Tecnología Enzimática. INDICE 1. Introducción 2. Producción de Enzimas 3. Extracción de Enzimas...

Tecnología Tecnología EnzimáticaEnzimática

INDICEINDICE

1.1. IntroducciónIntroducción

2.2. Producción de EnzimasProducción de Enzimas

3.3. Extracción de EnzimasExtracción de Enzimas

4.4. Purificación de EnzimasPurificación de Enzimas

5.5. OptimizaciónOptimización

6.6. Aplicaciones de los EnzimasAplicaciones de los Enzimas1.1. Aplicaciones en la Industria AlimentariaAplicaciones en la Industria Alimentaria

2.2. Aplicaciones en la Industria no AlimentariaAplicaciones en la Industria no Alimentaria

7.7. Problemas de la Tecnología EnzimáticaProblemas de la Tecnología Enzimática

8.8. El Futuro de la Tecnología EnzimáticaEl Futuro de la Tecnología Enzimática

1.- INTRODUCCIÓN1.- INTRODUCCIÓN

1.1 CONCEPTO DE ENZIMA

1.2 CONCEPTO DE CATALIZADOR

1.3 NOMENCLATURA

1.4 CLASIFICACIÓN DE ENZIMAS

Los enzimas son proteínas que catalizan reacciones químicas en los seres vivos . Como catalizadores, los enzimas actúan en pequeña cantidad y se recuperan indefinidamente.

No llevan a cabo reacciones que sean energé-ticamente desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino que aceleran su consecución.

1.1 COCEPTO DE ENZIMA1.1 COCEPTO DE ENZIMA

Un catalizador es una sustancia que

acelera una reacción química, hasta hacerla instantánea o casi instantánea. Un catalizador acelera la reacción al disminuir la energía de activación.

1.2 CATALIZADOR1.2 CATALIZADOR

Los enzimas son catalizadores específicos.

En una reacción catalizada por un enzima:

1.La sustancia sobre la que actúa el enzima se llama sustrato

2. El sustrato se une a una región concreta del enzima, llamada centro activo

3. Se forman los productos y el enzima ya puede comenzar un nuevo ciclo de reacción

ASPECTOS GENERALES ASPECTOS GENERALES SOBRE LOS ENZIMASSOBRE LOS ENZIMAS

1.- El enzima y su sustrato

2.- Unión al centro activo

3.- Formación de productos

REACCIÓN CATALIZADAREACCIÓN CATALIZADA

1.3 NOMENCLATURA1.3 NOMENCLATURA

Hay varias formas mediante las cuales se asigna un nombre a un enzima:

•nombres particulares

•nombre sistemático

•código de la comisión enzimática (enzyme comission)

1.4 CLASIFICACIÓN DE LOS 1.4 CLASIFICACIÓN DE LOS ENZIMASENZIMAS

En función de su acción catalítica específica, dintiguimos 6 grandes grupos o clases:

•Clase 1: OXIDORREDUCTASAS

•Clase 2: TRANSFERASAS

•Clase 3: HIDROLASAS

•Clase 4: LIASAS

•Clase 5: ISOMERASAS

• Clase 6: LIGASAS

Clase 1: OXIDORREDUCTASASClase 1: OXIDORREDUCTASAS

Catalizan reacciones de oxidorreducción, es decir, transferencia de hidrógeno (H) o

electrones (e-) de un sustrato a otro, según la reacción general:

AH2 + B A + BH2

Ared + Box Aox + Bred

Ejemplos son la succinato deshidrogenasa o la citocromo c oxidasa.

Esquema de oxidorreductasasEsquema de oxidorreductasas

Clase 2: TRANSFERASASClase 2: TRANSFERASAS

Catalizan la transferencia de un grupo químico (distinto del hidrógeno) de un sustrato a otro, según la reacción:

A-B + C A + C-B

Un ejemplo es la glucoquinasa, que cataliza la reacción siguiente:

glucosa + ATP ADP + glucosa-6-fosfato

Ejemplo de la glucoquinasaEjemplo de la glucoquinasa

Clase 3: HIDROLASASClase 3: HIDROLASAS

Catalizan las reacciones de hidrólisis:

A-B + H2O AH + B-OH

Un ejemplo es la lactasa, que cataliza la reacción:

lactosa + agua glucosa + galactosa

Clase 4: LIASASClase 4: LIASAS

Catalizan reacciones de ruptura o soldadura de sustratos:

A-B A + B

Un ejemplo es la acetacetato descarboxilasa, que cataliza la reacción:

ácido acetacético CO2 + acetona

Clase 5: ISOMERASASClase 5: ISOMERASAS

Catalizan la interconversión de isómeros:

A B

Un ejemplo, la fosfotriosa isomerasa que cataliza las reacción representada:

gliceraldehído-3-fosfato dihidroxiacetona-fosfato

RepresentaciónRepresentación

Clase 6: LIGASASClase 6: LIGASAS

Catalizan la unión de dos sustratos con hidrólisis simultánea de un nucleótido trifosfato (ATP, GTP, etc.):

A + B + XTP A-B + XDP + Pi

Un ejemplo es la piruvato carboxilasa

2.- PRODUCCIÓN DE ENZIMAS2.- PRODUCCIÓN DE ENZIMAS

2.0 Uso de enzimas2.0 Uso de enzimas

2.1 Características de la acción 2.1 Características de la acción enzimáticaenzimática

2.2 Factores que influyen en las 2.2 Factores que influyen en las reacciones enzimáticasreacciones enzimáticas

2.0 USO DE ENZIMAS2.0 USO DE ENZIMAS

La aplicación de la catálisis enzimática es un negocio de grandes proporciones.

Los enzimas se utilizan en cuatro campos bien diferenciados:

como agentes terapéuticos,

como herramienta para la manipulación de materiales biológicos,

como reactivos analíticos

y como catalizadores industriales.

2.1 CARACTERÍSTICAS DE LA 2.1 CARACTERÍSTICAS DE LA ACCIÓN ENZIMÁTICAACCIÓN ENZIMÁTICA

La acción enzimática se caracteriza por la formación de un complejo que representa el estado de transición del sustrato al producto.

E + S ES E + P El sustrato se une al enzima a través de numerosas interacciones débiles como son: puentes de hidrógeno, electrostáticas, hidrófobas, etc, en un lugar específico , el centro activo.

Animación sobre la acción Animación sobre la acción enzimáticaenzimática

Algunas enzimas actúan con la ayuda de estructuras no proteícas. En función de su naturaleza se denominan:

1.Cofactor. Cuando se trata de iones o moléculas inorgánicas.

2.Coenzima. Cuando es una molécula orgánica. Se puede señalar, que muchas vitaminas funcionan como coenzimas.

Continuación...Continuación...

COFACTOR

COENZIMA

2.2 FACTORES QUE INFLUYEN 2.2 FACTORES QUE INFLUYEN EN REACCIONES ENZIMATICASEN REACCIONES ENZIMATICAS

2.2.1 Cambios en el pH

2.2.2 Cambios en la temperatura

2.2.3 Presencia de cofactores

2.2.4 Las concentraciones del sustrato y de los productos finales

2.2.5 Activación / Presencia de Inhibidores

Continuación....Continuación....

2.2.1 2.2.1 EFECTO DEL pH EFECTO DEL pH SOBRE LA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICAACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. Este es el llamado pH óptimo.

Representación del efecto del Representación del efecto del pHpH

La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. Así, la pepsina gástrica tiene un pH óptimo de 2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10.

Ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína, los seres vivos han desarrollado sistemas más o menos complejos para mantener estable el pH intracelular: Los amortiguadores fisiológicos


Grafica del pH con la actividad Grafica del pH con la actividad enzimáticaenzimática

2.2.2 EFECTO DE LA 2.2.2 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA TEMPERATURA SOBRE LA

ACTIVIDAD ENZIMÁTICAACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Los aumentos de temperatura por lo general aceleran las reacciones químicas. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley, solo que al ser proteínas a partir de cierta temperatura se empiezan a desnaturalizar.

La temperatura óptima de una enzima es aquella en la que la velocidad enzimática es máxima.

Representación gráfica de la Representación gráfica de la temperatura frente a la actividad temperatura frente a la actividad

enzimáticaenzimática

2.2.3 2.2.3 EFECTO DE LOS EFECTO DE LOS COFACTORES SOBRE LA COFACTORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICAACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Los cofactores son sustancias no proteícas que colaboran en la catálisis con la enzima para realizar su función.

Los cofactores pueden ser:

Iones inorgánicos: Fe++, Mg++, Mn++, Zn+

+ ,etc...

Las coenzimas son compuestos organicos que se sintetizan a partir de vitaminas.

Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente al enzima se llaman grupos prostéticos.

2.2.4 2.2.4 EFECTO DE LAS EFECTO DE LAS CONCENTRACIONES SOBRE CONCENTRACIONES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICALA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

La velocidad de una reacción enzimática depende de la concentración de sustrato.

En la siguiente figura observamos la velocidad de una reacción enzimática a 6 concentraciones distintas de sustrato.

Representación concentración-tiempoRepresentación concentración-tiempo

Además, la presencia de los productos finales puede hacer que la reacción sea más lenta, o incluso invertir su sentido.


2.2.5 2.2.5 EFECTO DE LOS EFECTO DE LOS INHIBIDORES SOBRE LA INHIBIDORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICAACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Ciertas moléculas pueden inhibir la acción catalítica de un enzima: estos son los inhibidores. Estos inhibidores bien pueden ocupar temporalmente el centro activo por semejanza estructural con el sustrato original (inhibidor competitivo) o bien alteran la conformación espacial del enzima, impidiendo su unión al sustrato (inhibidor no competitivo)

Inhibidor competitivo

Inhibidor no competitivo

La consideración dominante en el contexto del procesado industrial es la del cost0.

De poco sirve dar con un enzima que es teóricamente mejor, si su costo es prohibitivo.

Hay que tener en cuenta el costo tanto por unidad de conversión como en porcentaje respecto al costo total del procesado.

DISPONIBILIDADDISPONIBILIDAD

La abundante disponibilidad del enzima y, por lo tanto, de su fuente, es de importancia fundamental.

No sólo debe el enzima ser fácilmente disponible, sino que tanto él como su fuente han de ser aceptables desde el punto de vista de la inocuidad. Esto es de vital importancia cuando se vayan a destinar al procesado de alimentos o puedan entrar en contacto con las personas.

Etc...Etc...

Especificidad: Si el enzima que se desea ha de ser usado en un proceso en el q el se requiera alto grado de especificidad, esto puede ya inmediatamente determinar la elección de la fuente.

Estabilidad

...

3. EXTRACCIÓN DE ENZIMAS3. EXTRACCIÓN DE ENZIMAS

3. EXTRACCIÓN DE 3. EXTRACCIÓN DE ENZIMAS.ENZIMAS.

3.1. ETAPAS EN LA OBTENCIÓN DE 3.1. ETAPAS EN LA OBTENCIÓN DE ENZIMAS.ENZIMAS.

3.2. TIPOS DE ENZIMAS.3.2. TIPOS DE ENZIMAS. 3.3. MÉTODOS DE ROTURA.3.3. MÉTODOS DE ROTURA. 3.4. ELECCIÓN DEL MÉTODO DE 3.4. ELECCIÓN DEL MÉTODO DE

ROTURA.ROTURA.

3.1. ETAPAS EN LA OBTENCIÓN 3.1. ETAPAS EN LA OBTENCIÓN DE ENZIMAS INDUSTRIALESDE ENZIMAS INDUSTRIALES

Selección de la fuente de enzimas.Selección de la fuente de enzimas. Rotura celular (enzimas intracelulares)Rotura celular (enzimas intracelulares) Eliminación de los restos celulares Eliminación de los restos celulares

(enzimas intracelulares)(enzimas intracelulares) Concentración y enriquecimientoConcentración y enriquecimiento Purificación con alta resolución Purificación con alta resolución

(dependiendo de su uso final)(dependiendo de su uso final) Concentración y terminadoConcentración y terminado

3.2.TIPOS DE ENZIMAS.3.2.TIPOS DE ENZIMAS.

ENZIMAS INTRACELULARES:ENZIMAS INTRACELULARES:• Glucosa isomerasa, glucosa oxidasa, penicilin acetilasa, Glucosa isomerasa, glucosa oxidasa, penicilin acetilasa,

asparraginasaasparraginasa

ENZIMAS EXTRACELULARES:ENZIMAS EXTRACELULARES:• Dado que la molécula es segregada fuera de la célula, Dado que la molécula es segregada fuera de la célula,

no se requieren técnicas de ruptura celular no se requieren técnicas de ruptura celular • El número de proteínas que se segregan es limitado y El número de proteínas que se segregan es limitado y

por eso es relativamente fácil aislar una enzima por eso es relativamente fácil aislar una enzima concreta a partir de una mezcla concreta a partir de una mezcla

• Estructura más compacta y menos susceptibles a la Estructura más compacta y menos susceptibles a la desnaturalización que las correspondientes desnaturalización que las correspondientes intracelulares.intracelulares.

3.3 MÉTODOS DE ROTURA3.3 MÉTODOS DE ROTURA

1. 1. Métodos químicos de lisis celular:Métodos químicos de lisis celular:• ÁlcalisÁlcalis• Lisozima y EDTALisozima y EDTA• DetergentesDetergentes• Disolventes orgánicosDisolventes orgánicos• Choque osmótico Choque osmótico • Choque por enfriamientoChoque por enfriamiento

2. 2. Métodos físicos de lisis celularMétodos físicos de lisis celular::• SonicaciónSonicación• Cizalla líquidaCizalla líquida• Cizalla sólidaCizalla sólida• Congelación y descongelaciónCongelación y descongelación


1. Métodos químicos de lisis celular:1. Métodos químicos de lisis celular: ALCALIS:ALCALIS:

• La mayoría de las células se desintegran La mayoría de las células se desintegran a un ph entre 11.5 y 12.5.a un ph entre 11.5 y 12.5.

• El método más sencillo, barato y fácil de El método más sencillo, barato y fácil de aplicar a gran escala. (sólo para aislar al aplicar a gran escala. (sólo para aislar al asparaginasa).asparaginasa).

• INCONVENIENTE:INCONVENIENTE:El enzima deseado debe ser estable a El enzima deseado debe ser estable a

ph elevado durante 20-30 min.ph elevado durante 20-30 min.


LISOZIMA Y EDTA:LISOZIMA Y EDTA:

• Método delicado y específico .Método delicado y específico .• Sólo a pequeña escala. (Alto precio).Sólo a pequeña escala. (Alto precio).• Lisozima sólo eficaz par bacterias gram positivas.Lisozima sólo eficaz par bacterias gram positivas.

LISOZIMA•Clara de huevo.•Destruye pared bacteriana

EDTA•Lisar menbranas•(Efecto quelante de iones Ca)

Rompemos las células


DETERGENTES:DETERGENTES:• La mayor parte de las células pueden ser rotas por La mayor parte de las células pueden ser rotas por

un detergente a un ph, fuerza iónica y temperatura.un detergente a un ph, fuerza iónica y temperatura.• Tipos:Tipos:

• Iónicos.Iónicos.• No iónicosNo iónicos

• INCONVENIENTES:INCONVENIENTES:• Desnaturalización de las proteínas.Desnaturalización de las proteínas.• Complicado diseño y control de los procesos.(Efectos Complicado diseño y control de los procesos.(Efectos

medioambientales).medioambientales).• Uso poco frecuente (para extracción de enzimas Uso poco frecuente (para extracción de enzimas

ligadas a membranas)ligadas a membranas)

3.3.MÉTODOS DE ROTURA3.3.MÉTODOS DE ROTURA

DISOLVENTES ORGÁNICOS:DISOLVENTES ORGÁNICOS:• Método tradicional de ataque ( tolueno).Método tradicional de ataque ( tolueno).• No se usan a gran escala.No se usan a gran escala.• INCONVENIENTES:INCONVENIENTES:

PrecioPrecio ToxicidadToxicidad Desnaturalización de proteínasDesnaturalización de proteínas InflamabilidadInflamabilidad


CHOQUE OSMÓTICO:CHOQUE OSMÓTICO:• Suspender las células en agua destilada para Suspender las células en agua destilada para

liberar las proteínas deseadas.liberar las proteínas deseadas.• No a gran escala.No a gran escala.• INCONVENIENTES:INCONVENIENTES:

Muchos organismos resistentes al choque Muchos organismos resistentes al choque osmótico.( Sólo para organismos gram negativos)osmótico.( Sólo para organismos gram negativos)

Grandes volúmenes.( 400 l por 10Kg de pasta de Grandes volúmenes.( 400 l por 10Kg de pasta de células)células)

Alto número de pasos de centrifugación.Alto número de pasos de centrifugación. Necesidad de refrigeración.Necesidad de refrigeración.


2. Métodos físicos de lisis celular:2. Métodos físicos de lisis celular: SONICACIÓN:SONICACIÓN:

• Ultrasonidos para librar enzimas intracelulares.Ultrasonidos para librar enzimas intracelulares.• Poco usada a gran escala.Poco usada a gran escala.

• INCONVENIENTES:INCONVENIENTES: Elevado requerimiento de energía.Elevado requerimiento de energía. Dificultad para la transmisión de energía en grandes volúmenes.Dificultad para la transmisión de energía en grandes volúmenes. Problema de disipación de calor.Problema de disipación de calor.


ABRASIVOS:ABRASIVOS:• Uno de los métodos más usuales.Uno de los métodos más usuales.• Dispositivos:Dispositivos:

Laboratorio: batidora con bolas de Laboratorio: batidora con bolas de vidrio.vidrio.

Escala mayor: dispositivos en continuo.Escala mayor: dispositivos en continuo.(Dynomill)(Dynomill)

Dispositivo DynomillDispositivo Dynomill


CIZALLA LÍQUIDA:CIZALLA LÍQUIDA:• Hacer pasar suspensiones de células a alta Hacer pasar suspensiones de células a alta

presión a través de un presión a través de un pequeño orificiopequeño orificio que que comunica con una cámara a presión comunica con una cámara a presión atmosférica.atmosférica.

• Aumento la escala Disminuye la Aumento la escala Disminuye la diferencia de presión Menor grado de diferencia de presión Menor grado de ruptura .ruptura .

• Buen método para aplicar a microorganismos Buen método para aplicar a microorganismos menos robustos ( bacterias gram negativas)menos robustos ( bacterias gram negativas)


CIZALLA SÓLIDA:CIZALLA SÓLIDA:• Congelar una pasta de célulasCongelar una pasta de células ( por ( por

debajo de -20ºC) Se hace pasar a debajo de -20ºC) Se hace pasar a alta presión a través de un pequeño alta presión a través de un pequeño orifico.orifico.

• A pequeña escala y por tandas.A pequeña escala y por tandas.• Equipo para el tratamiento en continuo: Equipo para el tratamiento en continuo:

difícil manejo, costoso , para aislas difícil manejo, costoso , para aislas enzimas sensibles al calor.enzimas sensibles al calor.


CONGELACIÓN Y DESCONGELACIÓN:CONGELACIÓN Y DESCONGELACIÓN:• Efectos similares a los obtenidos por Efectos similares a los obtenidos por

choque por enfriamiento y osmótico.choque por enfriamiento y osmótico.• Efectos.Efectos.

Enfriamiento rápido y concentración del soluto Enfriamiento rápido y concentración del soluto intra y extracelular.intra y extracelular.

Formación de cristales de hieloFormación de cristales de hielo intra y intra y extracelulares que producen daños en la s extracelulares que producen daños en la s células.células.

Pérdida de la actividad enzimática.Pérdida de la actividad enzimática.

3.4 ELECCIÓN DEL MÉTODO 3.4 ELECCIÓN DEL MÉTODO DE ROTURADE ROTURA

Naturaleza de la fuente de la enzima.Naturaleza de la fuente de la enzima. Escala de la operación.Escala de la operación. Velocidad del método de extracción.Velocidad del método de extracción. Estabilidad del enzima.Estabilidad del enzima. Pureza que se necesite.Pureza que se necesite. COSTE del procesoCOSTE del proceso

4. PURIFICACIÓN DE 4. PURIFICACIÓN DE ENZIMAS.ENZIMAS.

4. PURIFICACIÓN DE ENZIMAS4. PURIFICACIÓN DE ENZIMAS

4.1. PROCESOS.4.1. PROCESOS. 4.2.ELIMINACIÓN DE ÁCIDOS 4.2.ELIMINACIÓN DE ÁCIDOS

NUCLÉICOS.NUCLÉICOS. 4.3.ELIMINACIÓN DE PARTÍCULAS 4.3.ELIMINACIÓN DE PARTÍCULAS

SÓLIDAS.SÓLIDAS. 4.4.PURIFICACIÓN Y CONCENTRACIÓN.4.4.PURIFICACIÓN Y CONCENTRACIÓN. 4.5.CONCENTRACIÓN Y ENVASADOS.4.5.CONCENTRACIÓN Y ENVASADOS.

4.1 PROCESOS4.1 PROCESOS

CONCENTRACIÓN Y ENVASADO

PURIFICACIÓN FINAL

CONCENTRACIÓN

PURIFICACIÓN PRELIM INAR

ELIM INACIÓN DE RESTOS CELULARES

ELIM INACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

4.2 ELIMINACIÓN DE ÁCIDOS 4.2 ELIMINACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOSNUCLÉICOS

• Los métodos de extracción rompen la célula, Los métodos de extracción rompen la célula, liberando al medio los ácidos nucleicos.liberando al medio los ácidos nucleicos.

• Los ácidos nucléicos aumentan la viscosidad Los ácidos nucléicos aumentan la viscosidad de la solución.de la solución.

• SOLUCIÓN:SOLUCIÓN: Adición de policationes de alto peso molecular Adición de policationes de alto peso molecular

(caros, poco frecuente). Precipitación de (caros, poco frecuente). Precipitación de los ácidos.los ácidos.

Nucleasas (acorta los ácidos nucléicos) Nucleasas (acorta los ácidos nucléicos) Digestión enzimática.Digestión enzimática.

4.3 ELIMINACIÓN DE 4.3 ELIMINACIÓN DE PARTÍCULAS SÓLIDASPARTÍCULAS SÓLIDAS

• Restos: ácidos nucleicos precipitados, paredes Restos: ácidos nucleicos precipitados, paredes celulares, fragmentos de membranas, células celulares, fragmentos de membranas, células parcialmente rotas...parcialmente rotas...

• Métodos:Métodos: Centrifugación.(Eliminar material viscoso o gelatinoso)Centrifugación.(Eliminar material viscoso o gelatinoso) Filtración.( Grandes volúmenes de precipitados Filtración.( Grandes volúmenes de precipitados

floculados)floculados)

• Elección del método:Elección del método: Escala de usoEscala de uso Naturaleza de los sólidos presentes.Naturaleza de los sólidos presentes.

4.3 ELIMINACIÓN DE PARTÍCULAS 4.3 ELIMINACIÓN DE PARTÍCULAS SÓLIDASSÓLIDAS

TIPOS DE CENTRÍFUGAS:TIPOS DE CENTRÍFUGAS:

• Centrífugas discontinuas Centrífugas discontinuas • Centrífugas continuasCentrífugas continuas

De cestilloDe cestillo De tazaDe taza CilíndricaCilíndrica Sharples SuperSharples Super

Centrífuga Continua de CestilloCentrífuga Continua de Cestillo

Centrífuga Continua de TazaCentrífuga Continua de Taza

Centrífuga Continua CilíndricaCentrífuga Continua Cilíndrica

Centrífuga ContinuaCentrífuga Continua “Sharples Super” “Sharples Super”

4.4 PURIFICACIÓN Y 4.4 PURIFICACIÓN Y CONCENTRACIÓNCONCENTRACIÓN

• Eliminación de los contaminantes no Eliminación de los contaminantes no deseados, moléculas pequeñas , orgánicas deseados, moléculas pequeñas , orgánicas e inorgánicas, otras proteínas y la mayor e inorgánicas, otras proteínas y la mayor parte del agua, si no toda.parte del agua, si no toda.

• Métodos:Métodos: Precipitación.Precipitación. Adsorción.Adsorción. Separación en dos fases líquidas.Separación en dos fases líquidas. Cromatrografía en columnaCromatrografía en columna


1. Precipitación.1. Precipitación. Para la Para la purificación inicial.purificación inicial. Tipos:Tipos:

• Negativo Negativo (precipito la impureza).(precipito la impureza).• PositivaPositiva( precipito el enzima, también concentro).( precipito el enzima, también concentro).

Muy usadoMuy usado ( simple y barato, consigo altos ( simple y barato, consigo altos grados de purificación y concentración).grados de purificación y concentración).

Inconvenientes: Realizarlos Inconvenientes: Realizarlos por tandaspor tandas, difícil de , difícil de integrar en procesos continuos.integrar en procesos continuos.

Sustancias:Sustancias:• Sulfato amónico, sulfato sódico, disolventes orgánicosSulfato amónico, sulfato sódico, disolventes orgánicos..


2. Adsorción.2. Adsorción.• Muy usada la adsorción sobre materiales Muy usada la adsorción sobre materiales

insolubles, insolubles, por tandas.por tandas. Se añaden al extracto los adsorbentes , se Se añaden al extracto los adsorbentes , se

remueve.remueve. Se sedimenta en una centrífuga basculanteSe sedimenta en una centrífuga basculante Se resuspende el adsorbente.Se resuspende el adsorbente. Se centrifuga de nuevo.Se centrifuga de nuevo.

• Tres tipos de materialesTres tipos de materiales: resinas, dextranos : resinas, dextranos sustituidos o agarosa y celulosas sustituidos o agarosa y celulosas sustituidas.sustituidas.


3. Separación en dos fases líquidas.3. Separación en dos fases líquidas.• Método actual.Método actual.• Proteína + dos polímeros inmiscibles = Proteína + dos polímeros inmiscibles =

Fases distintasFases distintas• Ventajas :Ventajas :

Separación Separación de proteínas por un lado y de proteínas por un lado y paredes celulares y residuos semisolubles por paredes celulares y residuos semisolubles por otrootro

Posibilidad de funcionar Posibilidad de funcionar en continuoen continuo


4. Cromatografía en columna:4. Cromatografía en columna:• Para las fases finales del procesado Para las fases finales del procesado

( poco volumen a tratar).( poco volumen a tratar).• Tipos:Tipos:

Filtración en geles.Filtración en geles. Intercambio iónico.Intercambio iónico. Cromatografía de afinidad.Cromatografía de afinidad.

CromatografíaCromatografía

Puede emplearse en Puede emplearse en cualquier cualquier etapa,etapa, aunque normalmente no aunque normalmente no es recomendable en las primeras es recomendable en las primeras fasesfases

La resolución puede ser elevada. La resolución puede ser elevada. Capacidad puede ser alta o baja, Capacidad puede ser alta o baja, dependiendo del ligando y no limitada por dependiendo del ligando y no limitada por el volumen de la muestra. Velocidad alta.el volumen de la muestra. Velocidad alta.

AfinidadAfinidadAfinidad Afinidad biológicabiológica

Puede ser utilizada en Puede ser utilizada en cualquier cualquier fasefase, pero es mejor aplicarla , pero es mejor aplicarla cuando la fuerza iónica es alta tras cuando la fuerza iónica es alta tras la precipitación con sales o la precipitación con sales o después de un inter-cambio iónicodespués de un inter-cambio iónico

Resolución buenaResolución buenaCapacidad muy alta y no limitada Capacidad muy alta y no limitada por el volumen de muestra. por el volumen de muestra. Velocidad altaVelocidad alta

Interacción Interacción hidrofóbicahidrofóbica

PolaridadPolaridad

Es más efectiva en las Es más efectiva en las primeras primeras fases del fraccionamientofases del fraccionamiento cuando se van a manipular cuando se van a manipular grandes volúmenes.grandes volúmenes.

Es mejor usarla en una Es mejor usarla en una purificaciónpurificación posteriorposterior, ya que las , ya que las matrices son caras.matrices son caras.

La resolución puede ser alta. La resolución puede ser alta. Capacidad alta no limitada por el Capacidad alta no limitada por el volumen de la muestra.volumen de la muestra.La velocidad puede ser muy elevada La velocidad puede ser muy elevada dependiendo de la matriz.dependiendo de la matriz.

La resolución puede ser alta. La La resolución puede ser alta. La capacidad puede ser alta. La capacidad puede ser alta. La velocidad puede ser altavelocidad puede ser alta

Intercambio Intercambio iónicoiónico

CromatoenfoquCromatoenfoqu

CargaCarga

El fraccionamiento es mejor en las El fraccionamiento es mejor en las últimas etapas de la purificación.últimas etapas de la purificación.En cualquier momento se pueden En cualquier momento se pueden usar tampones intercambiadores y usar tampones intercambiadores y podrá existir una limitación podrá existir una limitación respecto al volumen de muestrarespecto al volumen de muestra

Resolución moderada para el Resolución moderada para el fraccionamiento y buena para fraccionamiento y buena para tampones intercambiadores.tampones intercambiadores.Capacidad limitada por el volumen Capacidad limitada por el volumen de la muestrade la muestra

Filtración Filtración en gelen gel

TamañoTamaño

APLICACIÓNAPLICACIÓNCARACTERÍSTICASCARACTERÍSTICASTipo de Tipo de cromatografíacromatografía

Característica Característica molecularmolecular

aprovechadaaprovechada


5.Electroforesis en continuo.5.Electroforesis en continuo.• Aplicación de un potencial eléctrico a Aplicación de un potencial eléctrico a

través de un caudal continuo de través de un caudal continuo de solución de proteínas.solución de proteínas.

• Técnica en desarrollo (caros).Técnica en desarrollo (caros).• En la actualidad para el fraccionamiento En la actualidad para el fraccionamiento

de las proteínas de sangre.de las proteínas de sangre.


6. Ultrafiltración y diálisis.6. Ultrafiltración y diálisis.• Aplicación de membranas Aplicación de membranas

semipermeables.semipermeables.• Para las últimas fases del proceso : Para las últimas fases del proceso :

Eliminación de sales y concentración.Eliminación de sales y concentración. Separación por tamaños.Separación por tamaños.

• Filtros: ultrafiltros de fibra hueca o de Filtros: ultrafiltros de fibra hueca o de lecho plano.( bajo coste y facilidad para lecho plano.( bajo coste y facilidad para mantener la esterilidad)mantener la esterilidad)

4.5 CONCENTRACIÓN Y 4.5 CONCENTRACIÓN Y ENVASADOENVASADO

• Grado de concentración final Grado de concentración final

• CaracterísticasCaracterísticas

• Presentación de un enzimaPresentación de un enzima

• Transporte de enzimas a grandes Transporte de enzimas a grandes

distancias.distancias.

5. OPTIMIZACIÓN5. OPTIMIZACIÓN

5. OPTIMIZACIÓN5. OPTIMIZACIÓN

Tenemos el Tenemos el enzima aislado y enzima aislado y purificadopurificado Aplicaciones prácticas.Aplicaciones prácticas.

Optimización de la acción catalítica:Optimización de la acción catalítica: Selección. (material de partida más idóneo)Selección. (material de partida más idóneo) Medio de reacción.Medio de reacción. Modificación química.Modificación química. Ingeniería enzimática.Ingeniería enzimática. InmovilizaciónInmovilización

INMOVILIZACIÓNINMOVILIZACIÓN

Proceso en el que se Proceso en el que se confina o localizaconfina o localiza a la enzima en una a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a región definida del espacio, para dar lugar a formas formas insolublesinsolubles que que retienen su actividad catalíticaretienen su actividad catalítica y que y que pueden pueden ser reutilizadas repetidamente .ser reutilizadas repetidamente .

El material que inmoviliza la enzimaEl material que inmoviliza la enzima(matriz de (matriz de polímero):geles de celulosa,nylon, vidrio,limaduras de polímero):geles de celulosa,nylon, vidrio,limaduras de hierrohierro

Uniones entre catalizador y matriz de polímero:Uniones entre catalizador y matriz de polímero: Unión química o física.Unión química o física.


VENTAJAS:VENTAJAS:• 1. El aumento de la 1. El aumento de la estabilidad de la estabilidad de la

enzimaenzima;;• 2. La posible 2. La posible reutilización del derivadoreutilización del derivado, ,

por lo que disminuyen los costes del por lo que disminuyen los costes del proceso.proceso.

• 3. La posibilidad de diseñar un reactor 3. La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y controlenzimático de fácil manejo y control, , adaptado a la aplicación de la enzima adaptado a la aplicación de la enzima inmovilizada. inmovilizada.


INCONVENIENTES:INCONVENIENTES:• 1. La 1. La alteración de la conformaciónalteración de la conformación de la de la

enzima.enzima.• 2. La 2. La gran heterogeneidadgran heterogeneidad del sistema del sistema

enzima-soporte .enzima-soporte .• 3. 3. Pérdida de actividad de la enzimaPérdida de actividad de la enzima

durante la movilización.durante la movilización.• 4. El biocatalizador es más caro que la 4. El biocatalizador es más caro que la

enzima nativa.enzima nativa.

6.1 Aplicaciones en la 6.1 Aplicaciones en la Industria AlimentariaIndustria Alimentaria

Enzimas en la Industria Enzimas en la Industria AlimentariaAlimentaria

Son muy antiguas sus aplicacionesSon muy antiguas sus aplicaciones Se usaron enzimas de un modo Se usaron enzimas de un modo

inconsciente hasta finales del siglo XIX en inconsciente hasta finales del siglo XIX en que se descubrieron los artífices de las que se descubrieron los artífices de las reaccionesreacciones

Es un gran activo económico, y la Es un gran activo económico, y la investigación va encaminada a la investigación va encaminada a la purificación y la obtención de enzimas purificación y la obtención de enzimas concretos para funciones concretasconcretos para funciones concretas

Industrias LácteasIndustrias LácteasFabricación del QuesoFabricación del Queso

Es una de las mas antiguas aplicaciones Es una de las mas antiguas aplicaciones enzimáticas en la industria alimentariaenzimáticas en la industria alimentaria

Para la producción de queso se usaban Para la producción de queso se usaban cuajos, estómagos enteros de vacas y cuajos, estómagos enteros de vacas y otros rumiantesotros rumiantes

En otras culturas, el queso se conseguía En otras culturas, el queso se conseguía con vegetales como la papaya, que con vegetales como la papaya, que contienen otra clase de enzimascontienen otra clase de enzimas


La operación mas importante es la La operación mas importante es la coagulación de la caseinacoagulación de la caseina

Para ello utilizamos una serie de enzimas Para ello utilizamos una serie de enzimas que podemos encontrar en vegetales o que podemos encontrar en vegetales o animalesanimales

La pepsina y la quimosina son las enzimas La pepsina y la quimosina son las enzimas mas importantes en estomas importantes en esto

Se encuentran en el cuajo de varios Se encuentran en el cuajo de varios animales, entre ellos los rumiantesanimales, entre ellos los rumiantes


Otras enzimas como papaina o Otras enzimas como papaina o renninarennina

Estos producen coágulos elásticosEstos producen coágulos elásticos La utilización de unas u otras La utilización de unas u otras

enzimas repercute activamente en el enzimas repercute activamente en el sabor y en la naturaleza del quesosabor y en la naturaleza del queso

Industrias LácteasIndustrias Lácteas La lactasa es el La lactasa es el

enzima que consigue enzima que consigue romper la lactosa, que romper la lactosa, que es el azúcar que es el azúcar que contiene la lechecontiene la leche

Mucha gente es Mucha gente es intolerante a la lactosaintolerante a la lactosa

Existen en el mercado Existen en el mercado leches que vienen con leches que vienen con lactasalactasa

Industria PanaderaIndustria Panadera

La mas comúnmente utilizada es la La mas comúnmente utilizada es la lipoxidasa, que conjuntamente con el lipoxidasa, que conjuntamente con el blanqueante, le da a la masa un blanqueante, le da a la masa un carácter mas manejablecarácter mas manejable

Esta contenida en la harina de soja y Esta contenida en la harina de soja y de otras leguminosasde otras leguminosas


Para aumentar la acción de la Para aumentar la acción de la levadura se añade amilasa, en forma levadura se añade amilasa, en forma de harina de maltade harina de malta

Se usan para ello también algunos Se usan para ello también algunos mohos que contienen la enzimamohos que contienen la enzima

La harina de malta, tiene un La harina de malta, tiene un inconveniente, y es que cambia el inconveniente, y es que cambia el color del pancolor del pan


La proteasa rompe el gluten, una La proteasa rompe el gluten, una proteína contenida en algunos proteína contenida en algunos cerealescereales

La rotura del gluten conlleva una La rotura del gluten conlleva una mayor plasticidad de la masamayor plasticidad de la masa

Es un aditivo importante en la Es un aditivo importante en la fabricación de bizcochosfabricación de bizcochos

Industria CerveceraIndustria Cervecera

La papaina se usa para romper La papaina se usa para romper algunas proteínas de la cerveza para algunas proteínas de la cerveza para evitar que se enturbie cuando se evitar que se enturbie cuando se almacena o se refrigeraalmacena o se refrigera

Se pueden conseguir estos enzimas y Se pueden conseguir estos enzimas y otros parecidos, de similares otros parecidos, de similares funciones de algunas frutas funciones de algunas frutas tropicales como la piñatropicales como la piña

Industria CerveceraIndustria Cervecera

El proceso fundamental es la rotura del El proceso fundamental es la rotura del almidónalmidón

Los azucares simples formados son Los azucares simples formados son fermentados por las levadurasfermentados por las levaduras

Esto se lleva a cabo con las amilasas, Esto se lleva a cabo con las amilasas, provenientes de la maltaprovenientes de la malta

A veces se añaden otros almidones como A veces se añaden otros almidones como de arroz o patata para aprovechar al de arroz o patata para aprovechar al máximo la actividad de las enzimasmáximo la actividad de las enzimas

Fabricación de ZumoFabricación de Zumo

Las peptinas provocan que los zumos Las peptinas provocan que los zumos sean demasiado viscosos y turbios.sean demasiado viscosos y turbios.

Esto se elimina con enzimas, Esto se elimina con enzimas, amilasas, contenidos en el propio amilasas, contenidos en el propio zumo o que se pueden añadirzumo o que se pueden añadir

En el proceso, como subproducto En el proceso, como subproducto tenemos metanol, que aparece en tenemos metanol, que aparece en muy baja concentraciónmuy baja concentración

Obtención de Glucosa y Fructosa a Obtención de Glucosa y Fructosa a a partir de Maíza partir de Maíz

Con la harina del maíz, ayudados por las Con la harina del maíz, ayudados por las enzimas alfa-amilasas y amiloglucosidasas enzimas alfa-amilasas y amiloglucosidasas conseguiremos jarabes de gran calidadconseguiremos jarabes de gran calidad

Antes se conseguía por la hidrólisis del Antes se conseguía por la hidrólisis del almidón por parte de un ácidoalmidón por parte de un ácido

Posteriormente, la glucosa se puede Posteriormente, la glucosa se puede transformar a fructosa (mas dulce) por la transformar a fructosa (mas dulce) por la acción de la glucosa-somerasa acción de la glucosa-somerasa

Obtención de Glucosa y Fructosa a Obtención de Glucosa y Fructosa a a partir de Maíza partir de Maíz

Estos jarabes se usan como Estos jarabes se usan como edulcorantes en bebidas refrescantesedulcorantes en bebidas refrescantes

Se han conseguido producir a un Se han conseguido producir a un precio muy competitivoprecio muy competitivo

La UE ha pasado a proteger a la La UE ha pasado a proteger a la industria azucarera convencional industria azucarera convencional (remolacha y caña) para evitar su (remolacha y caña) para evitar su hundimiento por esta nueva forma hundimiento por esta nueva forma de conseguir azucaresde conseguir azucares

Refinado de AzúcarRefinado de Azúcar

La rafinosa puede complicar la La rafinosa puede complicar la extracción de la sacarosaextracción de la sacarosa

El enzima raffinosutilizer, producido El enzima raffinosutilizer, producido por el hongo morteirella vinaceae se por el hongo morteirella vinaceae se encarga de degradar la rafinosa, encarga de degradar la rafinosa, facilitando la cristalización y facilitando la cristalización y produciendo además sacarosaproduciendo además sacarosa

Más Aplicaciones AlimentariasMás Aplicaciones Alimentarias

En productos derivados del huevo, se En productos derivados del huevo, se añade glucosa-oxidasa y catalasa para añade glucosa-oxidasa y catalasa para evitar que se oscurezcanevitar que se oscurezcan

Bromelaína y papaína se usan para Bromelaína y papaína se usan para ablandar la carne, ya que rompen ablandar la carne, ya que rompen proteínasproteínas

La lactoperóxidasa ayuda a conservar La lactoperóxidasa ayuda a conservar productos lácteosproductos lácteos

6.2 Otras 6.2 Otras Aplicaciones no Aplicaciones no

AlimentariasAlimentarias

Otras AplicacionesOtras AplicacionesNo Alimentarias:No Alimentarias:

DetergentesDetergentes

Estos llevan enzimas que ayudan a Estos llevan enzimas que ayudan a limpiarlimpiar

Las proteasas facilitan la eliminación Las proteasas facilitan la eliminación de manchas de origen proteicode manchas de origen proteico

Las lipasas eliminan las manchas de Las lipasas eliminan las manchas de grasa y otros compuestos orgánicosgrasa y otros compuestos orgánicos

Estos detergentes que llevan enzimas Estos detergentes que llevan enzimas se denominan detergentes biológicosse denominan detergentes biológicos


Tratamiento de Residuos ITratamiento de Residuos I

El principal objetivo es reducir El principal objetivo es reducir materiales poliméricos que puedan materiales poliméricos que puedan suponer un peligro medioambiental o suponer un peligro medioambiental o un estorbo en determinados un estorbo en determinados procesos industrialesprocesos industriales

Existen enzimas que hidrolizan Existen enzimas que hidrolizan materiales poliméricos para su materiales poliméricos para su posterior degradación microbiológicaposterior degradación microbiológica


Tratamiento de Residuos IITratamiento de Residuos II

Las proteinasas y amilasas son Las proteinasas y amilasas son degradantes de polímeros grasos degradantes de polímeros grasos muy complejosmuy complejos

Limpian tuberías de plantas Limpian tuberías de plantas dedicadas a diferentes procesosdedicadas a diferentes procesos

Forman parte de los detergentes Forman parte de los detergentes comercialescomerciales


Tratamiento de Residuos IIITratamiento de Residuos III

Existen enzimas capaces de degradar Existen enzimas capaces de degradar elementos altamente tóxicoselementos altamente tóxicos

Por ejemplo, se usa la peroxidasa para Por ejemplo, se usa la peroxidasa para degradar productos como fenoles o degradar productos como fenoles o aminas aromáticasaminas aromáticas

Son de un gran interés medioambiental Son de un gran interés medioambiental en el tratamiento de aguas residualesen el tratamiento de aguas residuales


CurticiónCurtición Se lleva a cabo una acción Se lleva a cabo una acción

enzimática para que se produzca la enzimática para que se produzca la “hinchazón” de las pieles“hinchazón” de las pieles

La enzima protealitinasa es la La enzima protealitinasa es la encargada de llevar a cabo esta encargada de llevar a cabo esta funciónfunción

Esta actividad representa la segunda Esta actividad representa la segunda industria en uso de enzimas después industria en uso de enzimas después de la alimentaria de la alimentaria


Medicina y FarmaciaMedicina y Farmacia

El uso de enzimas en el sector El uso de enzimas en el sector médico y farmacéutico es médico y farmacéutico es potencialmente inmensapotencialmente inmensa

A pesar de ello, su utilización es A pesar de ello, su utilización es mínimamínima

Se usan en puntos en los que se Se usan en puntos en los que se tiene una seguridad absoluta de su tiene una seguridad absoluta de su aprovechamiento y de su eficaciaaprovechamiento y de su eficacia


Medicina y Farmacia IIMedicina y Farmacia II

Podemos dividir esa utilización en Podemos dividir esa utilización en tres campostres campos• Terapia enzimáticaTerapia enzimática• Uso analíticoUso analítico• Productos farmacéuticosProductos farmacéuticos

Para cada una de estas áreas Para cada una de estas áreas necesitamos enzimas muy necesitamos enzimas muy purificadas, para que no se purificadas, para que no se produzcan efectos secundariosproduzcan efectos secundarios

7. Problemas en la 7. Problemas en la Tecnología Tecnología EnzimáticaEnzimática

Problemas de la Tecnología Problemas de la Tecnología EnzimáticaEnzimática

A pesar de ser muy útiles, los enzimas que A pesar de ser muy útiles, los enzimas que requieren coenzimas se usan muy poco requieren coenzimas se usan muy poco porque son poco rentablesporque son poco rentables

La reutilización de estos coenzimas o su La reutilización de estos coenzimas o su reciclaje, sería una solución que abarataría reciclaje, sería una solución que abarataría costescostes

Son importantes por la importancia de las Son importantes por la importancia de las reacciones que catalizanreacciones que catalizan

Problemas de la Tecnología Problemas de la Tecnología EnzimáticaEnzimática

La utilización de enzimas en medios La utilización de enzimas en medios acuosos no siempre es muy efectivaacuosos no siempre es muy efectiva

La solubilidad toma un papel importante a La solubilidad toma un papel importante a la hora de producirse la reacciónla hora de producirse la reacción

La reacción en medios orgánicos, mas La reacción en medios orgánicos, mas solubles, puede verse adulterada o solubles, puede verse adulterada o modificada en su naturalezamodificada en su naturaleza

Se investiga con buenos resultados, la Se investiga con buenos resultados, la utilización de solventes orgánicosutilización de solventes orgánicos

8. El Futuro de la 8. El Futuro de la Tecnología Tecnología EnzimáticaEnzimática

Perspectivas de FuturoPerspectivas de Futuro

La tarea mas importante es la La tarea mas importante es la caracterización de todos lo enzimascaracterización de todos lo enzimas

La catalogación de todas las La catalogación de todas las reacciones que un enzima puede reacciones que un enzima puede catalizar es un reto de futurocatalizar es un reto de futuro

La prolongación de un enzima La prolongación de un enzima conocido a otra reacción es mas conocido a otra reacción es mas viable que la búsqueda de otro viable que la búsqueda de otro enzimaenzima


La tecnología enzimática se ha orientado La tecnología enzimática se ha orientado hacia la producción de energía.hacia la producción de energía.

Se investiga en poner a punto productores Se investiga en poner a punto productores de hidrógeno que actúan como células de de hidrógeno que actúan como células de combustiblecombustible

Es difícil que a corto o medio plazo estos Es difícil que a corto o medio plazo estos métodos se hagan económicamente métodos se hagan económicamente factiblesfactibles


Se buscan enzimas que catalicen Se buscan enzimas que catalicen reacciones que se encuentran en reacciones que se encuentran en medios poco apropiados para otros medios poco apropiados para otros enzimasenzimas

La investigación de enzimas que hagan La investigación de enzimas que hagan su función en solventes orgánicos es su función en solventes orgánicos es vital para conseguir a gran escala vital para conseguir a gran escala operaciones con sustratos poco solubles operaciones con sustratos poco solubles en aguaen agua


Hay grupos de enzimas que son objeto de Hay grupos de enzimas que son objeto de exhaustivos estudiosexhaustivos estudios

Son las oxigenasas y las oxidasasSon las oxigenasas y las oxidasas Catalizan reacciones novedosas como la Catalizan reacciones novedosas como la

epoxidación de alquenosepoxidación de alquenos El desarrollo de esta tecnología podría El desarrollo de esta tecnología podría

tener un impacto importantísimo en la tener un impacto importantísimo en la industria químicaindustria química

Tecnología Enzimática. INDICE 1. Introducción 2. Producción de Enzimas 3. Extracción de Enzimas...

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Transcript of Tecnología Enzimática. INDICE 1. Introducción 2. Producción de Enzimas 3. Extracción de Enzimas...