema debe de mantenerse a altovacío. La fuente de iones, el filtro de masas, y el detector deben estartodos ellos a vacío. (llegando a vacíos de hasta 10-8 torr)El sistema de vacío hace posible que los iones vayan desde la fuentede iones, al detector sin colisionar con otros iones o moléculas.,Para conseguir un nivel de vacío suficiente, los espectrómetros demasas generalmente requieren dos bombas.El alto nivel de vacío se consigue por conexión en serie de una bombade bajo vacío a una de alto vacío.

Las combinaciones más frecuentes son:Bomba Difusora + Bomba RotatoriaBomba Turbomolecular + Bomba Rotatoria

Fuentes de iones: ¡¡¡lugar donde se produce la formación de iones (ionización )!!!!.

Duras: Comunican energíaselevadas a los iones formados demanera que se encuentran enestados vibracionales y rotacionalesexcitados. La relajación de estosiones produce una gran cantidad defragmentación y resultan espectrosde masas complejos.

Blandas: Producen poca excitación de iones de manera que hay poca fragmentación y los espectros son más sencillos.

Vacío Presiónatmosférica

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Recibir el efluente que viene del sistema de introducción demuestra.

Formar iones a partir de moléculas neutras por medio de unacorriente de electrones generada por un filamento incasdencente

Acelerar estos iones para extraerlos de la fuente y reenfocarlos pormedio de una serie de lentes electrónicas en la entrada delanalizador de masas

1)Los e- son emitidos por unfilamento caliente detungsteno o renio y aceleradospor un potencial de unos 70eVque se aplica entre elfilamento y el ánodo.

2) Las trayectorias de los e- ylas moléculas de muestralas moléculas de muestraestán en ángulo recto y secruzan en el centro de lafuente, donde colisionan ytiene lugar la ionización.

3) El producto primario son iones de una sola carga positiva que se formancuando los e- de elevada energía se acercan suficientemente a las moléculascomo para causarles la pérdida de e- por repulsiones electrostáticas.

M + e- M.+ + 2e- M.+ es el ión molecular de la molécula del analito

4) Los iones positivos producidos en un impacto de e- son atraídos a travésde una rendija hacia la primera placa de aceleración mediante una pequeñadiferencia de potencial (unos 5 V) que se aplica entre esta placa y losrepulsores .5) Los e- generados por el filamento deben ser acelerados por un potencialmayor de 50eV para que se forme un número significativo de iones gaseososen una proporción reproducible.6) Las moléculas adquieren estados vibracionales excitados y en la relajaciónes cuando tiene lugar la fragmentación que da lugar a un gran número deiones positivos de varias masas que son menores que las del ión molecular.

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0 10 70 100eV

Energía de los electrones

#ABC del producto (ABC)

La curva depende

+.

Ionización:

ABC+.ABC

Molécula Neutra Ión Molecular Excitado

‐ 2e ‐+ +e

m/z

C

A AC

AB

ABC+

+

++

+

AbundanciaSeñal

.

Espectro de Masas

Energía de los electrones

Fragmentación:

(pérdida de un neutro)

AB.

+ C (reordenamiento)

A+ABC +. +C

+ BC .

etc.

+.AB

+

+ B+AC.

Es la técnica de ionización más difundida. La mayor parte de los GC‐MSutilizan ionización por impacto electrónico.

Es una ionización “dura”. Bastante fragmentación.

El analito es bombardeado por un haz de electrones con energía suficiente paraionizarloionizarlo.

Si la energía de los electrones se mantiene constante los espectros obtenidos sonmuy reproducibles de equipo a equipo. Bibliotecas de espectros

Por convenio, se utiliza una energía de 70 eV para los electrones. Las bibliotecasde espectros comerciales están construidas a partir de espectros registrados porimpacto electrónico a 70 eV.

Se consigue mucha reproducibilidad.

Es el modo más común de ionización.

Se usa para la mayoría de aplicaciones de GCMS (más del 90%)Ventajas:

Excelente para la identificación de compuestos desconocidos.Proporciona información estructural a través de rutas de fargmentaciónProporciona información estructural a través de rutas de fargmentaciónpredecibles.Permite obtener espectros estándar “clásicos”, buscables en bibliotecasespectrales.

Inconvenientes:

La molécula debe ser térmicamente estable y volátil.Algunas moléculas no proporcionan información útil bajo condiciones de EI.En ocasiones las moléculas se rompen en fragmentos demasiado pequeñosdebido a la alta energía de ionización que ya no tienen utilidad analítica.

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Se produce un proceso primario en la fuente que implica laionización del gas de reacción gracias al haz de electrones.

Además de la muestra y el gas portador se introducen en la fuentegrandes cantidades de un gas de reacción – usualmente amoníaco ometano.

D bid l b d i d d ió ió lDebido a la abundancia de gas de reacción en comparación con lamuestra, la mayoría de los electrones emitidos por el filamentoalcanzan al gas de reacción formando iones reactivos.

Estos iones reaccionan entre ellos en otros procesos de ionizaciónprimarios y secundarios que establecen un equilibrio.

Los iones de gas reactivo reaccionan también de varias formas con lamuestra para formar iones de muestra que son dirigidos hacia el filtrode masas (analizador).

Ionización del fenobarbital [M/z-232] empleando CH4 como gas reactante Formación Iones Reactivos

+CH +e CH +2eCH +e CH +e +H

+Primaria

Secundaria CH +CH CH +CH CH +CH C H [29] +H

4 5+

34+

3++ 4 5

+2 2

4-

-4

+3

--+

4

[M+1]

[M+29]+

+

M + CH CH + [M-H]

M + C H [M-C H ]M + C H [M-C H ]

Transferencia de Protones+5 4

+

Adición Alquílica22 5 5

3 5 3 5

+++ +

Las moléculas neutras de muestras reaccionan con ionessecundarios del gas reactante para formar aductos

Reacciones Analito-Gas ReactivoC H +CH C H [41] + 2H

3

5+

42 5+5

32

2

m/z = M + 1m/z = M + 29m/z = M + 41

233 261

[M+29][M+41]+

273

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Forma iones a partir del “gas reactivo” por bombardeo con electrones.

Los iones del gas reactivo sufren reacciones con moléculas de la muestraproduciéndose iones de la misma.

Para asegurarse de una baja probabilidad de que las moléculas problema seionicen por IE directo la proporción relativa del gas reactivo debe ser al menos de1000:1, a presiones de alrededor de 1 torr.

La ionización química (CI) es mucho más suave que la ionización por impactoelectrónico (EI), por lo que se produce menos fragmentación, siendo por tantoel método más frecuentemente utilizado para determinar pesos moleculares decompuestos.

El gas reactivo más común es el metano, que produce iones con prácticamentecualquier molécula de muestra formándose el M+1, M+29; M+41, muy útil paraasegurar M.

Otros gases reactivos (isobutano, amoniaco) son más selectivos y producenincluso menos fragmentación.

“Ionización química negativa por captura electrónica”.Primero se forma una nube de electrones con poco exceso de energía(“electrones térmicos”).Los “electrones térmicos” son capturados por moléculas de muestra.Es necesario un gas amortiguador (que retira energía de loselectrones/iones). El metano es el más utilizado.electrones/iones). El metano es el más utilizado.Presión de la fuente ~ 0.4 Torr (mayor que en PCI).Sólamente ciertos tipos de moléculas son capaces de capturar electronestérmicos (selectividad).Extremadamente eficiente para algunas moléculas (sensibilidad).Los límites de detección son generalmente excelentes debido a la falta derespuesta de los contaminantes o de la matriz.Usado frecuentemente para análisis selectivos y de alta sensibilidad decompuestos electrofílicos.Suele proporcionar el M(‐).

Ventajas:La formación de iones por CI implica menor energía que por EI.Ionización más suave y con menor fragmentación.Información del Peso Molecular (una menor fragmentación muestra uni l l b d i )ion molecular con gran abundancia)Aumento de SensibilidadAumento de SelectividadProporciona mejor informacion sobre el peso molecular que una EI conmenor energía.

DesventajasPuede que no produzca NADA de fragmentación con lo que sólo sedispone de información sobre el peso molecular…No existen librerías espectrales comercialesNecesita hardware especial y requiere de condiciones especiales

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Al aplicar una diferencia de potencial entre un electrodo plano y otro enforma de aguja, situados a muy corta distancia uno de otro, se crea ung j , y ,campo eléctrico muy elevado (107-108 V/cm). En estas condiciones, si unamolécula se aproxima, sus orbitales electrónicos externos se deforman porefecto del elevado gradiente de potencial, produciéndose la pérdida o lacaptura de un electrón por efecto túnel.

El ión formado se encontrará, en su camino hacia el electrodo extractor, unagran cantidad de moléculas neutras, por lo que la probabilidad de queocurran interaccione ión-molécula será muy elevada.

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La muestra se introduce mediante una sonda por el métodotradicional, evaporándose por calefacción en el interior de la fuente, oen conexión con un GC. Este proceso no transmite exceso deenergía a la molécula ionizada por lo que no se produceprácticamente ninguna fragmentación, salvo que la sustancia seatermolábil y se descomponga durante la evaporación previa.

Es idéntico al de FI pero en este caso no se requiere la volatilizaciónprevia de la muestra. Ésta se deposita en forma líquida sobre el electrodoemisor, que en este caso tiene múltiples puntas, se deja evaporar eldisolvente y se introduce al EM mediante una sonda.Al aplicar el voltaje a este electrodo se produce un campo eléctrico en lafuente de ionización produciendo la ionización directa de la muestrasólida o líquida.

La extremada suavidad del sistema de FI permite analizar mezclascomplejas, obteniéndose un espectro con sólo los iones moleculares decada componente. Por ello esta técnica es muy usada en la industriapetroquímica para la determinación de distribución de pesospetroquímica para la determinación de distribución de pesosmoleculares, distribución de número de átomos, grado de saturación.

La FD se utiliza para compuestos no volátiles y térmicamenteinestables. Puede utilizarse para pesticidas y sus productos dedescomposición, azúcares y sus derivado, nucleótidos y nucleótidos,péptidos, aminoácidos, sales orgánicas e inorgánica, compuestosorganometálicos….

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La muestra en un estadocondensado, normalmente enuna matriz de glicerol, se ionizapor bombardeo con átomos deelevada energía y tanto losiones + como los – sonexpulsados de la superficie deexpulsados de la superficie dela muestra por desorción. Estetratamiento permite uncalentamiento muy rápido de lamuestra lo que reduce sufragmentación. La matriz líquidaayuda a reducir la energíareticular que debe ser vencidapara que se desorba un ión dela fase condensada.

Es la técnica adecuada para moléculas orgánicas no volátiles ytérmicamente lábiles.

Adecuada para compuestos polares e iónicos.

Cuanto más energética sea la partícula de bombardeo, la ionizaciónes más eficiente, y pueden ser estudiadas moléculas mayores.

Algunas de sus aplicaciones son: olisacáridos, lípidos, drogas,metabolitos, antibióticos…

Espectro de masas FAB de una mezcla decinco péptidos. Se detectan los ionescuasimoleculares de cada uno de dichospéptidos. La fragmentación es escasa deacuerdo al carácter blando de laionizaciónionización.

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Se deben cumplir trescondiciones básicas:a) La longitud de onda del

láser utilizado debe ser laadecuada para conseguir laexcitación electrónica de lamolécula analizada.

b) El “punto caliente” producidodebe ser de muy cortaduración para evitar ladescomposición térmica.

c) La muestra debedispersarse previamenteutilizando una matriz.

Mezclas complejas de proteínas, carbohidratos, oligosacáridos,glicolípidos, polinucleótidos.

Es una técnica altamente dependiente de la matriz empleada debido a laformación de aductos producidos por los pequeños fragmentosformación de aductos producidos por los pequeños fragmentosprocedentes de la descomposición fotoquímica de la matriz.

Dada la posibilidad de enfocar el láser en un punto muy pequeño, y lanaturaleza pulsante del proceso, la ionización tiene lugar en unascoordenadas muy precisas en el espacio y sobre todo en el tiempo. Estoconduce a pensar en el analizador TOF como el más adecuado paraanalizar los iones producidos, puesto que su funcionamiento también espulsante, y por tanto pueden sincronizarse con el láser excitador.(MALDITOF)

Los espectros de masas obtenidos por ionización MALDI son totalmentediferentes a los conseguidos por otras técnicas de ionización, y consiste en unaserie de señales discretas a lo largo de todo el dominio espectral, quecorresponden, cada una de ellas, a una molécula intacta cargada con diferentenúmero de cargas, y con un cierto número de protones añadidos.

Espectro de masas del poliestireno 7,600 obtenido por MALDI-TOF

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Antes de que el Espectrómetro de Masas (MS) pueda analizar una muestra, susmoléculas deben ionizarseLas moléculas de muestra se introducen en la FUENTE DE IONES.En la Fuente de Iones, las moléculas sufren un proceso de IONIZACIÓN yFRAGMENTACIÓN.Los IONES formados son dirigidos hacia el FILTRO DE MASAS (SEPARACIÓN)L té i d i i ió áLas técnicas de ionización más comunes son:

Ionización Electrónica (EI) – es un proceso directo donde electrones con unaenergia relativamente grande colisionan con las moléculas de muestra paraproducir (mayoritariamente) iones positivos, que nos proporcionan un abanico deinformación estructural para identificar los compuestos.

Ionización Química (CI), es un proceso de ionización “suave” que implicamucha menor energia que el de EI. Puesto que CI causa menos fargmentación,nos permite determinar el peso molecular de los compuestos de la muestra

Ionización/Desorción por campo(FI/FD) – La extremada suavidad deeste sistema de ionización permite analizar mezclas complejasobteniéndose un espectro con solamente los iones moleculares decada componente

Ionización por bombardeo con átomos rápidos(FAB) AlIonización por bombardeo con átomos rápidos(FAB) – Albombardear la supeficie de un líquido con un haz de átomos rápidos, seproduce la desorción contínua de iones característicos del líquido. Sidisolvemos una muestra en un disolvente o matriz, el bombardeoprouce iones moleculares positivos o negativos de la muestra.

Desorción láser asistida por matriz(MALDI) – El analito es primeroco-cristalizado con un gran exceso de una matriz. Cuando el haz láserpulsante incide sobre la mezcla se vaporiza la muestra. Una vez enfase gaseosa se producen iones radicales de la matriz, que actúa a suvez como fuente donadora de protones o electrones, dependiendo deltipo de ionización positiva o negativa que se haya seleccionado.

Fuentes de iones: ¡¡¡lugar donde se produce la formación de iones (ionización )!!!!.

Duras: Comunican energíaselevadas a los iones formados demanera que se encuentran enestados vibracionales y rotacionalesexcitados. La relajación de estosiones produce una gran cantidad defragmentación y resultan espectrosde masas complejos.

Blandas: Producen poca excitación de iones de manera que hay poca fragmentación y los espectros son más sencillos.

Vacío Presiónatmosférica

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API (Atmospheric Pressure Ionisation) o técnicas de ionización a presión atmosférica (Introducción + Ionización ):)

ESI: Electrospray o electronebulización.APCI: Ionización química a presión atmosférica.(Atmospheric PressureChemical Ionisation) o

Se aplica una tensión de 3-6 KV entre el capilar de entrada de lamuestra y el contralectrodo.Por efecto del intenso gradiente del campo eléctrico presente , lamuestra emerge del capilar de entrada en forma de un aerosol depequeñas gotas, que adquiere una carga eléctrica muy elevada. Alavanzar estas gotas por la cámara de desolvatación, llega un momentoen que su tamaño es tan pequeño, que las fuerzas culombianas derepulsión entre los iones con múltiple carga generados en su interior soncapaces de vencer la tensión superficial, momento en que los ionesescapan a la fase gaseosa (evaporación iónica).

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Al producir esta técnica una enorme abundancia de iones con cargamúltiple pueden determinarse masas moleculares de moléculas muygrandes. Por ejemplo una molécula de peso molecular 60000 con 30-60cargas positivas, aparecerá en el espectro de masas a 1000-2000.

Etapas del proceso de ionización:

Formación de gotas cargadas: el efluente de HPLC se nebuliza através de una aguja con un alto voltaje. Se produce una rotura dellíquido en gotas cargadas eléctricamente.

Desolvatación: un caudal de gas seco (usualmente N2) en sentidocontrario al flujo de efluente evapora el disolvente disminuye elcontrario al flujo de efluente evapora el disolvente, disminuye eldiámetro de las gotas y aumenta la densidad de carga.

Explosión Coulómbica: las gotas se rompen en gotitas cuando lasfuerzas de repulsión superan la tensión superficial del líquido.

Evaporación iónica: Cuando la fuerza del campo en la superficie de lagotita supera la energía de solvatación de los iones del analito, seemiten iones de éste prácticamente libres de disolvente.

El proceso de ionización se ha producido en la fase líquida.

Una característica muy importante de esta técnica es que, alproducir una enorme abundancia de iones con carga múltiple,pueden determinarse masas moleculares de moléculas muygrandes, como proteínas

Espectro de masas-ESI de la proteína mioglobina de corazón de caballo

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El espectro está formado casi siempre por iones cuasimoleculares (M+H)+ muy intensos i/o aductos, y prácticamentenula fragmentación. Es frecuente la formación de ionesmulticargados

El haz de gas envolvente tiene la misión de evitar la formación declusters del propio disolvente y disminuir la formación de aductos.

Espectros poco reproducibles entre instrumentos: no existenlibrerías.

La sensibilidad depende de la composición de la fase móvil, eq.acido-base, eq. Redox, interacción competitiva con otroscomponentes de la disolución.

Admite caudales de 1 a 10 µL/min. Se puede llegar a 1 mL/min.

La polaridad de los analitos va desde ligeramente polares acompuestos iónicos.

Ventajas:

Pueden estudiarse compuestos iónicos y térmicamente lábiles.

Caudales de fase móvil desde nL/min hasta 1 mL/min.

Las configuraciones más recientes admiten los aditivos de HPLCLas configuraciones más recientes admiten los aditivos de HPLC.

Intervalo de Pm analizable mayor que 150000 Da.

Forma predominantemente iones multiplemente cargados de la molécula intacta del soluto.

ESI es la interfase de elección para la cuantificación de compuestos iónicos i/o de alto peso molecular.

Inconvenientes:

No es aplicable a compuestos no polares o de baja polaridad.

El t f t d l di i i t lEl espectro es afectado por las condiciones experimentales.

No proporciona información estructural.

Se pueden producir fenómenos de supresión (no aplicable a análisis directo)

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Consiste en una sonda de entrada con un nebulizador neumático, colocada enuna cámara de nebulización calentada en la que se encuentra un electrodo enforma de aguja que produce la descarga eléctrica que se mantiene entre éste yun contraelectrodo situado al final de la cámara de nebulización.

La muestra junto con el eluyente procedente del HPLC entran en la cámara denebulización en forma de aerosol por la acción de un jet de nitrógeno de altavelocidad formándose pequeñas gotas, muchas de ellas con exceso de cargapositiva o negativa, que avanzan por la cámara calentada, desolvatándose pocoa poco y arrastradas por un flujo de gas envolvente (N2).

Al disminuir el tamaño de las gotas, aumenta el campo eléctrico en su interior,favoreciéndose la evaporación iónica por repulsión de partículas cargadas de igualsigno.

El gas envolvente dificulta el paso de las moléculas de disolvente al analizadory rompe los enlaces de asociaciones y aductos ión-disolventeLa descarga presente en la fuente produce un plasma de iones reactivos deldisolvente, lo que origina el mecanismo de ionización de la muestra porionización química, normalmente por adición o cesión de un protón.

Mecanismos de ionización

Nebulización: el efluente de HPLC es nebulizado en una cámaraa alta temperatura (400-550ºC), el calor evapora el disolvente y elanalito.

Electrodo de descarga: proporciona un haz de electrones queioniza los gases de la fuente, sobre todo el disolvente y el gas denebulización.

Ionización Química: el mecanismo de ionización más significativo enAPcI es la ionización química en fase gas del analito por el plasma deiones generado , de forma análoga a una ionización química clásica.

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El espectro está formado casi siempre por iones cuasimoleculares (M+H)+ muy intensos i/o aductos, y prácticamentenula fragmentación.

El haz de gas envolvente tiene la misión de evitar la formación declusters del propio disolvente y disminuir la formación deaductos

Espectros poco reproducibles entre instrumentos: no existenlibrerías.

aductos.

La sensibilidad depende de la composición de la fase móvil,temperatura, carga inicial del analito (neutros más volátiles),afinidad protónica del analito (por ejemplo las aminas presentanalta sensibilidad.

Admite caudales de 0.5 a 2 mL/min

La polaridad de los analitos va desde ligeramente polareshasta compuestos bastante polares

Ventajas:

Permite obtener el peso molecular. Máximo de peso molecular 1500 Da.Nula o escasa fragmentación, es una técnica blanda.

Puede estudiar analitos térmicamente no estables. No apropiada paracompuestos no volátiles.

Aplicable a compuestos de baja a moderadamente alta polaridadAplicable a compuestos de baja a moderadamente alta polaridad.

Compatible con columnas usuales utilizadas en HPLC (caudales dehasta 2 mL/min)

Tolerante al cambio de condiciones experimentales (fase móvil, gradiente elución, tampones).

Robusta, fiable y con pocas interferencias. Ampliamente utilizada en laindustria farmacéutica.

Las interfases API son actualmente las más difundidas.

Inconvenientes:

El analito puede formar aductos con la fase móvil o conmodificadores. Puede impedir la interpretación de los espectro.

No se obtiene información estructural a excepción de que se use unsistema MS-MS).

No funciona bien a bajos caudales.

No es apropiada para analitos cargados en disolución.

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